Validación microbiológica

4.862 visualizaciones

Publicado el

Validación de métodos microbiológicos
Descargado de:
http://www.controlmetrologico.com/docs/validacionmicrobiologica.pdf

Publicado en: Educación
0 comentarios
0 recomendaciones
Estadísticas
Notas
  • Sé el primero en comentar

  • Sé el primero en recomendar esto

Sin descargas
Visualizaciones
Visualizaciones totales
4.862
En SlideShare
0
De insertados
0
Número de insertados
2
Acciones
Compartido
0
Descargas
135
Comentarios
0
Recomendaciones
0
Insertados 0
No insertados

No hay notas en la diapositiva.

Validación microbiológica

  1. 1. Validación de los métodos microbiológicos PROTOCOLO DE VALIDACIÓN Norma ISO 17025 Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO
  2. 2. Objetivos a desarrollar Validación de métodos:Intentamos contestar las siguientespreguntas:•¿Qué es validar?•¿Por qué valido?•¿Para qué valido?•¿Cuándo valido?•¿Cómo valido?
  3. 3. ¿ Qué es en la práctica validar un método?Es realizar un conjunto de pruebas de manera de: Comprobar varios aspectos del comportamiento delmétodo. Establecer que sirve para el fin previsto.Todo esto debe serdocumentado y archivado.
  4. 4. El laboratorio acuerda con el cliente elmétodo a usar para realizar un ensayo.El laboratorio debe usar los métodos yprocedimientos más apropiados dentrode su alcance para todos los ensayos.
  5. 5. Características que se tienen en cuentapara seleccionar el método de ensayo:Propiedades analíticas: precisión, exactitud,especificidad, sensibilidad, el límite decuantificación y/o de detección, los efectosmatricialesFacilidad de uso o automatización.Rapidez de análisis o respuesta.Costo.Método normalizado
  6. 6. Definición de método alternativo:Es un método de análisis que demuestra o estima unanalito (un microorganismo, sus componentes o suproducto), para una categoría dada de productos, como lohace su correspondiente método de referencia.El método alternativo exhibe atributos apropiados a lasnecesidades de los usuarios, por ejemplo:•- la velocidad de análisis y/o respuesta;•- la facilidad de ejecución y/o automatización;•- las propiedades analíticas (la precisión, exactitud, ellímite de detección, etc.);•- la miniaturización;•- el reducción de costo.
  7. 7. ¿Qué métodos se validan?•LOS MÉTODOS NO NORMALIZADOS.•LOS MÉTODOS QUE DISEÑA O DESARROLLA ELLABORATORIO.•LOS MÉTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERADEL ALCANCE PREVISTO.Verifico USO MÉTODOS OFICIALES, MÉTODOSNORMALIZADOS O MÉTODOS DE ORGANISMOSNACIONALES O INTERNACIONALES RECONOCIDOS.
  8. 8. ES RECOMENDABLE LAUTILIZACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS O DE REFERENCIA,SIEMPRE Y CUANDO ÉSTOS ESTÉN DISPONIBLES Y SEAN APROPIADOS.
  9. 9. CUANDO HAY GRAN INFORMACIÓN SOBRE UNA METODOLOGÍA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR SON RELATIVAMENTE SENCILLOS,SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIÓN SERÁ EXTENSA.
  10. 10. VALIDACION PRIMARIAValidación: Confirmación, mediante el aporte depruebas objetivas, de que se han cumplidos losrequisitos para el uso pretendido o unaaplicación específica.[ISO 9000: 2000]Antes de realizar la validaciónse deben especificar: Alcance. Se deben declarar los CRITERIOS DEAPTITUD PARA LOS FINES.
  11. 11. MÉTODOS NO NORMALIZADOS:Cuando sea necesario utilizarlos deben servalidados adecuadamente antes del uso. Búsqueda de información sobre datos devalidación previa.Deben incluir una especificación clara de losrequisitos del cliente y del objeto del ensayo.
  12. 12. MÉTODOS DESARROLLADOS POR EL LABORATORIO:• Debe ser : Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO) Ser asignada a personal calificado Proveer los recursos necesarios.• Los planes deben ser actualizados a medida que avanza el desarrollo y deben asegurar que la comunicación sea eficaz entre todo el personal involucrado.• En este caso, el proceso de validación es mucho más arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido responde a lo esperado.
  13. 13. a)Una identificación apropiada de los métodos de ensayo. b) El alcance.(intervalo de concentración del analito)Para los métodos de c) La descripción del tipo de Ítem a ensayar.ensayo nuevos es d) Los parámetros o lasconveniente elaborar magnitudes; y los rangos a serprocedimientos antes determinados.de la realización de los e) Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicosensayos los que deben de funcionamiento.contener, como mínimo, f) Los patrones de referencia y losla información siguiente: materiales de referencia requeridos. g) Las condiciones ambientales requeridas y cualquier periodo de estabilización que sea necesario
  14. 14. Para losmétodos deensayo h) La descripción del procedimiento incluida lanuevos es siguiente información:conveniente -diagrama de flujoelaborar -marcas para identificación durante la manipulación,procedimientos el transporte, el almacenamiento y la preparación de los ítems.antes de la - las verificaciones a realizar antes de comenzar elrealización de trabajolos ensayos los - la verificación del correcto funcionamiento deque deben equipos y, cuando corresponda, su calibración y ajuste antes de cada uso;contener, - el método de registro de las observaciones y de loscomo mínimo, resultados;la información -las medidas de seguridad a ser observadas.siguiente i) Los criterios o requisitos para la aprobación o rechazo.(cont): j) Los datos a ser registrados y el método de análisis. k) La incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre.
  15. 15. LOS MÉTODOS NORMALIZADOSEMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO Métodos normalizados aplicados a matrices que no seespecifiquen en el procedimiento normalizado. Ampliaciones y modificaciones de los métodosnormalizados.Para demostrar que una versión modificada de un métodocumple las mismas especificaciones que el métodooriginal, deben realizarse comparaciones utilizandoreplicados.
  16. 16. Sistemas de ensayo comerciales (kits)Los laboratorios deben conservar los datos sobre lavalidación de los sistemas de ensayo comerciales (kits)que utilicen.Estos datos pueden obtenerse de ejercicios deintercomparación o de datos sobre validación remitidospor los fabricantes y sujetos a la evaluación de unatercera parte (p. ej., AOAC). wwwaoac.orgSi no se dispone de datos sobre validación o si éstos noson plenamente aplicables, el laboratorio seráresponsable de completar la validación del método.
  17. 17. VALIDACION SECUNDARIA (Verificación)Demostración por experimento que un métodoestablecido funciona de acuerdo con lasespecificaciones en las manos del usuario.Verificación: Confirmación, mediante el aporte de pruebasobjetivas, de que se han cumplido los requisitosestablecidos. [ISO 9000:2000]
  18. 18. MÉTODOS NORMALIZADOS: Antes de analizar cualquier muestra, los laboratoriosdeberán verificar su capacidad para cumplir de formasatisfactoria todos los requisitos establecidos endichos métodos.El laboratorio debe confirmar que puede operarcorrectamente los métodos normalizados antes deintroducir los ensayos. Se debe mantener actualizadas las normas. Si el método normalizado cambia, se debe repetir laconfirmación.
  19. 19. MÉTODOS NORMALIZADOS: Cuando sea necesario, la norma debe sercomplementada con detalles adicionales para aseguraruna aplicación coherente.Ejemplo: La metodología empleada para la leche UATincluye una incubación previa siete días a 37º C y luego serealiza el ensayo según FIL-IDF 100B:1991.Esto debe ser especificado cuando se hace referencia a lametodología en el informe de ensayo.
  20. 20. LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO DEBE:• REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO. (USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE CONTAMINADAS).• LA EXTENSIÓN DE LA VALIDACIÓN NECESARIA DEPENDERÁ DEL MÉTODO Y SU APLICACIÓN.• LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA ACTIVIDAD.• EN TODOS LOS CASOS UN PARÁMETRO PARA LA VALIDACIÓN DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS ES LA DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO.
  21. 21. Uso de muestras naturalmente contaminadas ypreparación de muestras artificialmente contaminadasen estudios de validaciónAnexo C prEN ISO 16140:1999• 1ra opción: Muestras naturalmente contaminadas• 2da opción: Contaminación por mezcla.• 3ra opción: Muestras inoculadas (el nivel de microflora debe representar la contaminación de las muestras naturalmente contaminadas).• 4ta opción: Materiales de referencia
  22. 22. Validar métodos microbiológicos requiere: Comparar con un MÉTODO DE REFERENCIA REFERENCIA. Usar cepas de referencia y cepas de referenciacertificadas.(Material de referencia). LA EVALUACIÓN SISTEMÁTICA DE FACTORES. Ensayos Interlaboratorios Interlaboratorios. La estimación de la incertidumbre.
  23. 23. El PROTOCOLO INCLUYE: Primera FASE: Estudios precolaborativos o FASE:validación interna (estudios comparativos): Defino la aplicabilidad (concierne al analito de interés y a las categorías de alimentos a las que se aplica el método). (TABLA: Clasificación de categorías de alimentos para estudios de validación Anexo A AOAC). Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos FASE: Cuando la exigencia es de disponer de métodos validados plenamente, se considera habitualmente que la validación plena de un método de análisis comprende un examen de las características del método en un estudio del funcionamiento del método entre laboratorios .
  24. 24. Clasificación detipos de muestras para estudios de validaciónAnexo B prEN ISO 16140:1999
  25. 25. Primera etapa de la validación Ensayos selectivos se usan cepas en estudios de ( VALIDACION INTERNA):INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismospertenecientes al grupo deben ser detectados porel método. SENSIBILIDADEXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos queno pertenecen al grupo no deben ser detectadospor el método. ESPECIFIDAD
  26. 26. Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO GCategorías de Grupos “Target”: Elección de microorganismos ¿qué cepas uso?a) Un grupo Ejemplo Coliformes, Aquellas que dan reacción típicalevaduras, bacterias acido-lácticas en el método de referencia.b) De la Familia Ejemplo Incluir miembros representativosEnterobacteriaceae de todos los género pertenecientes a la familiac) Género Ejemplo Salmonella spp Incluir miembros representativos si es posible de todas las especies pertenecientes al género.d) Especie Ejemplo Listeria Rango de cepas pertenecientes amonocytogenes la especiee) Cepa Ejemplo Listeria Rango de fuentes de esta cepamonocytogenes 1a
  27. 27. Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO GCategorías de Grupos Elección de microorganismos“no Target” : Target”a) Un grupo no target Aquellas que dan reacción negativa (según microorganismo target)b) De la Familia Incluir cepas no pertenecientes a la familia.c) Género Incluir cepas no pertenecientes al género similar a la cepa targetd) Especie Incluir cepas no pertenecientes a la especie, incluidas en el géneroe) Cepa Incluir cepas no target, incluidas en la especie.
  28. 28. Cepas paraensayos deselectividad:prEN ISO16140:1999ANEXO G
  29. 29. Validación método cualitativo Descripción detallada delmétodo de ensayo. LÍMITE DE DETECCIÓN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD DESVIACIÓN POSITIVA YDESVIACIÓN NEGATIVA EFECTO MATRICIAL Exactitud relativa repetibilidad yreproducibilidad
  30. 30. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos). Compara el método a validar con el método de referencia. Los realiza sólo el laboratorio organizador. 1.AMPLITUD MATRICES: Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categorías de alimentos a validar, analizar 20 o más alimentos de cada categoría. Obtención de muestras artificialmente contaminadas: Inoculo una sola cepa (de interés) por matriz. Según proceso al que se somete al alimento uso: -microoganismo estressado Alimentos procesados- -microoganismo sin estress Alimentos no procesados- -microoganismo liofilizado-productos en polvo.
  31. 31. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)Estudios precolaborativos o validación interna(estudio comparativos). NIVEL DE INOCULO: Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas. Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para obtener distintos niveles inóculo. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN POR NMP: el mismo día que se analizan las muestras. Número de ensayos por nivel de analito: 20
  32. 32. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)Estudios precolaborativos o validación interna(cont).2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebosólo la cepa.(cultivo puro)Pruebo 50 o más cepa target y 30 no target (método a validary método de referencia).
  33. 33. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: ¡IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian minuciosamente el protocolo de ensayo. Número de laboratorios:10 laboratorios (con datos válidos) por tipo de alimento. Los laboratorios participantes no conocen los valores de las muestras.(Muestras a ciegas) Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categorías de alimentos a validar.
  34. 34. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: PREPARACIÓN DE MUESTRAS: a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target. b) Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas) EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.
  35. 35. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN POR NMP: el mismo día que se analizan las muestras.(el laboratorio organizador) Número de ensayos por nivel de analito por cada tipo de alimento: 6 Número de ensayos por CONTROL NEGATIVO por cada tipo de alimento: 6
  36. 36. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ANALISIS DE LOS RESULTADOS: Aplicable a Estudios precolaborativos y ensayos colaborativos. A)ENSAYO PARA DETERMINAR DIFERENCIA SIGNIFICATIVA: La proporción de positivos confirmados del método evaluado no debe ser estadísticamente diferente a la proporción positiva confirmada por el método de referencia para cada tipo de alimento y cada nivel de inoculación TEST de Chi cuadrado.( para datos nominales)
  37. 37. Diseño de un estudio de validación método cualitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ANALISIS DE LOS RESULTADOS (cont): Aplicable a: Estudios precolaborativos ensayos colaborativos. B) INDICADORES DE APTITUD: Sensibilidad Especificidad FALSOS POSITIVOS para cada tipo de alimento y FALSOS NEGATIVOS cada nivel.
  38. 38. Validación método cuantitativo Descripción detallada del método de ensayo. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD EXACTITUD Desviación positiva y desviación negativa sensibilidad especificidad
  39. 39. Diseño de un estudio de validación método cuantitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)Estudios precolaborativos o validación interna (estudioscomparativos). Comparación del método a validar con el método dereferencia. Aplica lo visto anteriormente para métodos cualitativos.(tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividadsólo para ensayos selectivos) NIVEL DE INOCULO de las matrices:se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo(bajo, medio y alto) que abarquen todo el intervalo a validar.Y un control sin inocular.Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminadospara ensayos no selectivo (no realizo el control)
  40. 40. Diseño de un estudio de validación método cuantitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos). ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo sólo la cepa.(cultivo puro) Pruebo 30 o más cepa target y 20 no target.(método a validar y método de referencia) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Estimación de desviación aleatorias y sistemáticas del método. Número de laboratorios: 8 laboratorios (con datos válidos) por tipo de alimento.
  41. 41. Diseño de un estudio de validación método cuantitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS: a)Recuento de microorganismos específicos: inoculación del microorganismo específico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS b) NIVEL DE INOCULO de las matrices: se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo (bajo, medio y alto que abarquen todo el intervalo a bajo, alto) validar. Y un control sin inocular. Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el control) Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el método a validar y el método de referencia.
  42. 42. Diseño de un estudio de validación método cuantitativo :AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Se realizan test para eliminar los outliers. INDICADORES DE APTITUD: Análisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inóculo. Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inóculo. “RSD es la desviación estándar relativa. Es independiente del valor del analito”
  43. 43. INFORME DE VALIDACION El laboratorio debe registrar: RESULTADOS OBTENIDOS.Establecer el rango de validación (es la parte del intervalode concentración de un método de análisis que ha sidovalidado). PROCEDIMIENTOS USADOS. Declaración que el método es apropiado para el finprevisto. Toda la información referida a la validación debedocumentarse y archivarse.
  44. 44. Extensión de la validaciónLa extensión de la validación necesariadependerá del método y su aplicación.“La validación es siempre un equilibrio entrecostos, riesgos y posibilidades técnicas.”Cada laboratorio establecerá los requisitosque debe cumplir el método, con objeto dedemostrar que son adecuados para la finalidadestablecida.
  45. 45. Incluso cuando se haya realizado lavalidación, el laboratorio tendrá que :Verificar periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, utilizando, por ejemplo: muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más representativas.
  46. 46. ¡GRACIAS POR SU ATENCION!

×