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Hongos como biorremediadores
 Micorremediación
 Alcances
Rol y Potencial
Hongos de pudrición blanca
 Degradan y mineralizan lignina.
 Mecanismo: Enzimas extracelulares
de baja especificidad.
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Pleurotus ostreatus
Morfología
 Sistema enzimático (MnP y Lac)
 Ventajas
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• Crecimiento rápid...
Objetivos
• Objetivo general
Producir inóculo de Pleurotus ostreatus y cuantificar
su crecimiento para un posible uso en
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Justificación
Bajo costo
biorremediación
Amplio
espectro de
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HPB
Inocuidad y
capacidad
degradativa de
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MATERIALES Y MÉTODOS
Producción de inóculo
Medición de biomasa por microscopía
Medición del nivel de colonización en suelo
Producción de inóculo
Cultivo
P. ostreatus
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cebada
Cultivo grano
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Medición de Biomasa por Microscopía
Medición de Colonización del inóculo en
Suelo
Medición de
Biomasa por Microscopía
(Adapt. Gacura, M. 2009)Preparación dilución
1/25
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Medición de
colonización en suelo
Acondicionamiento del suelo
Contaminación del suelo con crudo
de petróleo 10 000 ppm
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RESULTADOS Y DISCUSIONES
Producción de biomasa del inóculo
primario
506.4
326
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secundario
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Crecimiento(m/g)
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Inóculo primario de trigo y cebada
3 semanas
TRIGO
CEBADA
506.4
326
968.8
494.4
1210.4
673.08
trigo cebada
Crecimiento(m/g)
805.04
929.6
866
1013.2
1060
1289.6
trigo cebada
Crecimi...
Referencia Longitud de hifa (m/g)
Feng, X., et. al. 2004 1064.0
Bosiljic, G. et al. 2008 374
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Colonización del suelo por inóculo
secundario de trigo
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Colonización del suelo por inóculo
secundario de cebada
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Colonización del suelo
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 Se logró producir inóculo del hongo P. ostreatus en granos de trigo y cebada,
alcanzando una colonización total de dicho...
 Se observó diferencias significativas en el diámetro de colonización entre los
distintos tratamientos probados en la col...
RECOMENDACIONES
 Producir inóculo primario usando granos de trigo para obtener mayor biomasa y luego
utilizar ésta para i...
 Blgo. Juan Juscamaita M. – Patrocinador - UNALM
PhD. Carl Johnston – Co- Patrocinador – YSU, Ohio
Ing. Jose Palacios
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Muchas g
MUCHAS GRACIAS
Caracterización Suelo
Ciclo de vida
Basidiomicetos
Factor Crecimiento del micelio Fructificación
Temperatura 24º a 30°C 15º a 18ºC
Luminosidad Oscuridad Luz indirecta (longi...
Vías metabólicas
de HAP en P. ostreatus
Formula conversión biomasa
cm hifa/ g grano = C cm hifa x B ml de agua
D ml agua A g grano
A= 1 g de grano
B = 25 ml agua
...
Profundidad:
0.1 mm2
Dilución 1/25
30 segundos
Tinción
10 campos de
visión por
repetición
Procesamiento
de datos
MEDICIÓN DE BIOMASA
Hongos de pudrición blanca
Phanaerochaete chrysosporium
Ganderma applanatum
Schizophillum communne
Trametes versicolorPycn...
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Producción de inóculo de Pleurotus ostreatus para uso en biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo

  1. 1. “Producción de inóculo de Pleurotus ostreatus para uso en biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo” Bach. Enith Sifuentes Vásquez UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Facultad de Ciencias
  2. 2. Hongos como biorremediadores  Micorremediación  Alcances Rol y Potencial
  3. 3. Hongos de pudrición blanca  Degradan y mineralizan lignina.  Mecanismo: Enzimas extracelulares de baja especificidad.  Sistema ligninolítico Lignina Peroxidasa (LiP) Manganeso Peroxidasa (MnP) Peroxidasa Versátil (VP) Lacasa
  4. 4. Pleurotus ostreatus Morfología  Sistema enzimático (MnP y Lac)  Ventajas • Bajo requerimiento de T° • Crecimiento rápido y fácil manejo • Menos afectado por organismos nativos. • Cultivo estandarizado.
  5. 5. Objetivos • Objetivo general Producir inóculo de Pleurotus ostreatus y cuantificar su crecimiento para un posible uso en biorremediación de suelos. • Objetivos específicos 1. Evaluar la producción de biomasa del hongo P. ostreatus en granos de trigo y cebada. 2. Medir la colonización del inóculo de P. ostreatus obtenido, en suelo contaminado con hidrocarburos.
  6. 6. Justificación Bajo costo biorremediación Amplio espectro de degradación HPB Inocuidad y capacidad degradativa de P. ostreatus Escasez de metodologías y estudios de caracterización
  7. 7. MATERIALES Y MÉTODOS Producción de inóculo Medición de biomasa por microscopía Medición del nivel de colonización en suelo
  8. 8. Producción de inóculo Cultivo P. ostreatus Inoculación de granos Esterilización granos trigo y cebada Cultivo grano inoculado Inóculo Primario 26°C 14 días PDA 22°C 4 semanas 121°C 15 lb 30 min. Inóculo Secundario
  9. 9. Medición de Biomasa por Microscopía Medición de Colonización del inóculo en Suelo
  10. 10. Medición de Biomasa por Microscopía (Adapt. Gacura, M. 2009)Preparación dilución 1/25 Tinción con azul de metileno Toma de muestra Observación al microscopio óptico con cámara de Neubauer Registro de imágenes con cámara fotográfica Medición de hifas mediante software UDR Transformación de datos (m/g) C1 Granos de trigo C2 Granos de cebada T1 Inóculo primario trigo T2 Inóculo primario cebada T3 Inóculo secundario trigo T4 Inóculo secundario cebada Inóculos trigo y cebada
  11. 11. Medición de colonización en suelo Acondicionamiento del suelo Contaminación del suelo con crudo de petróleo 10 000 ppm Preparación de tratamientos en placas Petri Medición de crecimiento de colonias c/4 días Incubación durante 16 días a 22° C C Suelo sin contaminar+ inóculo T1 Suelo contaminado + inóculo T2 Suelo contaminado + inóculo + soya 1% T3 Suelo contaminado + inóculo + aserrín 10%
  12. 12. RESULTADOS Y DISCUSIONES
  13. 13. Producción de biomasa del inóculo primario 506.4 326 968.8 494.4 1210.4 673.08 Crecimiento(m/g) Sem 2 Sem 3 Sem 4 Sem 2 Sem 3 Sem 4 TRIGO CEBADA
  14. 14. Producción de biomasa del inóculo secundario 805.04 929.6 866 1013.2 1060 1289.6 Crecimiento(m/g) Sem 2 Sem 3 Sem 4 Sem 2 Sem 3 Sem 4 TRIGO CEBADA
  15. 15. Inóculo primario de trigo y cebada 3 semanas TRIGO CEBADA
  16. 16. 506.4 326 968.8 494.4 1210.4 673.08 trigo cebada Crecimiento(m/g) 805.04 929.6 866 1013.2 1060 1289.6 trigo cebada Crecimiento(m/g) Inóculo primario Inóculo secundario
  17. 17. Referencia Longitud de hifa (m/g) Feng, X., et. al. 2004 1064.0 Bosiljic, G. et al. 2008 374 Gacura, M. 2009 114.48 Presente estudio 1289.6
  18. 18. Colonización del suelo por inóculo secundario de trigo 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 0 4 8 12 16 20 Diámetro(cm) Tiempo (Días) C: suelo sin contaminar T1: Suelo cont. sin suplem T2: Suelo cont. + aserrín T3: Suelo cont. + soya
  19. 19. Colonización del suelo por inóculo secundario de cebada 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 0 4 8 12 16 20 Diámetro(cm) Tiempo (Días) C: suelo sin contaminar T1: Suelo cont. sin suplem T2: Suelo cont. + aserrín T3: Suelo cont. + soya
  20. 20. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 C T1 T2 T3 Crecimiento(cm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 C T1 T2 T3 Crecimiento(cm) Colonización del suelo por inóculo secundario de trigo Colonización del suelo por inóculo secundario de cebada
  21. 21.  Se logró producir inóculo del hongo P. ostreatus en granos de trigo y cebada, alcanzando una colonización total de dichos sustratos en cuatro semanas de cultivo.  En los cultivos inoculados con micelio crecido en agar PDA (inóculo primario), la producción de biomasa fue mayor al utilizar trigo como sustrato (1210.40 m/g) en comparación con la cebada (673.08 m/g), siendo estas diferencias significativas en la tercera y cuarta semana. En los cultivos inoculados con grano (inoculo secundario), la producción de biomasa fue mayor al utilizar cebada como sustrato (1289.60 m/g) en comparación con el trigo (1060 m/g) sin observarse diferencias significativas a lo largo del ensayo.
  22. 22.  Se observó diferencias significativas en el diámetro de colonización entre los distintos tratamientos probados en la colonización del suelo, tanto con el inóculo de trigo como el de cebada; sin embargo, no se pudo determinar que tratamiento fue el mejor.  Pese a que la producción de biomasa de P. ostreatus fue mayor al utilizar trigo para la producción de inóculo primario, los niveles de colonización en suelo contaminado alcanzados por los tratamientos con el inóculo de cebada fueron mayores que los de trigo.  Los suplementos (torta de soya y aserrín) adicionados al suelo en el ensayo de colonización, parecen no favorecer al crecimiento del hongo; y la humedad pudo ser un factor limitante del crecimiento miceliar de los inóculos secundarios de trigo y cebada en el suelo contaminado.
  23. 23. RECOMENDACIONES  Producir inóculo primario usando granos de trigo para obtener mayor biomasa y luego utilizar ésta para inocular granos de cebada para producir inoculo secundario que se utilizará para inocular un sustrato definitivo o suelo contaminado directamente.  Optimizar la humedad en los sistemas con suelo contaminado, para prolongar el crecimiento del micelio. Sobre todo cuando se usen suplementos secos como el aserrín debido a que por su naturaleza absorbe humedad.  Probar diferentes niveles de contaminación de petróleo crudo en suelo sin ningún suplemento, para probar dosis mínimas y máximas que permitan el crecimiento del hongo. Medir nivel de degradación de petróleo en dichos tratamientos.  Realizar ensayo de colonización de suelo a temperaturas más altas (entre 24° y 40°C), debido a que los lugares de potencial aplicación para biorremediación se encuentran en zonas cálidas como el Norte del Perú y la Región Amazónica.
  24. 24.  Blgo. Juan Juscamaita M. – Patrocinador - UNALM PhD. Carl Johnston – Co- Patrocinador – YSU, Ohio Ing. Jose Palacios Blgo. Hilver Charca  Msc. Ladislao Luis Renjifo – UNAS  Blga. María Encarnación Holgado - UNSAAC Familia y amigos
  25. 25. Muchas g MUCHAS GRACIAS
  26. 26. Caracterización Suelo
  27. 27. Ciclo de vida Basidiomicetos
  28. 28. Factor Crecimiento del micelio Fructificación Temperatura 24º a 30°C 15º a 18ºC Luminosidad Oscuridad Luz indirecta (longitudes de onda menores a 600 nm) y un fotoperiodo de 12 horas Humedad R. 30 a 40% 85 a 90% Aireación 28% de CO2, 20 % de oxígeno en el ambiente 20% de Oxígeno y menos de 700 ppm de CO2 en el ambiente. pH 5-6 (bajo 4 existe inhibición) 5-6 ( bajo 4 existe inhibición) Cuadro 3. Factores que afectan el crecimiento de Pleurotus spp. Fuente: Sanchez, J., et al., 2001 Factores que afectan el crecimiento de P. ostreatus
  29. 29. Vías metabólicas de HAP en P. ostreatus
  30. 30. Formula conversión biomasa cm hifa/ g grano = C cm hifa x B ml de agua D ml agua A g grano A= 1 g de grano B = 25 ml agua C = cm hongo medido (dato) D = volumen de agua en 10 campos de visión (6.25 x10^-3)
  31. 31. Profundidad: 0.1 mm2
  32. 32. Dilución 1/25 30 segundos Tinción 10 campos de visión por repetición Procesamiento de datos MEDICIÓN DE BIOMASA
  33. 33. Hongos de pudrición blanca Phanaerochaete chrysosporium Ganderma applanatum Schizophillum communne Trametes versicolorPycnoporus sanguineus Pleurotus ostreatus

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