VPH: Genómica, proteómica y diagnóstico Erwin Chiquete Biología Molecular en Medicina Biología  Molecular  en  Medicina  •...
Objetivos <ul><li>Describir la estructura genética del virus del papiloma humano (VPH). </li></ul><ul><li>Referir el ciclo...
Importancia En el mundo, hasta el  60 % de los adultos  puede presentar alguna de las formas de  infección por VPH . La in...
En E.U.A. el 75 % de las mujeres tiene infección genital por VPH. El  VPH  está asociado a  más del 95% de los casos de CA...
El VPH pertenece a la familia de los  papovarirus , del género  papilomavirus . Los papilomavirus infectan a una gran vari...
El virus Origina distintas enfermedades en el humano, dependiendo del tipo de VPH, del tejido y del sistema inmune del hos...
El virus El VPH se clasifica en  genotipos , o simplemente tipos, según la secuencia de su material genético. A la fecha s...
El virus VPH Piel Mucosas Alto riesgo Bajo riesgo
El virus Alto riesgo :  16 ,  18 ,  31 ,  33 , 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Bajo riesgo : 6, 11, 42, 43 y 44.
El virus 6, 11 Verrugas laríngeas 16, 18, 31, 33, 35 Carcinoma cervical 5, 8 Epidermodisplasia verruciforme 6, 11, 16, 18,...
Genómica  y  Proteómica
<ul><li>Carece de envoltura de lípidos.  </li></ul><ul><li>Posee nucleocápside hecha de dos proteínas del virus ( L1 , 80%...
El genoma del VPH Su genoma es  DNA de doble cadena  y  circular  con casi  8 000 nucleótidos . Codifica para 8 proteínas....
El proteoma del VHC E6 E7 E1 L2 L1 E5 E2 E4 ORF 3 2 1 2 000 4 000 6 000 nt
El genoma del VPH Replicación Proteínas transformantes Replicación  y transcripción Proteína  secundaria  de la cápside Pr...
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Erwin El ciclo de vida del VPH 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ NH 2 COOH
El ciclo de vida del VPH El VPH  infecta a las capas celulares basales  del epitelio escamoso, no a las superficiales. Una...
<ul><li>Esta forma de infección conduce a los cambios citopáticos atribuidos al VPH, a saber: </li></ul><ul><li>Koilocitos...
Una segunda forma de infección (llamada  no-permisiva ) se refiere a aquella en la que la replicación viral no ocurre. El ...
Es esta forma de infección la que origina el fenómeno de iniciación en la transformación neoplásica, debido a que el genom...
Cuando se rompe el gen  E2  se  pierde su función . Por desgracia, una función de la proteína E2 es la de reprimir a  E6  ...
VPH  y  neoplasia
VPH y neoplasia En 1976, Harald zur Hausen propuso que ciertos papilomavirus podrían estar implicados en el origen del cán...
VPH y neoplasia Actualmente se sabe que el VPH está implicado en más del 95% de los casos de CaCU. Su implicación es menor...
VPH y neoplasia <ul><li>Los genotipos implicados con mayor frecuencia son: </li></ul><ul><li>Genotipo 16 (50%, Mex 68%). <...
VPH y neoplasia <ul><li>Células lábiles. </li></ul>2.  Células estables. 3.  Células permanentes. Ciclo celular normal
VPH y neoplasia Ciclo celular normal El término ciclo celular se refiere a todas las  etapas  por  las  que  pasa  una  cé...
VPH y neoplasia Ciclo celular normal
VPH y neoplasia Ciclo celular normal INICIO G 1 G 2 S M S G 1 G 2 M Cinasa (Cdk) Ciclina G 1 Ciclinas G 1 Cinasa (Cdk) Cic...
VPH y neoplasia Ciclo celular normal
VPH y neoplasia Ciclo celular normal Existen  puntos de verificación  o “ check points ” que son momentos  en los  que la ...
VPH y neoplasia Ciclo celular normal Si  la  célula  no  puede  reparar  el  daño  al  DNA  entonces “se  suicida”,  es  d...
VPH y neoplasia Ciclo celular normal El VPH expresa las  oncoproteínas  llamadas E6  y  E7   que  estimulan  la  progresió...
VPH y neoplasia degradación Erwin 5’ 3’ 5’ 3’ E6 E7 p53 E6 pRB E7
<ul><li>Además de pRB E7 también puede inhibir a: </li></ul><ul><li>p21 </li></ul><ul><li>p27 </li></ul><ul><li>p130 </li>...
VPH y neoplasia Infección por VPH Persistencia del DNA viral Integración al genoma humano y alteración de la proliferación...
VPH y neoplasia Sólo el 10% de los casos de infección genital por VPH progresan hasta el CaCU. Toma 10 a 20 años para que ...
VPH y neoplasia El VPH parece ser un factor necesario, mas no suficiente para que se desarrolle el CaCU. Otros factores am...
VPH y neoplasia <ul><li>Otros factores importantes son: </li></ul><ul><li>Inicio de actividad sexual antes de los 20 años ...
VPH y neoplasia <ul><li>Después del fenómeno de iniciación, para que la célula avance en su progresión maligna debe ganar ...
Diagnóstico
Diagnóstico <ul><li>Las pruebas de diagnóstico son usadas en tres importantes rubros: </li></ul><ul><li>Detectar la infecc...
Diagnóstico <ul><li>Las principales técnicas de detección de la infección por VPH radican en tres estrategias básicas: </l...
Diagnóstico 3.  Detección del ADN del VPH (técnica directa).
Diagnóstico No existe un método de cultivo del VPH eficiente, debido al alto tropismo específico del virus por células esc...
Diagnóstico Colpocitología <ul><li>Variable buscada:  Presencia de koilocitos. </li></ul><ul><li>Ventajas:  Simple, barato...
Diagnóstico Histopatología <ul><li>Variable buscada:  Atipias, infiltraciones, estratificaciones, etc. </li></ul><ul><li>V...
Diagnóstico Serología <ul><li>Variable buscada:  Anticuerpos anti-E6 y anti-E7 o de L1 y L2. </li></ul><ul><li>Ventajas:  ...
Diagnóstico Pruebas moleculares <ul><li>Las pruebas moleculares se basan en las siguientes tres estrategias: </li></ul><ul...
Diagnóstico Pruebas moleculares <ul><li>Variable buscada:  ADN VPH. </li></ul><ul><li>Ventajas:  Altamente sensibles y esp...
Diagnóstico Captura de híbridos El método de captura de híbridos detecta la presencia de VPH de bajo o alto riesgo, sin ha...
Diagnóstico PCR El método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es el más sensible y e...
Diagnóstico 50 µl 50 µl Toma de muestra Extracción de DNA DNA molde PCR Taq pol  1U dNTPs  75  M Amortiguador 1x C12Mg 1....
Diagnóstico Hibridación in situ El método de hibridación in situ detecta al ADN VPH incluido en las células, por lo que da...
Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa
Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa
Diagnóstico <ul><li>Identificación de efectos citopáticos mediante colpocitología  </li></ul><ul><li>(especialmente para  ...
Diagnóstico La determinación del ADN del VPH tiene sensibilidad que supera en un  10% a 20%  a la colpocitología (pero con...
Conclusiones <ul><li>El VPH posee proteínas oncogénicas que inmortalizan a la célula, para que ésta entre a ciclo celular ...
Conclusiones <ul><li>El diagnóstico de la infección por VPH se hace de forma directa e indirecta, mediante la aplicación c...
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Erwin. vph genómica, proteómica y dx

  1. 1. VPH: Genómica, proteómica y diagnóstico Erwin Chiquete Biología Molecular en Medicina Biología Molecular en Medicina • O.P.D. Hospital Civil de Guadalajara • C.U.C.S.
  2. 2. Objetivos <ul><li>Describir la estructura genética del virus del papiloma humano (VPH). </li></ul><ul><li>Referir el ciclo de vida del VPH en el humano. </li></ul><ul><li>Describir al ciclo de vida de la célula hospedera. </li></ul><ul><li>Describir las alteraciones del ciclo celular como fenómeno de iniciación en la transformación neoplásica. </li></ul>
  3. 3. Importancia En el mundo, hasta el 60 % de los adultos puede presentar alguna de las formas de infección por VPH . La infección por VPH es subclínica en la mayoría de los casos.
  4. 4. En E.U.A. el 75 % de las mujeres tiene infección genital por VPH. El VPH está asociado a más del 95% de los casos de CACU en el mundo. Importancia
  5. 5. El VPH pertenece a la familia de los papovarirus , del género papilomavirus . Los papilomavirus infectan a una gran variedad de especies de mamíferos incluyendo al hombre. El virus
  6. 6. El virus Origina distintas enfermedades en el humano, dependiendo del tipo de VPH, del tejido y del sistema inmune del hospedero.
  7. 7. El virus El VPH se clasifica en genotipos , o simplemente tipos, según la secuencia de su material genético. A la fecha se han descrito más de 100 genotipos , de los cuáles menos de la mitad son muy prevalentes.
  8. 8. El virus VPH Piel Mucosas Alto riesgo Bajo riesgo
  9. 9. El virus Alto riesgo : 16 , 18 , 31 , 33 , 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Bajo riesgo : 6, 11, 42, 43 y 44.
  10. 10. El virus 6, 11 Verrugas laríngeas 16, 18, 31, 33, 35 Carcinoma cervical 5, 8 Epidermodisplasia verruciforme 6, 11, 16, 18, 31 Verrugas genitales 1, 2 , 4, 10 Verrugas cutáneas Genotipos más relacionados Enfermedad
  11. 11. Genómica y Proteómica
  12. 12. <ul><li>Carece de envoltura de lípidos. </li></ul><ul><li>Posee nucleocápside hecha de dos proteínas del virus ( L1 , 80% y L2 20%). </li></ul>Virión: 55 nm El virus
  13. 13. El genoma del VPH Su genoma es DNA de doble cadena y circular con casi 8 000 nucleótidos . Codifica para 8 proteínas. Este DNA se hace lineal y se puede integrar al genoma humano.
  14. 14. El proteoma del VHC E6 E7 E1 L2 L1 E5 E2 E4 ORF 3 2 1 2 000 4 000 6 000 nt
  15. 15. El genoma del VPH Replicación Proteínas transformantes Replicación y transcripción Proteína secundaria de la cápside Proteína principal de la cápside Región reguladora
  16. 16. El ciclo de vida del VPH El VPH es epiteliotrópico por naturaleza y su ciclo de vida está íntimamente relacionado a la diferenciación de las células escamosas. Su receptor en la célula hospedera es la proteína de adhesión llamada  -Integrina 6 .
  17. 17. Erwin El ciclo de vida del VPH 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ NH 2 COOH
  18. 18. El ciclo de vida del VPH El VPH infecta a las capas celulares basales del epitelio escamoso, no a las superficiales. Una vez que infecta a la célula hospedera, el VPH permanece con muy poca actividad, hasta llegar a las capas superficiales del epitelio (por proliferación celular), donde comienza su replicación activa.
  19. 19. <ul><li>Esta forma de infección conduce a los cambios citopáticos atribuidos al VPH, a saber: </li></ul><ul><li>Koilocitosis . </li></ul><ul><li>Crecimiento nuclear . </li></ul><ul><li>Disqueratosis . </li></ul><ul><li>Multinucleación . </li></ul><ul><li>Neoplasia intraepitelial cervical (NIC) . </li></ul>El ciclo de vida del VPH
  20. 20. Una segunda forma de infección (llamada no-permisiva ) se refiere a aquella en la que la replicación viral no ocurre. El DNA viral persiste así en forma latente como un elemento extracromosómico (episomal) o bien se integra al azar en el genoma humano (los cromosomas). El ciclo de vida del VPH
  21. 21. Es esta forma de infección la que origina el fenómeno de iniciación en la transformación neoplásica, debido a que el genoma del VPH se “rompe” en los sitios que corresponden al gen E2 y a veces E1. El ciclo de vida del VPH
  22. 22. Cuando se rompe el gen E2 se pierde su función . Por desgracia, una función de la proteína E2 es la de reprimir a E6 y E7 , que son las proteínas que originan la transformación neoplásica. El ciclo de vida del VPH
  23. 23. VPH y neoplasia
  24. 24. VPH y neoplasia En 1976, Harald zur Hausen propuso que ciertos papilomavirus podrían estar implicados en el origen del cáncer cérvico-uterino.
  25. 25. VPH y neoplasia Actualmente se sabe que el VPH está implicado en más del 95% de los casos de CaCU. Su implicación es menor en los casos menos graves (NIC I a III).
  26. 26. VPH y neoplasia <ul><li>Los genotipos implicados con mayor frecuencia son: </li></ul><ul><li>Genotipo 16 (50%, Mex 68%). </li></ul><ul><li>Genotipo 18 (12%, Mex 8 %). </li></ul><ul><li>Otros (31, 33, 35, 45, etc.). </li></ul>
  27. 27. VPH y neoplasia <ul><li>Células lábiles. </li></ul>2. Células estables. 3. Células permanentes. Ciclo celular normal
  28. 28. VPH y neoplasia Ciclo celular normal El término ciclo celular se refiere a todas las etapas por las que pasa una célula entre una división y la siguiente. <ul><li>El ciclo celular se divide en dos grandes </li></ul><ul><li>fases: </li></ul><ul><li>Mitosis </li></ul><ul><li>Interfase </li></ul>
  29. 29. VPH y neoplasia Ciclo celular normal
  30. 30. VPH y neoplasia Ciclo celular normal INICIO G 1 G 2 S M S G 1 G 2 M Cinasa (Cdk) Ciclina G 1 Ciclinas G 1 Cinasa (Cdk) Ciclina M Ciclinas mitóticas
  31. 31. VPH y neoplasia Ciclo celular normal
  32. 32. VPH y neoplasia Ciclo celular normal Existen puntos de verificación o “ check points ” que son momentos en los que la célula tiene la oportunidad de detener su avance continuo, si es que no se llenan ciertas condiciones.
  33. 33. VPH y neoplasia Ciclo celular normal Si la célula no puede reparar el daño al DNA entonces “se suicida”, es decir, se desencadena la maquinaria enzimática que la lleva a apoptosis .
  34. 34. VPH y neoplasia Ciclo celular normal El VPH expresa las oncoproteínas llamadas E6 y E7 que estimulan la progresión en el ciclo celular e inhiben su detención, de esta manera inmortalizan a las células huéspedes, estableciendo una alta probabilidad de generar una neoplasia.
  35. 35. VPH y neoplasia degradación Erwin 5’ 3’ 5’ 3’ E6 E7 p53 E6 pRB E7
  36. 36. <ul><li>Además de pRB E7 también puede inhibir a: </li></ul><ul><li>p21 </li></ul><ul><li>p27 </li></ul><ul><li>p130 </li></ul><ul><li>p107 </li></ul>
  37. 37. VPH y neoplasia Infección por VPH Persistencia del DNA viral Integración al genoma humano y alteración de la proliferación celular Mutaciones en genes celulares Nuevas mutaciones Infección subclínica NIC I NIC II NIC III Ca invasor
  38. 38. VPH y neoplasia Sólo el 10% de los casos de infección genital por VPH progresan hasta el CaCU. Toma 10 a 20 años para que la lesión NIC I progrese hasta CaCU con fenotipo invasor. Lo anterior sugiere que el VPH no es el único factor en el desarrollo del cáncer.
  39. 39. VPH y neoplasia El VPH parece ser un factor necesario, mas no suficiente para que se desarrolle el CaCU. Otros factores ambientales y propios del hospedero son también necesarios.
  40. 40. VPH y neoplasia <ul><li>Otros factores importantes son: </li></ul><ul><li>Inicio de actividad sexual antes de los 20 años de edad. </li></ul><ul><li>Múltiples parejas sexuales. </li></ul><ul><li>Otras ETS. </li></ul><ul><li>Tabaquismo. </li></ul><ul><li>Inmunosupresión (SIDA, corticoides). </li></ul><ul><li>Factores hereditarios (ej. mutación de p53). </li></ul>
  41. 41. VPH y neoplasia <ul><li>Después del fenómeno de iniciación, para que la célula avance en su progresión maligna debe ganar nuevas mutaciones que le confieren proliferación desmesurada y sobretodo: </li></ul><ul><li>Invasión. </li></ul><ul><li>Metástasis. </li></ul>
  42. 42. Diagnóstico
  43. 43. Diagnóstico <ul><li>Las pruebas de diagnóstico son usadas en tres importantes rubros: </li></ul><ul><li>Detectar la infección activa. </li></ul><ul><li>Identificar genotipos de riesgo. </li></ul><ul><li>Carga viral (?). </li></ul>
  44. 44. Diagnóstico <ul><li>Las principales técnicas de detección de la infección por VPH radican en tres estrategias básicas: </li></ul><ul><li>Identificación de los efectos citopáticos del VPH (técnica indirecta). </li></ul><ul><li>Detección de anticuerpos anti-VPH (técnica indirecta). </li></ul>
  45. 45. Diagnóstico 3. Detección del ADN del VPH (técnica directa).
  46. 46. Diagnóstico No existe un método de cultivo del VPH eficiente, debido al alto tropismo específico del virus por células escamosas. Por lo tanto, el cultivo del VPH no es una herramienta útil para diagnóstico (aunque sí para investigación).
  47. 47. Diagnóstico Colpocitología <ul><li>Variable buscada: Presencia de koilocitos. </li></ul><ul><li>Ventajas: Simple, barato, muy específico. </li></ul><ul><li>Desventajas: Poco sensible, no diferencia entre genotipos del VPH. </li></ul>
  48. 48. Diagnóstico Histopatología <ul><li>Variable buscada: Atipias, infiltraciones, estratificaciones, etc. </li></ul><ul><li>Ventajas: Barato, muy específico. </li></ul><ul><li>Desventajas: Poco sensible, no diferencia entre genotipos del VPH. </li></ul>
  49. 49. Diagnóstico Serología <ul><li>Variable buscada: Anticuerpos anti-E6 y anti-E7 o de L1 y L2. </li></ul><ul><li>Ventajas: Simple, relativamente barato, sensible. </li></ul><ul><li>Desventajas: Menos específica, no diferencia una infección resuelta de una activa. </li></ul>
  50. 50. Diagnóstico Pruebas moleculares <ul><li>Las pruebas moleculares se basan en las siguientes tres estrategias: </li></ul><ul><li>Detección del ADN VPH mediante captura de híbridos. </li></ul><ul><li>Amplificación del genoma mediante PCR. </li></ul><ul><li>Hibridación del ADN VPH in situ . </li></ul>
  51. 51. Diagnóstico Pruebas moleculares <ul><li>Variable buscada: ADN VPH. </li></ul><ul><li>Ventajas: Altamente sensibles y específicas. </li></ul><ul><li>Desventajas: Procesamiento técnico delicado, caras. </li></ul>
  52. 52. Diagnóstico Captura de híbridos El método de captura de híbridos detecta la presencia de VPH de bajo o alto riesgo, sin hacer distinción de genotipos. Su sensibilidad ha sido cuestionada, pero en algunos países goza de gran auge.
  53. 53. Diagnóstico PCR El método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es el más sensible y específico y permite cuantificar el ADN VPH (carga viral). No obstante exige cuidados técnicos especiales.
  54. 54. Diagnóstico 50 µl 50 µl Toma de muestra Extracción de DNA DNA molde PCR Taq pol 1U dNTPs 75  M Amortiguador 1x C12Mg 1.5 mM Indicadores DS7 y DS8 PCR “Nested” DNA molde Taq pol 1U dNTPs 75  M Amortiguador 1x C12Mg 1.5 mM Indicadores M1 y M2 Electroforesis 1 Hold 3 Tmp 40 Ciclos 2 Holds 94.0 96.0 60.0 72.0 72.0 0.30 0.30 0.30 5.00 7.00 4.0 C Minutos PCR
  55. 55. Diagnóstico Hibridación in situ El método de hibridación in situ detecta al ADN VPH incluido en las células, por lo que da una apreciación “más real” de los eventos patológicos. Es cara y técnicamente demandante.
  56. 56. Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa
  57. 57. Diagnóstico Hibridación in situ Positiva Negativa
  58. 58. Diagnóstico <ul><li>Identificación de efectos citopáticos mediante colpocitología </li></ul><ul><li>(especialmente para ASC-US ) </li></ul>2. Confirmación de la infección y determinación de genotipos Colposcopía diagnóstica y terapéutica >30 años de edad
  59. 59. Diagnóstico La determinación del ADN del VPH tiene sensibilidad que supera en un 10% a 20% a la colpocitología (pero con menos especificidad). Debido al alto valor predictivo negativo de combinar colpocitología y ADN VPH, si una mujer es negativa a ambos puede requerir de una nueva revisión cada 2 – 3 años .
  60. 60. Conclusiones <ul><li>El VPH posee proteínas oncogénicas que inmortalizan a la célula, para que ésta entre a ciclo celular y por tanto a mitosis muchas veces, para que el VPH se pueda reproducir. </li></ul><ul><li>Con el VPH la célula pierde su capacidad de corregir errores genéticos, ganándose así más mutaciones. </li></ul><ul><li>Sin embargo, el VPH es un factor necesario mas no suficiente en el desarrollo de una neoplasia cervical maligna. </li></ul>
  61. 61. Conclusiones <ul><li>El diagnóstico de la infección por VPH se hace de forma directa e indirecta, mediante la aplicación combinada de técnicas que ofrecen en su conjunto un adecuado desempeño diagnóstico. </li></ul>
  62. 62. Gracias

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