1. Andrés Bello Universidad
Facultad Ciencias Biológicas
Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Microbiología
GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
MICROBIOLOGÍA
BIO 050
CARRERA: ENFERMERÍA

2. 2
TRABAJO PRÁCTICO N°1
PROCEDIMIENTOS BÁSICOS
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE
MICROBIOLOGÍA
Durante el desarrollo de las actividades prácticas se debe mantener una serie de normas,
cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familias y la
comunidad.
1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminación de sus
ropas.
2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.
3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado.
4. Está estrictamente prohibido comer, beber, comer, fumar, masticar chicle, o llevarse
cualquier objeto a la boca, por el riesgo de contagio.
5. No ingresar bolsos o chaquetas a la sala de trabajos prácticos.
6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y después de su uso. Al enfriarla, evite
salpicar, los aerosoles son muy contagiosos.
7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material
cortopunzante.
8. Las placas de Petri sólo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor
a los 30cm del mechero Bunsen encendido.
9. Los tubos deben flamearse antes y después de ser utilizados.
10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto
también se recomienda frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto
con material contaminado.

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11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Éste sólo debe encenderse al
momento de la observación de la preparación. La que debe retirarse terminada la
observación, para limpiar el lente de inmersión con Xilol y papel tissue.
12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de realizado el
trabajo práctico
El estudio de bacterias, virus, parásitos y hongos potencialmente patógenos para el hombre,
animales u otros seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los
procedimientos empleados. Las normas de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable
el riesgo asociado a su manipulación. Deben considerarse para lograr que el personal que
manipula estos agentes infecciosos en el ámbito hospitalario esten mínimamente expuestas a
adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.
BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a proteger
la salud de las personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biológicos,
físicos o químicos en el laboratorio, como también indirectamente al ambiente.
AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genéticamente modificados,
presentes en forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originar
cualquier infección, alergia o toxicidad.
CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN EN EL LABORATORIO
El laboratorio tiene importancia central en el diagnóstico etiológico, de modo que resulta
fundamental evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desde
las otras muestras (contaminación cruzada).
Con este fin, se debe trabajar con TÉCNICA ASÉPTICA y utilizando material ESTÉRIL.
Algunos conceptos que debemos conocer y manejar son:
DESINFECCIÓN: proceso que busca eliminar la mayoría de los microorganismos
patógenos, excepto esporas y algunos virus, en objetos inanimados.

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ASEPSIA: proceso que utiliza agentes químicos para impedir infección de piel, mucosas u
otros tejidos en seres vivos. Los antisépticos actúan provocando muerte de los
microorganismos patógenos o impidiendo su multiplicación.
SANITIZACIÓN O HIGIENIZACIÓN: Proceso que utiliza lavado mecánico o agentes
químicos para REDUCIR el número de patógenos presentes en un objeto hasta niveles
aceptables para la salud pública.
ESTERILIZACIÓN: proceso físico o químico destinado a destruir TODA vida microbiana,
incluyendo esporas, en materiales u objetos inanimados.
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN
1.- Métodos Físicos
a) Calor
Es el método más usado, económico y fácil de controlar. Proceso rápido al cual la totalidad
de los microorganismos resulta sensible.
Pasteurización: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lácteos (Tuberculosis,
Brucelosis, Salmonelosis) y retrasar descomposición de la leche.
Autoclave (vapor saturado a presión): Entre los métodos de esterilización, es el más efectivo
y de menor costo; es el método de elección para instrumental médico de uso repetido.
Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A través del
flameado se evita la contaminación de tubos y matraces., al someterlos directamente a la
llama.
b) Radiaciones
Rayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicación
del DNA durante la replicación celular.

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Se usa principalmente en ambientes de quirófanos, sala de prematuros, esterilización de
superficies.
Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilización
en frío de materiales desechables como: jeringas, bisturís, catéteres, prótesis, guantes de
cirugía y equipos de transfusión.
2.- Métodos Mecánicos
Ondas sónicas y ultrasónicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendo
desnaturalización de proteínas y muerte celular.
Filtración: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias líquidas o gases,
mediante su paso a través de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es
la esterilización de sueros o líquidos que contengan proteínas o metabolitos termolábiles.
3.- Métodos Químicos (antisépticos y desinfectantes)
La penetración de estos agentes es más rápida en bacterias Gram positivas, debido
principalmente a la presencia protectora de la membrana externa en las bacterias Gram
negativas.
Los agentes químicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al
encontrarse contaminados con bacterias, siendo el género Pseudomonas el más habitual.
Esto es de suma importancia y para evitarlo es imprescindible que el personal de salud
cuente con un acabado conocimiento del tema.

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El siguiente cuadro resume los principales agentes químicos y su utilidad
AGENTE ACCIÓN APLICACIÓN
Alcoholes 70% Sobre formas vegetetivas Piel y superficies inertes
(no esporas). Desnaturaliza
proteínas
Cloro Bactericida. Actúa oxidando Útiles de cocina, chatas,
grupos sulfhidrilos libres patos, baños,
unidades de diálisis
Yodo/povidona yodada Bactericida. Actúa sobre formas Piel heridas, material
vegetativas y esporas, hongos y quirúrgico
algunos virus. Interfiere procesos
de oxido – reducción y fosforilación
bacterianos.
TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA
El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo que
respecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de
esterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc) y
siembra en condiciones anaeróbicas.
El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tres
actividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se inicia
con el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condiciones
definidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismo
aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a
antibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra la
identificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con el
fin de hacer el control de la infección o análisis de población.
Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo
puro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e
indispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1).
Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento
importante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta consiste en

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colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen y
multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo
corrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica.
Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de
distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes del
proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.
Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de
pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas y
bioquímicas y lograr así su identificación correcta.
Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento
de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.
En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe
realizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido para
obtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).
Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener
cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología
y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.
Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana
mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.
MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO
Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la
observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no es
posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones
bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a las
bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de
crecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su
origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo
sólido, hasta formar una población que se represente como una colonia visible. Por lo tanto
una colonia esta formada por millones de bacterias.

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El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias.
El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características.
Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico)
permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen
características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen,
superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre).
Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace
imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hace
necesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias.
Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para la
identificación definitiva de las colonias.
En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de colonias
bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo.
Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia
bacteriana.

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de uso común en el Laboratorio de Tabla Nº 1 : Material Microbiología
Esterilización
Material Tipo esterilización Tipo de material
Antes de ser utilizada Después de ser utilizada
Asa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable
Pipetas aforadas de vidrio* Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable
Pipetas aforadas de plástico Química No No Desechable
Pipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable
Autoclave
Tubos estériles** Si Si Re-utilizable
Llama Mechero
Placas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizable
Puntas de Papel Absorbente Autoclave No No Desechable
Placas Petri de plástico Química No Si Desechable
* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo
y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.
** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar
la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

10. ACTIVIDADES PRÁCTICAS
1. De medios Sólidos a medios Sólidos.
1.1. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido:
a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del
microorganismo, Grupo y Fecha).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no
existan colonias.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio
(Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria
suficiente para poder sembrar).
e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.
f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento,
deslizar el asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del
medio de cultivo.
g. Flamear y tapar la boca del tubo.
h. Flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.
A B
C D
Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar
tendido.

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2. De medios Sólidos a medios Líquidos.
2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido:
a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre
microorganismo, Grupo, Fecha).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio
(Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria
suficiente para poder sembrar).
e. Flamear la boca del tubo con medio líquido.
f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente.
g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización.
h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.
A B
C D
18 – 24 Hrs.
Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

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3. De medios Líquidos a medios Sólidos
3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos
correspondientes.
b. Flamear el asa para su esterilización (hasta que se ponga rojo).
c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no
existan colonias.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e
introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y
retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo.
f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero.
g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño
sector de la placa. Flamear el asa.
ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector
contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa.
iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector
contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.
iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener
cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que
ya se encuentran en la placa.
h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.
A B C
D
18 – 24 Hrs.
Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.

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4. Técnicas de esterilización
4.1. Flameado
a. Dividir una placa por la mitad.
b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por
una mitad del agar. Cerrar la placa.
c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente
por la otra mitad del agar.
d. Cerrar la placa.
e. Incubar la placa a 37ºC.
5. Desinfección y Asepsia
5.1. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos.
b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico.
c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del
mechero (más de 30 cm).
d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag).
e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos.
f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag).
g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr.
5.2.Yodo
a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos
por el agar.
b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere
unos segundos.
c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
d. Incubar la placa a 37ºC.
5.3.Alcohol
a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.
b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición.
c. Incubar la placa a 37ºC.

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Continuación)
OBJETIVOS
1. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido
(Placas de Agar).
2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.
3. Practicar preparación de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.
En la siguiente sesión de trabajo práctico Ud. debe:
1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando los
siguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura,
color y brillo).
2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo líquidos y sólidos
sembrados en la primera sesión. Describa lo observado.
3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilización, desinfección y
asepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar.
4. Realizar análisis de morfología microscópica
4.1 Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.
a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (del tamaño de una
arveja).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.
d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto,
suavemente, formando una capa delgada.
f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.
4.2 Tinción simple
a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%
b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusión del colorante

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c. Lavar suavemente con agua.
d. Secar con papel absorbente
e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil
f. Describa lo que observa: forma, agrupación, color.
MICROSCOPIO OPTICO:
• Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen
del objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de
ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el
brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser
monocular o binocular.
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.

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USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DE
INMERSIÓN
1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio
2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de
inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la
zona de interés.
4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x
(línea negra)
EVITE CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL
ACEITE DE INMERSIÓN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá
estar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeño
espacio
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico
8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE
EL OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES
(PAPEL SUAVE) IMPREGNADO EN XILOL.
9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado,
con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)

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TRABAJO PRÁCTICO N°2
MORFOLOGÍA BACTERIANA
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente para el
crecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios líquidos pueden ser
usados en tubos de ensayo o en botellas de vidrio. Los medios sólidos se obtienen de una
solución de nutrientes solidificada con agar (polisacárido obtenido de ciertas algas
marinas que actúa como agente gelificante) o gelatina y se usan en placas de Petri. El
agar es el agente gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoría
de las bacterias y no se funde a 37ºC (Tº usada para la incubación de las bacterias).
Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de
microorganismos que se desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (proteínas,
aminoácidos y/o sales inorgánicas que contengan nitrógeno) y fuentes de energía
(carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).
Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clínica:
- Agar nutriente (corriente): Es un medio básico usado con propósitos generales para el
cultivo de muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la
adición de sustancias adecuadas.
- Agar sangre: Es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-10% de sangre.
Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella
pertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentar
el agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivo
denominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el crecimineto
de ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae.
- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y
cristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir
aquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las

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bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E. coli) forman colonias rojas debido a
que los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de pH
del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (por
ejemplo muchas cepas de Salmonella) forman colonias incoloras.
Clasificación de los medios de cultivo
1.- Según estado físico:
a. Sólidos (solidificados por adición de agar al medio líquido o de alguna proteína
coagulada).
b. Líquidos
c. Semisólidos
2.- Según contenido nutricional:
a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).
b. Mejorados (o enriquecidos): por adición al medio corriente de: sangre, proteínas,
hidratos de carbono, extracto de órganos o levadura.
c. Sintéticos y mínimos: Los primeros son medios de fórmula perfectamente conocida,
en la cual se emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen a
propósitos bien definidos. Los segundos son también sintéticos, pero a su fórmula que no
permite el crecimiento bacteriano se le adiciona uno o dos sustratos o elementos, sobre
los cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio, sin interferencia de
otro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecerá sólo si esa sustancia es
utilizada.
3.- Según su empleo con propósitos de diagnóstico o taxonómicos.
a. Selectivos: Son aquéllos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento de
otros microorganismos. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientes
del medio. ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias Gram
positivas, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio para examinar

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patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram negativos. ej.: Agar sangre
con azida de sodio, agar Petragnani.
b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pH
que permiten apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con un
conjunto de pruebas de este tipo clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonomía
sobre base de pruebas bioquímicas".
Muchos de estos medios sólidos diferenciales contienen uno o más hidratos de carbono
fermentables y un indicador adecuado para la determinación de la producción de ácidos o
compuestos alcalinos. ej.: citrato (Simmons), agar triple azúcar hierro (TSI). Los cambios
producidos en el medio por un organismo o grupo de organismos son característicos,
diferenciándolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios diferenciales
permiten identificar reacciones de fermentación de los cultivos puros de bacterias o su
capacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.
c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola fórmula los elementos de los medios
selectivos y diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar y
clasificar.
Ej.: Medio Nº 110 para Staphylococcus, éste contiene 7.5% de NaCl, en circunstancias
que la concentración salina de la mayoría de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Este
ingrediente evita el desarrollo de casi todas las demás bacterias.
Además, las pruebas de la gelatina y la fermentación del manitol permiten diferenciar las
diversas cepas de Staphylococcus.
Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey.
En la figura Nº 1 se observa algunas características macroscópicas de colonias
bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de microorganismos.
MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO
La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de
características complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:
forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,
flagelos), movilidad, etc.

20. 20
Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos.
En el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:
1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza
el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer
posible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña
diferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda.
Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la
que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo
especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el
contraste se insertan filtros verdes o azules.
a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivo
y evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de
coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los
microorganismos.
b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la
observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o
de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos
directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se
emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente se
observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.
c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y
depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un
portaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.
2. Observación de bacterias muertas:
a. Tinción simple: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de
microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.
b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir
(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de
este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.
c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como
nucleoide, flagelo, esporas, etc.

21. 21
d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura
física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente
frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de
bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en
bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción de Ziehl Neelsen.
Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por métodos de
tinción son esporas y cápsula:
a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de tinción especial. Algunos
géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma
de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de
nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor,
a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructura
proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las hace
resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.
b. Observación de cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china que
permite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.
El estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener una
orientación preliminar de su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioquímicas
específicas que permitirán una identificación más certera y precisa.
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram
(Figura Nº 2), pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram
negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana
(pares, cadenas, racimos).
La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego
tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se
tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante
al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de etanol-
acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo; las que se
decoloran son Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color violeta y las
Gram negativo de color rojo o rosado.

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La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia en
la composición química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram
positivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram
negativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa
(además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de
la acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de
retener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo, pierden
parte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un solvente
orgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de
peptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en la
tinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla en
forma adecuada.
También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como
Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de 24 ó 48 horas), a
pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.
Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen)
es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M.
tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con la
tinción de Ziehl Neelsen.
Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero una vez teñidas, el colorante no se libera,
aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de alcohol y ácido
clorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que tiene su cubierta,
incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y 40% del
peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lípidos le confiere a este
grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio
líquido), resistencia a la acción de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido
a la dificultad de absorción de nutrientes a través de esta pared celular lipídica.

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Figura Nº 2: Técnica Tinción Gram.
1 Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos
2 Agregue solución de lugol por 1min.
3 Decolore con alcohol-acetona y lave con agua
4 Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel

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TABLA Nº 1: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones
TINCIÓN REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD
Cristal Violeta, Lugol, Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Clasificación bacteriana clásica:
Gram
Alcohol – Acetona, Safranina Gram negativo se tiñen con contraste (rojo) Gram Positivo y Negativo
Esporas de bacilos
Tinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde)
Gram Positivo
Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul Unión ácido resistente de fucsina a escasos
Kinyoun Nocardia (BAA lábiles)
de Metileno ácidos micólicos de la pared (fucsia)
Naranja de Acridina Tiñe el DNA bacteriano
Anaranjado de acridina Bacterias Gram lábiles
(fluorescencia) (fluorescencia naranja)
Bartonella spp,
Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia) corpúsculo elemental
de Chlamydia
Fucsina, Alcohol – Acido, Azul Unión ácido-alcohol resistente de fucsina a
Ziehl-Neelsen Micobacterias (BAAR*)
de Metileno ácidos micólicos de pared (fucsia)
Micobacterias
Auramina – Rodamina Unión de auramina-rodamina al ácido
Auramina / rodamina (mayor sensibilidad que
Permanganato de Potasio micólico de la pared (fluorescencia amarilla)
Ziehl Neelsen)

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Utilidad clínica de la tinción de Gram:
Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de una infección, que muchas
veces sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.
La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de
100.000 bacterias /ml de muestra.
La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un test
positivo) varía según tipo de muestra:
Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %
Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%
Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%
Líquido articular (artritis séptica) : 50%
Se debe solicitar en toda muestra clínica
De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues si
bien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
OBJETIVOS
1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo sólido (Placas
de Agar) de acuerdo a criterios macroscópicos.
2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula y
tinción de esporas.
3. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.
4. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.
5. Observar diferentes preparaciones fijadas y describirlas
OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS
1.- Siembre mediante técnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el
laboratorio tanto en agar sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37ºC por 24hrs.

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2.- En la siguiente sesión de trabajo práctico observe y describa las colonias desarrolladas en
los distintos medios, según sus características macroscópicas (figura 1).
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS
1. Observación de muestras fijas.
Observar en el microscopio óptico con un aumento de 100X (usando aceite de inmersión), la
serie de preparaciones teñidas fijas (colección en caja) e identificar la forma, agrupación y
afinidad tintorial.
2. Tinción de Esporas.
Procedimiento :
a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamaño de una arveja) sobre el portaobjeto.
b. Esterilizar el asa y obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus sp.
c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque
completamente (sin hervir).
d. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.
e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregar solución colorante Verde
de malaquita. El colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con
el frotis bacteriano.
f. Esta tinción se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra
encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 3 min. No
sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.
g. Si la emisión de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.
h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de
malaquita y el papel.
i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.
j. Lavar con agua.
k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.

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A B
C D
Papel
Absorbente
E F G
Verde Malaquita
Safranina
Figura Nº 3: Procedimiento Tinción de Esporas.
Localización y morfología de las esporas en Bacillus
NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño que
las bacterias) son pequeñas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas
intracelulares. En estas últimas se determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de
la célula y, si la espora deforma o no al bacilo.

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3. Tinción de Cápsula.
Procedimiento:
a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamaño de una arveja.
b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregar
la bacteria). La Tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo
mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.
d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegúrese de
esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.
e. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto
se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que
contiene la mezcla Tinta china-bacteria. Ver figura.
f. Fijar suavemente en el mechero.
g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.
h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.

29. 29
A B
C D
E F
Fucsina
Bacterias
Cápsula
Figura Nº 4: Procedimiento Tinción de Cápsula.

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4. Análisis Microscópico mediante tinción de Gram
1. Realice tinción de Gram a las muestras que Ud. sembró y observe al microscopio.
Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámetro).
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa.
f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.
g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.
Tinción frotis mediante Gram
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejar
con Lugol por 1 min.
d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente,
hasta que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-
acetona y luego con agua)
e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
2. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión.
Caracterizar según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) los
microorganismos.

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TRABAJO PRÁCTICO N°3
FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLÍNICAS DE
BACTERIAS GRAM POSITIVO
Como en la mayoría de los animales, el organismo humano posee lugares que
normalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, una
gran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aún en las personas más
sanas. La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores
(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los
mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos,
piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal
del ser humano.
La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros
microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del
área perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotas
características de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y probablemente se
derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.
Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de substancias alimenticias, que favorecen
el crecimiento de saprófitos.
Zona boca, región orofaríngea y vulva: Con substancias provenientes del exterior o
acumulación de restos celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia
de anaerobios.
Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido
lipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente.
Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en número a las formas facultativas y
aerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una interacción permanente entre los
componentes de la flora y el hospedero, que provoca fluctuaciones en la biota, tanto
cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones incluyen los beneficiosos,
inaparentes, hasta los perjudiciales.

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Algunos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de las
diferentes regiones del cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son:
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus
salivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como
Clostridium tetani.
La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram
positivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fúngica como
Candida albicans.
Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través de
la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos son
atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos nasales, la tráquea, los
bronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La nasofaringe es el hábitat natural de
bacterias y virus patógenos que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios y
pulmones.
Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos
descargando estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.
Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin
embargo este equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crítica
- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.
Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a una
infección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se
produzcan estas enfermedades, como son:
- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.
- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugías.
- Uso de antibióticos.
Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:

33. 33
- Infección urinaria por Enterobacterias.
- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)
- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de
antibióticios.
ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
Para llegar a la identificación de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El
primero implica la toma de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados según la
sospecha clínica.
El segundo paso corresponde al examen microscópico directo, con o sin tinción.
El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de
cultivo adecuados donde la muestra y las bacterias, que ésta pudiese o no contener, puedan
encontrar los nutrientes y factores adecuados para propiciar su crecimiento y desarrollo.
El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrirá a determinar su
morfología bacteriana como su posible agrupación, y se aplicará distintas pruebas
bioquímicas y fisiológicas destinadas a conocer sus características metabólicas.
Por último se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.
TOMA DE MUESTRA
EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO (Gram o Ziehl-Neelsen)
AISLAMIENTO DEL AGENTE
IDENTIFICACIÓN FISIOTAXONÓMICA DEL AGENTE
Tinción: Morfología y agrupación; Pruebas Bioquímicas
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
INFORME

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SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA
ESTUDIOS MICROBIOLOGICOS.
En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más importante
es la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico.
Esta recolección comprende cuatros pasos importantes:
1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra.
2. Usar la técnica más apropiada.
3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los
microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la
filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el personal
que posteriormente la manipula.
4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de que
esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los
medios de transporte adecuados.
Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo
etiológico real, y la recuperación de contaminantes puede llevar a indicar una
antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso perjudicial. Debe recordarse entonces, que “la
calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior a la calidad de la
muestra recibida”.
Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte activa,
es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar, para lograr
así su colaboración y participación, lo que lleva a la obtención de la muestra en óptimas
condiciones.
Recolección y transporte de la muestras:
Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por
aspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%,
seguido por povidona yodada, la que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si
el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol.
Volumen. Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no debieran
usarse tórulas. El volumen de muestra que se envía al laboratorio es generalmente menor de
lo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos para cada tipo de muestra.

35. 35
Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes métodos de recolección, desde la tórula
hasta aparatos recolectores de muestra.
Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de
calcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estéril con
un medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar envases plásticos
estériles, o tubos con tapa rosca.
Técnicas de recolección. Con el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación del
agente etiológico es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante.
Medio de transporte. No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para ciertas
técnicas específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la pérdida de la
viabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se usan tórulas, en el
caso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio,
el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio
de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su
envío al laboratorio.
PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS
MICROBIOLOGICAS DE DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS
INFECCION TRACTO URINARIO (ITU)
(Orina, secreción uretral y prostática)
UROCULTIVOS
Muestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y
retrayendo el prepucio en el varón durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de
orina, a fin de arrastrar mecánicamente la flora externa del tracto genitourinario.
Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptáculo estéril y sin interrumpir la micción.
Tener presente de poner un tapón vaginal en la mujer a fin de evitar contaminación con la
flora vaginal.
Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las
primeras dos horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4º C y trasladarla manteniendo
la cadena de frío.

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Muestra por punción de catéter urinario: Desinfectar el sitio de punción del segmento
proximal del catéter con alcohol 70%, aspirar con jeringa estéril entre 2 a 5 ml de orina,
vaciar en tubo estéril y transportarla al laboratorio de la misma forma que la muestra
miccional.
Muestras por punción suprapúbica: Antisepsia de la piel en el sitio de punción, aspirar
con técnica aséptica entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual
forma que los casos anteriores.
Secreción uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secreción en tórula
estéril, colocar en medio de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera
hora de la mañana o después de una hora de orinar.
Secreción prostática:
La técnica de recolección es exprimir la próstata a través de un masaje prostático por vía
rectal e impregnar una tórula estéril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.
INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)
(Neumonía, TBC)
TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS
Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger
la muestra en receptáculos estériles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no
es posible mantenerla refrigerada transitoriamente a 4º C por no más de dos horas. Es
recomendable facilitar la expectoración con kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En
pacientes intubados realizar la aspiración endotraqueal con sonda estéril y técnica aséptica,
introducirla evitando su contaminación con gérmenes exógenos y aspirar depositando el
contenido en tubo estéril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este último
tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el
diagnóstico etiológico en pacientes conectados a ventilación mecánica.
TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS
Cuando se trata de identificar el agente etiológico de neumonía nosocomial, las muestras que
tienen mejor rendimiento; pero también mayores riesgos para el paciente, son aquellas
tomadas por broncoscopías (lavado broncoalveolar, aspirado telescopado protegido),
Toracocentesis y Biopsia.

37. 37
Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a través de broncoscopía y con
técnica aséptica aspirar entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo
estéril al laboratorio para su estudio.
Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopía introducir cepillo a través del catéter
protegido frotar la zona alterada y enviar en tubo estéril de inmediato al laboratorio para
estudio semicuantitativo. *
Toracocentesis: Realizar el procedimiento con técnica aséptica, aspirar 10 ml si es posible.
Transportar de inmediato al laboratorio para su estudio.
Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con técnica aséptica, enviar un trocito de tejido
en tubo estéril o en medio de transporte con caldo específico. Trasladar la muestra de
inmediato para su estudio.
*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumonía
es:
Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal
Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido
Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar
INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)
Secreción faríngea: Deprimir la lengua y frotar con tórula estéril amígdalas, pilares
anteriores y pared posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de
inmediato al laboratorio, si no es posible la muestra se mantiene transitoriamente a
temperatura ambiente.
Secreción nasal: Introducir tórula estéril más o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y
colocar en medio de transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra
transitoriamente a temperatura ambiente
INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)
(Superficial, profunda abscesos cerrados)
Infección superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular
subcutáneo.
Infección profunda: son aquellas que incluyen fascia y músculo, pudiendo comprometer o
no cavidades u órganos.

38. 38
Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiológico o Ringer, frotar con
tórula estéril el centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de
transporte y enviar al laboratorio para su siembra y estudio
Toma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiológico o Ringer,
tomar la muestra con tórula de la parte más profunda de la herida, colocar en medio de
transporte y enviarla al laboratorio.
Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antisépticos la superficie y los bordes de la
herida, aspirar de la zona profunda de la herida 0,5 ml de secreción y enviar en la misma
jeringa sellada al laboratorio, teniendo la precaución de eliminar toda burbuja de aire de su
interior.
Si no es posible aspirar material, introducir tórula en lo más profundo de la herida y
colocarla en tioglicolato. De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido
(6 mm) con pinza estéril y dejarlo caer en el tioglicolato o en suero fisiológico e incluso en
tubo estéril sin ningún preservante.
Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de punción con antiséptico, aspirar material en lo
posible 10 ml y vaciar a tubo estéril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios
enviar en la misma jeringa sellada, eliminando todo el aire remanente.
COMENTARIO
Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH ácido de este material
destruye rápidamente los microorganismos, siendo difícil su aislamiento posterior a la
siembra.
INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS
Secreción conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estéril, frotar con
tórula humedecida el borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte
para su envío al laboratorio.
Secreción ótica: Limpiar el canal auditivo con jabón antiséptico, tomar la muestra con
tórula estéril y colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio.

39. 39
Secreción umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza,
colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.
COMENTARIO.
Las muestras tomadas por punción ocular u ótica deben ser enviadas en la misma jeringa o
en caldo de cultivo tioglicolato.
INFECCIONES GINECO – OBSTETRICAS
Endocervix: Previo aseo genital, introducir tórula hacia el canal cervical y rotar, colocar la
tórula en medio de transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseria
gonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de Thayer Martin en Z la que debe ser solicitada
previamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al laboratorio en receptáculo
con una fuente que consuma oxigeno.
Endometritis: A través de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa con
catéter protegido. Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado en
tioglicolato. NO REFRIGERAR.
Douglas: Aspirar por punción del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en la
misma jeringa tapada como para estudio de anaerobios.
Secreciones vaginales: Para estudio bacteriológico y de hongos. A través de un especulo
frotar con tórula estéril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco,
colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.
Para Trichomonas, introducir suero fisiológico tibio, recoger y vaciar en tubo estéril de 3 a 5
ml. Enviar de inmediato al laboratorio.
Líquido Amniótico: Obtener por punción, previa desinfección con antiséptico y enviar al
laboratorio en la misma jeringa o en tubo estéril entre 5 a 10 ml de muestra.
Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirúrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar en
tubo estéril o caldo tioglicolato como para estudio de anaerobios.
Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la cirugía y enviar tejido o aspirado de la
misma forma que para estudio de anaerobios.
COMENTARIO

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En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiológicos no son necesarios para su
notificación ya que es suficiente el criterio clínico, por otra parte la etiología es
polimicrobiana y predecible.
En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectar
Streptococcus beta hemolitico grupo A u otro agente no habitual.
MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES Y
CATETERES
Líquido cefalorraquídeo
Previa desinfección de la zona con antiséptico y con técnica aséptica, obtener entre 2 a 3 ml
de muestra y en tubo estéril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla al
momento, transitoriamente debe mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.
Líquido ascítico
Aspirar idealmente 10 ml de muestra a través de punción abdominal con técnica aséptica,
vaciar a frasco de hemocultivo y simultáneamente 1 ml en tubo estéril seco para tinción en
laboratorio.
Lecha Materna
Limpiar el pezón previo a extracción de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre
2 a 5 ml en tubo estéril. Enviar de inmediato al laboratorio.
Cateter
La cateterización venosa se define como la inserción de un catéter biocompatible en el
espacio intravascular, central o periférico, con el fin de administrar soluciones,
medicamentos, nutrición parenteral, medios de contraste y realizar pruebas diagnósticas,
entre otros.
Para cultivar catéteres vasculares, existen 2 técnicas.
1.- Cortar de forma aséptica la punta del catéter e introducirla en un tubo con caldo corriente.
Esta técnica tiene la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por lo
cual, no se puede asegurar que en un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda a
una contaminación con flora de piel.

41. 41
2.- Cortar de forma aséptica la punta y el segmento intracutáneo del catéter. Introducir en un
frasco o tubo estéril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando una
pinza estéril, hacer rodar el catéter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces hacia
adelante y hacia atrás (técnica de Maki). Es una técnica semicuantitativa que permite realizar
el recuento de colonias y, basándose en este recuento, determinar con mayor exactitud si un
cultivo positivo corresponde a contaminación con flora de piel o a infección relacionada con
el catéter.
Catéter venoso central tunelizado. Catéter venoso central implantable.
INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)
Coprocultivos
Introducir tórula limpia en la zona más alterada de las deposiciones recién emitidas (mucus o
sangre) y colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse
directamente del recto, del pañal o receptáculo limpio.
Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de
transporte. Las muestras tomadas por rectoscopía o colonoscopías tienen mayor rendimiento,
por cuanto de ser posible es recomendable obtener las muestras de esta forma.
Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recién emitidas en tubo o
frasco limpio y seco.
Aspirado gástrico en RN
Aspirar por sonda nasogástrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estéril. Sólo se
justifica esta muestra en las primeras 24 horas de vida.

42. 42
FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO
La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de
las alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido
establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentes
géneros y especies.
Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especies
bacterianos en base a la detección de:
a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol,
Citrato.
b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol,
CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol.
c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa.
d. Sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina, Optoquina,
Novobiocina.
Para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos métodos, en
cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.
En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más
importantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae (figura 1).
La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y
Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son
catalasa positivo, reacción que diferencia la Familia Micrococcaceae de otros cocos Gram
positivo como Streptococcus.

43. 43
Agrupación de
algunas cocáceas
Gram +
Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en la piel
de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia
de las especies del género Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otra
característica que diferencia ambos géneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentar
glucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus que no tienen esta propiedad (Tabla 1).
Las principales especies del género Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas y
enzimas responsables de su patogenicidad. Algunas enzimas son:
a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por las
bacterias.
b. Fibrinolisina: Disgrega coágulos de fibrina.
c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana,
coagulando el plasma.
d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.
Las toxinas producidas por S. aureus causan los síntomas asociados a las enfermedades
estafilocócicas. Estas toxinas son:
a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteína
antigénica de peso molecular 30.000.

44. 44
b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulación de los leucocitos y
macrófagos.
c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el síndrome de piel quemada.
d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.
Aislamiento y Caracterización:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es un
alimento o una muestra clínica.
Para muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:
a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada de
cordero o conejo. Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus y
además visualizar la producción de hemolisinas, por lisis de los glóbulos rojos alrededor de
las colonias (figura 2).
S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por la
alfa toxina.
S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.
Micrococcus: no produce hemólisis.
Tipos de hemólisis en agar sangre

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TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO
Cocaceas Bacilos
Catalasa Catalasa positivo
Positivo Negativo Aspecto Tinción Gram
Test de Bacitracina Streptococcus
R S
Observar Hemólisis
Test de Coagulasa Micrococcus Bacilos Grandes
(+) (-) Esporulados
Hemólisis Hemólisis Hemólisis Bordes netos
Alfa Beta Gamma
Staphylococcus aureus Staphylococcus
Coagulasa negativo Bacillus sp
Test de Latex Bilis Esculina
Optoquina Optoquina NaCl 6,5 %
Test de Novobiocina Bacilos finos
resistente sensible
S R Streptococcus Enterococcus
Grupo A, B, C, Listeria
S. Coagulasa negativo Staphylococcus D, F, G
No saprophyticus saprophyticus
Streptococcus Streptococcus Bacilo en empalizada
grupo viridans pneumoniae
Corynebacterium sp
Bilis positivo
NaCl positivo
Enterococcus

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b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencial
que contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y
Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración de
NaCl. Además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje del
indicador a amarillo.
S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la
fermentación)
S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus: no fermenta el manitol.
En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción de
Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar
colonias semejantes.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en medios
selectivos se realiza las pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico. Si se sospecha que
la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.
La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de Staphylococcus
aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de puentes entre bacteria y
bacteria, formándose un coágulo.
Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.
Ésta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, según el
tipo de enzima:
a) Técnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo con
gotas de cultivo líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición
de un coágulo a las 4 horas.
b) Técnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo de
Staphylococcus en medio sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua.
Esta suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas de
plasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de las
bacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de aglutinación, que será empleado
en el laboratorio.
Test comercial de aglutinación: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros
Staphylococcus. La metodología consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre un
círculo de la tarjeta; a continuación se emulsiona sobre ésta la colonia sospechosa, se agita

47. 47
durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera positiva. Siempre se
debe realizar un control negativo incluído en el kit (figura 3).
Partículas de latex
Bacterias Aglutinación de las partículas
con anticuerpo
Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.(proteína A)
A su vez el Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativos
que se disponen en pares o cadenas y son catalasa negativo reacción que los diferencia de la
Familia Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o
alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales
como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la
industria lechera para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus
lactis).
Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:
1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadas
en placas de agar sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.
b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (S. viridans)
alrededor de las colonias.
c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis

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2.-SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: clasificación
de Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbono
presente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos que
van desde la A hasta la U.
Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos beta
hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno.
Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc.
Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agente
causante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tiene
forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una
cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben
incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa
hemólisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium). Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y
animales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan
porque generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad
(NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos no
pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.
Aislamiento y Caracterización:
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa de
agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:
1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias,
las cuales son muy pequeñas.
Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena,
ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez
confirmada su presencia se realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A
(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar a
un antibiograma. Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo no son beta
hemolíticos.

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b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante
reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.
c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:
Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y pueden
hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus de
otros cocos gram (+) catalasa-negativo. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se
torna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.
d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los
descubridores del fenómeno
La mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible (factor
CAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas de
Staphylococcus aureus causando la hemólisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangre
se inocula los Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a una estría central de
Staphylococcus aureus. Tras la incubación se observa la presencia de una zona hemolítica en
forma de punta de flecha en el área de intersección, donde el factor CAMP y la beta-hemolisina
han difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus del
grupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.
Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:
Método de Difusión en Agar o Kirby-Bauer
Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos
antimicrobianos. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre

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una placa de agar donde se coloca discos de papel filtro estériles impregnados con una
concentración conocida de antibiótico.
Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas
condiciones de laboratorio:
a) Concentración de bacterias que se siembra. Requiere uso de estándares de turbidez: Mac
Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Müller-Hinton o agar Müller-Hinton Sangre para
Streptococcus
c) Concentración del antimicrobiano en el disco: característica para cada antimicrobiano.
d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)
A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara una
suspensión bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de la
suspensión debe ser homogénea sobre el agar (figura 4).
El antibiótico en los discos difunde radialmente durante la incubación de tal manera que a
medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, la
concentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,
produciéndose entonces una zona circular de inhibición (halo de inhibición) alrededor del
disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de
“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el
“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.
Figura 4: Antibiograma mediante la técnica de
difusión con discos
Bacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogéneamente. Se coloca un disco de
bacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.

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Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥10 mm de diámetro y resistente
cuando el halo de inhibición es < 10 mm de diámetro.
Micrococcus es sensible a bacitracina.
Staphylococcus es resistentes a bacitracina.
Optoquina: compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular
bacteriana. A bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae
(sensible) de otros Streptococcus hemolíticos. El disco de Optoquina se deposita en una placa
de agar sangre, sembrada homogéneamente con la colonia sospechosa. Se incuba a 37°C por
24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae.
Novobiocina: antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por
S. aureus e infecciones urinarias resistentes a otros fármacos. Es bacteriostática e interfiere con
la síntesis de la pared bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está
asociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas
resistentes. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥16 mm de diámetro y
resistente cuando el halo de inhibición es < 16 mm de diámetro.
Amoxicilina / Ácido Clavulánico: esta asociación se indica para el tratamiento a corto plazo
de infecciones bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que están
causadas por cepas resistentes a Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otras
situaciones, debería considerarse la Amoxicilina sola.
Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis
recurrente. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.
Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de
bronquitis crónicas, bronconeumonia. Éstas son a menudo producidas por Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.
Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis
(especialmente cuando sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto séptico,
sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal. Son a menudo producidas por

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Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y
Enterococcus spp.)
Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y
abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas de estos gérmenes producen
beta-lactamasas, de modo que no responden a Amoxicilina sola.
NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Objetivos
1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra
2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas a
partir de muestras clínicas así como de flora normal
3. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo
4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas.
5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.
I. MUESTRAS CLÍNICAS
1. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las colonias
bacterianas. Observe si se trata de cultivos puros.
2. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al
microscopio con aumento 100X oil.
Recuerde que en el caso de cocáceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupación
bacteriana y el tipo de hemólisis para el diagnóstico.

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3. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de
bacterias Gram positivo.
a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2.
La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepción
es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar
Staphylococcus, Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa +, de Streptococcus, catalasa -.
Procedimiento Prueba de la catalasa
a) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2
b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto.
La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).
Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya que
estas sustancias dan falsos positivos.
c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.
d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivos
b. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus
aureus.
Procedimiento Prueba de la Coagulasa:
a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.
b) Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar.
c) Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).

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d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.
e) Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva. Si
se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa.
f) Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.
c. Test de CAMP para Streptococcus
Permite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona de
hemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se
denomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)
Procedimiento Test de CAMP:
a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de un
cultivo de Staphylococcus aureus.
b) Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica.
c) Incubar a 37ºC por 24 horas.
d. Identificación de Streptococcus β hemolítico por aglutinación con látex:
Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus β hemolítico grupo A, B,
C, D, F y G.
Procedimiento prueba de aglutinación con látex:
a) Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta de
aglutinación.
b) Tome dos a tres colonias β hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que deben
pertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas gram (+) en cadenas.

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c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante 1MINUTO
4. Realice el Test de difusión por disco. Sensidiscos.
a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo de
suero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.
b) Tome la tórula estéril y (sin flamearla!!!!) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee la
boca del tubo y cierre.
c) Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton (Staphylococcus) o agar
Müller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente apropiado.
d) Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos
(5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden
demasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí.
e) Incubar a 37ºC por 24 horas.
RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificado
en su muestre clínica.
Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa de
la placa antes de sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.
Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelos
suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!).
Lectura e interpretación del Test de Sensidiscos
a) Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria es
“susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar.
Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.
b) Anote sus observaciones.
5. Procesamiento de una muestra clínica de catéter venoso con técnica de Maki
a) En una placa de Agar Sangre, siembre con técnica de Maki la muestra de catéter venoso
entregada.
Utilice pinza estéril e incube a 37ºC por 24 hrs.
b) Describa macroscópicamente las colonias obtenidas.
c) Observe si se trata de un cultivo puro. Realice recuento de colonias bacterianas.