1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
Sản xuất protein tái tổ hợp trên E.coli
INSULIN
2. Nhóm:
1. Trần Thị Huyền Trân 61003158
2. Huỳnh Thị Trúc 61003267
3. Lê Thị Thúy Quyên 61003118
4. Nguyễn Thị Kim Thao 61003132
5.Huỳnh Thị Thanh Trúc 61003268
6.Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080
7.Trần Nguyễn Hương Trang 61003262
5. Thời gian bắt
Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian hết tác
đầu tác dụng
dụng
Tác dụng nhanh
- Insulin Trong Người 30 phút (tiêm dưới 8h
Actrapid HM Lợn da)
- Insulinum
maxirapid
Tác dụng bán
chậm Đục Người 1h 20h
- Insulatard HM Lợn 18h
- Insulin
Lente
Loại pha trộn
-Mixtar HM Đục Người 30 phút 20h
30/70
Tác dụng rất
chậm Đục Bò 4h 30h
-Utra – Lente
6. III/ Cơ sở khoa học của công nghệ sản
xuất insulin
1. Cấu trúc phân tử insulin: Insulin người là 1
polipeptide
Bao gồm:
- Chuỗi A 21 aa
- Chuỗi B 30aa.
Có 1 cầu nối
disulfur giữa 2
chuỗi A và 2 cầu
nối giữa 2 chuỗi A
và B.
CTHH: C257H383N65O77S6.
Trọng lượng phân
tử: 5808
8. 2. Vai trò của insulin:
Insulin làm tăng tính hấp thụ của các acid
amin.
Thúc đẩy sự sinh tổng hợp các acid béo trong
gan
9. Insulin làm tăng tính thấm của các ion kali,
magie và phosphate vô cơ tạo điều kiện cho
quá trình phosphoryl hóa và sử dụng
glucose.
10. IV/ Công nghệ sản xuất insulin:
Năm 1922, Fred
Banting và
Charles Best
thuộc Đại học
tổng hợp Toronto
(Canada) thông
báo họ đã tìm ra
insulin và ứng
dụng chất này
trong điều trị
bệnh tiểu đường
ở người.
11. Nhược điểm:
+Insulin từ động vật có cấu trúc không hoàn toàn giống
insulin người.
+ Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin
người.
+ Khả năng hấp thụ kém.
+ Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể.
+ Trong quá trinh tách chiết không thể loại bỏ hết các
tác nhân gây bệnh ở động vật.
+ Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao.
+ Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để sản xuất) => giá
thành cao.
+ Khó sản xuất lượng lớn với qui mô công nghiệp.
12. V/ Công nghệ sản xuất insulin tái
tổ hợp trên E.coli:
1. Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo
phương pháp mini proinsulin (MPI):
13. Bước 1: bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh
học phân tử tách được gen mã hóa
proinsulin người trên NST số 11
14. Bước 2: Tách và thiết kế plasmid tái tổ hợp
- Cắt gen mã hóa proinsulin và plasmid bằng một loại
giới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4.
- Thiết kế các trình tự mã hóa cho các protein tín hiệu
giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.
- Nếu sử dụng mRNA tách được từ trên tiến hành như
sau:
+ Sao mRNA tinh khiết thành cDNA nhờ enzyme phiên
mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT –
PCR).
+ Cài đoạn cDNA mã hóa insulin hoàn chỉnh vào
plasmid đứng sau một promoter mạnh. Biến nạp
vector tái tổ hợp vào E.coli.
15. Chủng E.coli: BL21 DNA mã hóa 8 – 12 aa
TNF-α và His10 được
(DE3) tổng hợp hóa học.
Gen: T7 RNAP
Promoter lacUV5 Cắt bằng NdeI và
BamHI
Plasmid
T2 Chèn vào downstream
T7 promoter
Biểu hiện trong pET-3a
Cắt bởi endonuclease
Thu pT2
16. Gen mã hóa cho proinsulin người
Plasmid PCR
pT2-hPI (5 DNA overlapping, mỗi đoạn 65
– 68 base như mẫu)
Cắt bằng BamHI và HindIII
Chèn vào pT2
pT2-hPI
17. Plasmid pT2M2PI:
Plasmid Gen mã hóa M2PI đem PCR
pT2M2PI: (gen proinsulin người làm mẫu DNA)
Cắt bằng BamHI và HindIII
Chèn vào pT2
pT2M2PI
18.
19. Bước 3: Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp
trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện. Sau quá trình biến
nạp cần chọn lọc những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn.
Bước 4: Các vi khuẩn
chuyển gen sau đó được
đưa vào lên men.
Nuôi chúng trong nồi lên
men sử dụng phương
pháp nuôi cấy liên tục,
các chất dinh dưỡng
được bổ sung thường
xuyên để đảm bảo sự
tăng trưởng của vi
khuẩn theo hàm số mũ.
Sau 20 phút có hàng
triệu vi khuẩn được
nhân lên qua nguyên
phân. Chỉ sau 1 thời
gian ngắn, sinh khối
tăng lên rất nhanh và
gen insulin được tổng
hợp
21. Sơ đồ biểu hiện mini proinsulin trong plasmid
pT2M2PI
22. Bước 5: Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần tách tế bào và
khử trùng nhiệt.
+ Dùng enzyme lizozyme phá vỡ
màng tế bào sau đó dùng hỗn hợp
chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit
+ Bằng phương pháp ly tâm lọc và
tách được proinsulin.
23. Bước 6: Hoạt hóa
Hoạt hóa proinsulin vitro (sau tinh
sạch ở dạng mạch thẳng) bằng cách
xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt
cấu trúc bậc 4 (tạo phản ứng xoắn
cuộn), sau đó dùng enzyme đặc
hiệu trypsin để phân cắt proinsulin.
Khi đó sản phẩm thu được mới có
hoạt tính cần thiết.
24.
25. Phản ứng xoắn cuộn
+ 50mM glycine buffer mini proinsulin
tinh sạch
(50 µM, 0.375 mg/l)
+ 2-mercaptoethanol phản ứng cuộn
xoắn
(bằng 2 lượng mini proinsulin) (18h, 4oC)
↓
+ H3PO4 đến pH 2.5 Dừng phản
ứng
↓
Tinh sạch
(Reverse-phase HPLC)
` ↓
So sánh peak với mini proinsulin
xoắn cuộn với insulin
26. Bước 7: Hỗn hợp
tinh sạch chỉ còn
có insulin
+ Bằng phương pháp
sắc ký, tách, và
phương pháp miễn
dịch gắn enzyme.
27. 2. Sinh tổng hợp insulin theo phương pháp 2 chuỗi: