Apostila prática de microbiologia industrial

Universidade do Estado do Rio de
Janeiro
FACULDADE DE TECNOLOGIA
ENGENHARIA DE PRODUÇÃO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS
Professora Denise Celeste G. de A. Rodrigues

Índice
1. Considerações Gerais sobre Segurança no Laboratório.............................................. 1
1.1. Noções de Biossegurança ....................................................................................... 1
1.2. Normas de segurança no laboratório de microbiologia............................................ 5
2. Preparação de culturas microbianas............................................................................... 7
2.1. Procedimentos assépticos: ...................................................................................... 7
3. Aula prática 01: Presença de Microrganismos no Ambiente .........................................10
3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri.........................................................10
3.2. Exposição das placas a diferentes ambientes..........................................................11
3.3. Relatório ...............................................................................................................11
4. Considerações Gerais sobre Desinfecção e Esterilização ..............................................12
4.1. Esterilização:.........................................................................................................12
4.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) ................................13
4.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido ......................................................................14
5.1.3. Controle da Esterilização ................................................................................15
4.2. Desinfecção...........................................................................................................16
4.2.1. Desinfecção por agentes físicos: .....................................................................16
4.2.2. Desinfecção por agentes químicos: .................................................................16
5. Aula prática 02: Desinfecção........................................................................................20
5.1. Identificação das Placas de Petri............................................................................20
5.2. Desinfecção das mãos e inoculação das Placas de Petri..........................................20
5.3. Relatório ...............................................................................................................21
6. Aula prática 03: Testando produtos de limpeza..........................................................22
6.1. Procedimento ........................................................................................................22
6.2. Relatório ...............................................................................................................22
7. Microscopia .................................................................................................................23
8. Aula prática 04: Microscopia a Fresco..........................................................................26
8.1. Sem corante...........................................................................................................26
8.2. Com corante..........................................................................................................26
8.3. Com outras culturas...............................................................................................27
8.4. Relatório ...............................................................................................................27
9. Aula prática 05: Microscopia de Gram .........................................................................28
9.1. Esfregaço de cultura bacteriana sólida: ..................................................................28
9.2. Adição de Corantes: ..............................................................................................28
9.3. Relatório ...............................................................................................................29
10. Aula prática 06: Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio
sólido...............................................................................................................................30
10.1. Preparação de uma série de diluições decimais de uma cultura de leveduras........30
10.2. Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio sólido..........32
10.3. Relatório .............................................................................................................33
11. Aula prática 07: Isolamento de microrganismos de tecido vegetal ..............................34
11.1. Desinfecção superficial........................................................................................34
11.2. Inoculação e incubação........................................................................................34

11.3. Relatório .............................................................................................................34
12. Aula prática 08: Isolamento de microrganismos do ar.................................................35
12.1. Exposição das placas – método da sedimentação .................................................35
12.2. Relatório .............................................................................................................35
13. Aula prática 09: Estragando o mingau ........................................................................36
13.1. Procedimento ......................................................................................................36
13.2. Relatório .............................................................................................................36
14. Aula prática 10: Microrganismos em Processos Biotecnológicos................................37
14.1. Procedimento ......................................................................................................37
14.2. Relatório .............................................................................................................37
15. Confecção dos relatórios ............................................................................................38

Apostila das aulas práticas de Microbiologia Industrial
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 1
1. Considerações Gerais sobre Segurança no
Laboratório
A segurança num laboratório de microbiologia envolve implementação de
procedimentos particulares, associados às metodologias necessárias para manipular
culturas microbianas. Por um lado, devido às reduzidas dimensões das células, que para
nós são imperceptíveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares
puras e/ou impuras, as quais podem conter um número elevadíssimo de células
microbianas. Em qualquer espaço laboratorial, os procedimentos realizados devem incluir
o cumprimento de regras de funcionamento, de medidas de segurança obrigatórias e o
manuseamento correto e cuidadoso do material, dos reagentes químicos e do equipamento
laboratorial. Atender a estes princípios contribui para a prevenção de acidentes e para
impedir a existência de fontes de contágio ou de perigo no local de trabalho.
1.1. Noções de Biossegurança
Conceitos de biossegurança:
“Condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a
prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes às atividades que possam
comprometer a saúde humana, animal e vegetal e o meio ambiente.” (Comissão de
Biossegurança em Saúde, 2002)
“É o conjunto de ações voltadas para prevenção, minimização ou eliminação de
riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico
e prestação de serviços, as quais possam compromete a saúde do homem, dos animais, das
plantas, do ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos.” (Comissão de
Biossegurança da Fundação Oswaldo Cruz, 2003)
Os acidentes em laboratórios de microbiologia envolvem risco biológico em
contrair infecções por microrganismos patogênicos. Estão sujeitos a estas infecções desde

os técnicos, pesquisadores, até o pessoal da limpeza e lavagem de materiais de laboratório,
podendo ocorrer através:
 da pele - projeção de culturas microbianas sobre a pele escoriada, picadas
de agulhas contaminadas, mordida de animais inoculados, etc.
 das vias digestivas e mucosa bucal - ingestão de alimentos e bebidas
durante o trabalho, insuficiente desinfecção das mãos antes de comer ou
fumar, etc.
 das vias respiratórias e mucosa nasal - aspiração de aerossóis
contaminados, projeção de culturas contaminadas, etc.
 dos olhos e ouvidos - projeção de culturas microbianas, insuficiente
desinfecção das mãos, etc.
Os agentes biológicos responsáveis pelas infecções laboratoriais são classificados
em grupos de risco, baseado nos seguintes fatores:
 Capacidade patogênica do agenteModo de transmissão e hospedeiros
susceptíveis - pode depender dos níveis de imunidade, da densidade
populacional, da presença de vetores apropriados e das normas de higiene
ambiental
 Disponibilidade de medidas de prevenção eficazes - profilaxia (vacinas e
soros); luta contra reservatórios de artrópodes vetores e importação de
animais ou produtos de animais infectados
 Disponibilidade de tratamento eficaz - imunização passiva e vacinação
(exposição); administração de antibióticos e quimioterapia
Empregando-se tais critérios tem-se a seguinte classificação dos agentes biológicos
por grupo de risco:
 Grupo de Risco 1 (riscos: individual e comunitário baixo)
Microrganismos com pouca probabilidade de provocar doenças humanas ou
doenças de importância veterinária nos animais.
 Grupo de Risco 2 (riscos: individual moderado e comunitário limitado)

Microrganismos que podem provocar doenças humanas ou enfermidade
animais, mas que possuem poucas possibilidades de causar um risco grave
para: pessoal de laboratório, comunidade, agropecuária e meio ambiente.
Exemplos: bactérias (clostrídios, salmonelas); parasitas (toxoplasmas,
giárdias) e vírus (enterovírus, vírus da influenza)
 Grupo de Risco 3 (riscos: individual elevado e comunitário baixo)
Microrganismos que provocam doenças graves em humanos, mas que não
se propagam de uma pessoa infectada à outra. Tratamento e medidas
preventivas eficazes.
Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, vírus da raiva
 Grupo de Risco 4 (riscos: individual e comunitário elevados)
Microrganismos que provocam enfermidades graves em humanos e podem
propagar-se de um indivíduo a outro, direta ou indiretamente. Não existe
tratamento, vacinas e medidas preventivas eficazes disponíveis.
Exemplos: febre hemorrágica, Congo-Crimean
 Classe de risco especial (riscos: alto risco de causar doença animal grave e
de disseminação no meio ambiente):
Inclui agentes biológicos de doença animal não existentes no País e que,
embora não sejam obrigatoriamente patógenos de importância para o
homem, podem gerar graves perdas econômicas e/ou na produção de
alimentos.
Exemplos: Vírus da influenza A aviária ; Vírus da peste eqüina africana
As ações a serem implementadas, visando a biossegurança, compreendem medidas:
 educacionais – treinamento individual e coletivo
 administrativas – estrutura organizacional, organização e métodos, sistemas
de documentação
 técnicas - programa de garantia e controle de qualidade, programa de
prevenção de acidentes, sistemas de documentação
 médicas – programa de medicina ocupacional
Na tabela 1 encontram-se algumas recomendações para os níveis de biossegurança.

TABELA 1: SUMÁRIO DAS RECOMENDAÇÕES DOS NÍVEIS DE
BIOSSEGURANÇA POR AGENTES INFECTANTES
Nível de
Biossegurança
Técnicas e Práticas Equipamentos de Segurança Instalações
1 Boas práticas de laboratório
microbiológico (aventais,
não pipetar com a boca,
autoclavar materiais
infectantes)
Equipamentos básicos
*bancadas que permitem
limpeza adequada
*sala com porta
*autoclave, etc
básica
2 Práticas do nível 1, mais:
*descontaminação de todos
os resíduos infectantes
*limitado acesso
*proteção com luvas e
sinalização de biossegurança
*manipulação de seringas,
agulhas
*manipulação de
biossegurança
Requisitos do nível 1, mais:
*câmara de fluxo laminar de
segurança biológica classes I e
II, para conduzir procedimentos
e manipular amostras com alto
potencial de produzir aerossóis
*luvas, máscaras especiais para
amostras com exposição
ocupacional aumentada
*sinalizações
básica
3 Idem ao nível 2, mais
*aventais especiais e acesso
controlado com mais rigor
*sinalização especial, luvas e
máscaras
*câmara de fluxo laminar pra
toda manipulação do agente
*linhas de vácuo protegidas
com filtro
*dupla porta de segurança
Requerem
instalações
especiais:
*salas com
pressão
negativa
*exaustão
para fora
4 Práticas do nível 3, mais:
*entrada após troca de roupa
especial na sala e remoção
especial de resíduos
*banho antes de sair e todos
os resíduos são
descontaminados antes de
sair das instalações
*câmara de fluxo laminar classe
III, em combinação com
pressão positiva na sala e roupa
especial com respirador
artificial, para todos os
procedimentos e atividades
Requisito
máximo de
segurança
(chuveiro
na sala, etc)

1.2. Normas de segurança no laboratório de microbiologia
01-O uso do guarda-pó é obrigatório.
02-Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e
equipamentos.
03-Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática.
04-Limpar a bancada de trabalho convenientemente com álcool etílico a 70% (v/v) e
manter o material em ordem
05-Lavar e sanitizar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for
necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no
material.
06-Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise.
07-No manuseio de compostos químicos considerados perigosos, evitar o contato cutâneo
ou a sua inalação, recorrendo ao uso de luvas, máscara ou óculos de proteção,
consoante as características dos compostos.
08-Não pipetar com a boca.
09-Estabelecer regras bem definidas para o circuito do material de vidro e de plástico no
laboratório, assim como para a sua lavagem.
10-Manusear com muita precaução certos materiais e aparelhos frágeis e/ou muito
sensíveis e mantê-los devidamente limpos.
11-Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.
12-No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a
desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer
ferimentos ou cortes.
13-Não comer, beber ou fumar no laboratório.
14-Manter canetas, dedos e outros longe da boca.
15-Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.
16-Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.
17-Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-o sobre a
bancada.
18-Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.

19-Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou
despejar na pia.
20-Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias
inflamáveis por perto.
21-Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto são necessários.
22-Trabalhe sempre próximo ao fogo.
OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial, pois visa a diminuição de
microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma
regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da
Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não
forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é
importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, já que certas
zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria
e, portanto, não deve ser utilizada para flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são
zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a flambagem).
(Figura 1).
Figura 1

2. Preparação de culturas microbianas
A preparação de culturas microbianas, e em particular a inoculação da espécie ou
espécies microbianas que pretendemos fazer crescer, envolve uma série de procedimentos
assépticos que deverão ocorrer em condições apropriadas.
2.1. Procedimentos assépticos:
Há certas precauções que devem ser tomadas durante a inoculação de uma cultura
microbiana de modo a evitar a contaminação das culturas, das pessoas ou do ambiente:
 Certificar-se de que ao dar início às operações, todo o material necessário
está ao alcance imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente
possível.
 Desinfetar com solução apropriada e arrumar convenientemente a bancada
de trabalho.
 Os recipientes devem permanecer abertos o mínimo tempo possível e,
enquanto abertos, todo o trabalho deve ser realizado junto à chama do bico
de Bunsen.
 Uma vez abertos os recipientes, como tubos, balões e frascos, o seu bocal
deve ser flamejado de imediato.
 A fim de evitar as contaminações durante as manipulações que envolvam
placas de Petri, a exposição das superfícies internas estéreis deve durar o
mínimo de tempo possível.
 A extremidade da pipeta estéril que vai ser colocada em contacto com as
culturas celulares, ou com os recipientes estéreis, não deve ser tocada nem
entrar em contato com superfícies não estéreis, como é o caso da roupa,
superfície da área de trabalho, o exterior de tubos, de balões ou quaisquer
outros materiais.

 A utilização das alças, pipetas e espalhadores, assim como a manipulação de
frascos e tubos de ensaio, em condições de assepsia, envolve alguns
cuidados particulares:
- Alças
As alças são esterilizadas pela passagem na chama do bico de Bunsen, antes e depois
de serem utilizadas. Devem ser aquecidas até ficarem ao rubro para assegurar que todos os
esporos sejam destruídos. Devem ser agarradas quase pelo topo num ângulo praticamente
vertical. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar a tampa do recipiente.
- Pipetas
Para transferir culturas, meios e soluções estéreis deve-se utilizar pipetas graduadas
ou pipetas Pasteur estéreis de acordo com as normas descritas a seguir:
1. Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contém o tampão de algodão,
tendo o cuidado para não tocar mais do que o necessário de modo a segurar firmemente.
2. Colocar a pro-pipete.
3. Segurar a pipeta como uma caneta, mas não apertar a pro-pipete. O dedo mindinho deve
ficar livre para segurar na rolha de algodão/ tampa do tubo/ frasco.
4. Apertar a pro-pipete com cuidado e retirar a quantidade de fluido necessária, mas que
não atinja nem molhe o tampão de algodão.
5. Colocar a pipeta usada num contentor de plástico com desinfetante, devidamente
identificado para esse fim.
6. A pro-pipete não deve ser retirada até a pipeta estar dentro do contentor de plástico, de
modo a evitar que gotas de cultura contaminem a superfície de trabalho.
- Frascos, balões e tubos de ensaio
Quando se pretende manipular frascos, balões ou tubos de ensaio em condições
assépticas deve-se proceder do seguinte modo:
1. Desapertar a tampa dos frascos/balões ou tubos de ensaio de modo a poder ser retirada
facilmente.
2. Segurar o frasco/ tubo com a mão esquerda.
3. Retirar a tampa/ rolha de algodão com o dedo mindinho da mão direita.

4. Não pousar a tampa/ rolha de algodão.
5. Flamejar o gargalo do frasco/ tubo fazendo-o passar pela chama do bico de Bunsen.
6. Recolocar a tampa do recipiente.
- Espalhadores
Os espalhadores, ou alças de Drigalski, são usados para distribuir inóculos sobre a
superfície de placas já preparadas com meios de cultura. Podem ser esterilizados em estufa
uma vez empacotados, ou por flamejação com álcool.
- Esterilização com álcool
A esterilização de espalhadores com álcool envolve os seguintes procedimentos:
1. Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de álcool a 70% (v/v)
contido num recipiente com tampa ou coberto com papel de alumínio.
2. Passar rapidamente através da chama do bico de Bunsen; o álcool vai arder esterilizando
o vidro.
3. Afastar o espalhador ligeiramente da chama até o álcool parar de arder.
4. Pousar o espalhador numa superfície estéril como uma caixa de Petri ou um copo
graduado.

3. Aula prática 01: Presença de Microrganismos no
Ambiente
Objetivos: Mostrar a diversidade de culturas microbianas existentes no ambiente e
familiarizar-se com o preparo de meios de cultura.
3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri
1. Esterilização das placas de petri: deve-se esterilizá-las secas e limpas, embrulhadas
em papel manilha ou semelhante, em autoclave, a 1 atm por 20 min.
2. Preparo do meio ágar nutriente (seguir as especificações do fabricante):
•Pesar a quantidade adequada de ágar nutriente em erlenmeyer de 250 mL
•Adicionar a quantidade de água destilada necessária.
•Levar o conjunto ao banho-maria até dissolução do gel. A seguir o ágar é
colocado em recipiente próprio para esterilização e tampado
•Autoclavar o meio nutriente por 15 min.
3.Após a esterilização deixar o ágar esfriar, em temperatura ambiente, até que se consiga
segurar o frasco com as mãos, sem queimá-las.
4.Verter o meio nas placas assepticamente, próximo à chama.
5.Deixar o ágar solidificar em temperatura ambiente e depois estocar adequadamente as
placas, para posterior utilização.
OBS: as placas devem ser estocadas e/ou incubadas sempre invertidas, para que qualquer
condensado, por ventura formado, não se misture ao meio de cultura.

3.2. Exposição das placas a diferentes ambientes
1. Expor placas de Petri contendo ágar nutriente a uma das seguintes condições:
•Manter uma delas aberta durante 15 minutos em um ambiente qualquer
(banheiro, sala de aula, cantina, etc)
•Em outra placa, tocar os dedos no material nutriente ou expor ao contato de
materiais tais como: fio de cabelo, solo, pó de giz, etc.
•Falar ou tossir sobre o meio de cultura da terceira placa
•Manter uma placa sem exposição, para servir como controle.
2. Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposição a que foram submetidas,
data, grupo, etc
3. Na estufa, incubar as placas na posição invertida à temperatura de 30°C por sete dias.
Observar as placas diariamente fazendo anotações quando necessário. Não esquecer de
anotar a composição do meio de cultura utilizado.
4. Após a utilização das placas estas devem ser esterilizadas na autoclave, antes do material
ser descartado, e limpas.
3.3. Relatório
1. Avaliar a presença de colônias, sua abundância e diversidade e compará-la com a
dos outros grupos e com o controle.
2. Pesquisar em livros ou na internet outros meios de cultura existentes para o cultivo
e armazenamento de microrganismos.

4. Considerações Gerais sobre Desinfecção e
Esterilização
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um
material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: Consiste na destruição, remoção ou redução dos microrganismos
presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto,
superfície ou local.
ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto,
superfície ou local.
ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por
exemplo, através do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal.
LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de
desinfecção ou esterilização.
4.1. Esterilização:
A melhor maneira de garantirmos a destruição de microrganismos presentes em
instrumentos e equipamentos é mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos
que causam infecções em seres humanos desenvolve-se em temperaturas próximas a do
corpo, ou seja, 37ºC. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, são destruídos; o que
não acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o
microrganismo fica apenas inibido, e não é destruído.
Alguns microrganismos produzem esporos, que são formas de resistência, podendo
permanecer inativos por longos períodos e depois voltar ao estágio inicial de infectividade,

portanto as técnicas de esterilização devem destruir tanto a célula bacteriana, como os
esporos.
Existem diversos métodos de esterilização: Físicos ou Químicos. Os métodos de
esterilização mais empregados em laboratório são os que utilizam o calor, seja este úmido
(autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor úmido
(autoclave) é melhor.
4.1.1. Esterilização por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur)
Este tipo de esterilização é realizado a temperaturas de 140ºC a 180ºC, com tempo de
exposição de 60 a 120 minutos em estufas elétricas equipadas com termostatos. O calor
seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturação e oxidação
das proteínas, que resultam na morte dos microrganismos.
A utilização do calor seco leva mais tempo que o calor úmido, mas como existem
materiais que não podem ser esterilizados no calor úmido, o calor seco é o preferido. É
indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem
oxidar na presença do vapor da autoclave, e materiais impermeáveis como ceras, pomadas
e óleos.
Para ser eficiente, este processo depende de:
 Aquecimento da estufa até a temperatura desejada antes da colocação do
material.
 Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente
embalados.
 A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa
não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de
2 cm entre os objetos.
 O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do
material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida
novamente.

4.1.2. Esterilização pelo Calor Úmido
O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em
materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu
ponto de ebulição.
- Água fervente
É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os
microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou
objetos contaminados não são esterilizados com segurança pois alguns esporos
bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora.
- Vapor d’água
O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O
aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para
destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco.
A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A
penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos
microrganismos, e por este motivo é mais rápido.
Funcionamento da autoclave:
1- A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para
remover todo o ar;
2- É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e
pressão por um período específico de tempo. É essencial que todo o ar residual
inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor
d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da
autoclave;
3- A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na qual a
temperatura do vapor é de 121ºC.

A eficiência do processo de esterilização em autoclaves depende de alguns fatores:
 Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente
embalados.
 O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de
121ºC é atingida.
 A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o
vapor atinja todo o material por igual.
 Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso
deve ser novamente esterilizado.
5.1.3. Controle da Esterilização
É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se
trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia,
conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for
negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente.
O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os
métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a
temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada
Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade
do processo.
Este controle deve fazer parte da rotina do laboratório para garantir a segurança de
toda a equipe.
Considerações importantes:
1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita do material antes de serem
submetidos à esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue,
e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante. É adequado lavar
manualmente o material com detergente e água morna antes da esterilização.

2. Depois de esterilizados, os materiais devem ser conservados em embalagens
apropriadas, caso contrário voltam a se contaminar com microrganismos presentes no
ambiente.
4.2. Desinfecção
Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química
(desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário
ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos inativados.
1- Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex:
HBV, HIV e M. tuberculosis.
2- Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma
vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vírus.
3- Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa,
exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vírus.
4.2.1. Desinfecção por agentes físicos:
 Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C)
Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para
eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos, portanto, é
um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC
por 30 minutos.
4.2.2. Desinfecção por agentes químicos:
a) Método de Desinfecção de alto nível:
 Glutaraldeído: é indicado para qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida
desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino
(7,5-8,5) por 30 minutos.

 Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como
solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada
por30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução
aquosa.
 Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a
imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.
 Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que
o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.
b) Método de Desinfecção de nível intermediário:
 Compostos Clorados: Causam a inibição de reações enzimáticas intracelulares,
desnaturação de proteínas, e inativação de ácidos nucléicos.Apresentam atividade
antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ação rápida, entretanto seu uso
é limitado, pois é irritante, instável por 24 horas, fotossensível e volátil, além de ser
corrosivo para metais. Seu uso é indicado para artigos de vidro e borracha, sendo
contra-indicado para metais (é corrosivo). Apresenta-se na forma líquida (ex:
Hipoclorito de sódio) e na forma sólida (ex: Hipoclorito de Cálcio), e o tempo de
exposição dos artigos a estes compostos é de aproximadamente 10 minutos.
 Álcoois(Etílicos e Isopropílicos): Seu mecanismo de ação é através da
desnaturação de proteínas. São usados em concentração de 70% peso por 10
minutos, para a desinfecção de superfícies. O uso destas substâncias é contra-
indicado para borracha, plásticos e acrílico.
 Fenólicos: Seu mecanismo de ação é através do rompimento da parede celular,
precipitando proteínas, quando usado em alta concentração, e alteração dos
sistemas enzimáticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentração. Sua
concentração para uso é de 0,4-5% sendo que o tempo de exposição deve ser menor
ou igual a 10 minutos. Seu uso é indicado para descontaminação de ambiente
hospitalar, itens cirúrgicos e médicos não-críticos, sendo que devem ser
consideradas as limitações devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia – crianças –
berçários), e ação residual em materiais porosos.

 Iodóforos: Sua ação é através de seu alto poder de penetração na parede celular,
levando a ruptura de proteínas. São utilizados em concentração de 30 a 50 ppm por
um tempo menor ou igual a 10 minutos.
c) Método de Desinfecção de baixo nível
 Álcoois
 Compostos Clorados
 Fenólicos: em concentração menor que 5%
 Iodóforos: em concentração menor que 30 ppm
 Compostos de Amônio Quaternário: Age através da inativação de enzimas,
desnaturação de proteínas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua
concentração para uso é de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mínimo 10 minutos. É
indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfícies)
 Detergentes: São agentes tensoativos, com ação detergente, umectante e
emulsionante. Podem ser classificados como Catiônicos (p. ex. Quaternários de
Amônio), Aniônicos (p. ex. sabões, detergentes sulfatados ou sulfonados), e
Enzimáticos. Este último tem como princípio ativo enzimas proteinases, amilase e
lípases, e,portanto, causam transformações em proteínas, polissacarídeos e gorduras
(ex: Endozime)
Na tabela 2 encontram-se os principais compostos utilizados em desinfecção e
assepsia.

Tabela 2: Principais Compostos Utilizados em Desinfecção e Assepsia
Agente Espectro de ação* Uso Modo de ação Tempo de
exposição
Desvantagens
Álcoois (70-
80%)
Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR**
Antissépticos
Desinfectantes
Desnaturação
protéica dissolução
de lipídeos
Curto (10-15
min)
Pouco ativo contra
esporos
Fenóis Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR
Desinfectantes Desnaturação
protéica
Efeito imediato Fenol puro é
corrosivo e de odor
desagradável
Compostos
Quaternários
de amônio
Gram-positivas
Gram-negativas
Antissépticos
Sanitizantes
Desinfectantes
(instrumentos
cirúrgicos)
Alteração da
membrana celular
bacteriana
Curto (10-30
min)
Não age sobre
BAAR e esporos
Cloro Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR
Tratamento da
água
Inativação
enzimática agente
oxidante
Efeito imediato Odor irritante pouco
ativo contra esporos
Iodo Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR
Antissépticos
Desinfectantes
Inativação
enzimática
Efeito imediato Odor irritante pouco
ativo contra esporos
Iodóforos Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR
Antissépticos
Desinfectantes
Inativação
enzimática
Efeito imediato Pouco ativo contra
esporos
Aldeídos*** Gram-positivas
Gram-negativas
BAAR
Desinfectantes
(instrumentos e
superfícies)
Desnaturação
protéica agente
alquilante
Curto (formas
vegetativas)
Prolongado
(esporos)
Tempo de exposição
longo
Metais
pesados
Gram-positivas
Gram-negativas
Antissépticos Inativação
enzimática
Só agem
enquanto em
contato
Não atuam sobre
BAAR e esporos
*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991.
**- Bacilos álcool-ácido resistentes; ***- Ativos contra esporos

5. Aula prática 02: Desinfecção
Objetivo: verificar a ação de antissépticos sobre a microbiota das mãos.
5.1. Identificação das Placas de Petri
1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso
a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa.
2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle (C), Mão Suja (MS),
Detergente (Det), Álcool 70% (A), Água (água ) e Sabonete (S). Devem ser
preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo.
5.2. Desinfecção das mãos e inoculação das Placas de Petri
1- No quadrante identificado como “ Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar)
no ágar por 1 minuto.
2- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e
encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “Detergente” por 1
minuto.
3 -O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o mesmo dedo
no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto.
águaS

4- Proceder de maneira semelhante para a outra placa, substituindo o detergente por água e
o álcool por sabonete (protex).
5- As placas devem ser levadas para incubação, a 30C por 7 dias.
OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como “Controle”.
5.3. Relatório
1- Faça uma representação esquemática dos resultados obtidos na avaliação da microbiota
das mãos.
Crescimento Bacteriano
- + ++ +++ ++++
Controle
Mão Suja
Detergente
Placa I
Álcool 70%
Controle
Mão Suja
água
Placa II
Sabonete
2. Discuta os resultados encontrados.
3. Como você interpreta os resultados obtidos? Qual a importância da antissepsia das
mãos no seu dia-dia?

6. Aula prática 03: Testando produtos de limpeza
Objetivo: verificar a eficácia de desinfetantes e outros produtos que prometem
acabar com os microorganismos.
6.1. Procedimento
1. Raspe um pouco dos microrganismos que estão nas
placas já contaminadas de uma das práticas anteriores;
dilua-as em alguns mililitros de água estéril (use um
tubo de ensaio).
2. Espalhe 1 ml da mistura de água com microrganismos
nas placas de Petri com meio de cultura, com auxílio da
pipeta automática e da alça de Drigalski.
3. Com a pinça, molhe o filtro de papel em um dos produtos (desinfetante, água sanitária,
detergente e antibiótico)
4. Coloque cada círculo no meio de uma das placas previamente contaminadas e guarde-as
na estufa.
5. Aguarde alguns dias. Quanto melhor o produto, maior será a auréola transparente que
aparecerá em volta do papel; se for ruim, nada acontecerá.
6.2. Relatório
Relate as observações realizadas durante a semana, comparando as placas e os
produtos entre si. Pesquise sobre a forma de atuação de cada produto utilizado.
Auréola transparente: quanto
mais eficiente o produto, maior
ela será.

7. Microscopia
O microscópio foi inventado em 1590 por Hans Janssen e seu fiIho Zacharias, dois
holandeses fabricantes de óculos. Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações
microscópicas de materiais biológicos foi o neerlandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 -
1723).
Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e
quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material
biológico, como embriões de plantas, os glóbulos vermelhos do sangue e os
espermatozóides presentes no sêmen dos animais. Foi também Leeuwenhoek quem
descobriu a existência dos “micróbios”, como eram antigamente chamados os seres
microscópicos, hoje conhecidos como microorganismos.
Dividem-se basicamente em duas categorias:
 Microscópio Luminoso ou ótico
•Microscopia de Campo Claro
•Microscopia de Campo Escuro
•Microscopia de Fluorescência
•Microscopia de Contraste de Fase
 Microscópio Eletrônico (alemão Ernest Ruska)
•Microscópio Eletrônico de Transmissão - MET (para observação de cortes ultrafinos)
•Microscópio Eletrônico de Varredura – MEV (para observação de superfícies)
•Microscópio Eletrônico de Tunelamento - ME (para visualização de átomos)
Dentre as técnicas empregadas em microscopia destacam-se:
1. Microscopia de fundo escuro
É uma aplicação do princípio de Tyndall. Assim os corpúsculos a examinar são
fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que é
conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a única luz que penetra na objetiva

é a difratada pelas partículas presentes na preparação, pelo que passam a ser visíveis em
fundo escuro.
2. Microscopia de fluorescência
Permite observar microorganismos capazes de fixar substâncias fluorescentes. A
luz UV, ao incidir nessas partículas, provoca a emissão de luz visível e observa-se os
microorganismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da tuberculose fixa a
auramina, pelo que o diagnóstico da doença pode ser feito por microscopia de
fluorescência.
3. Microscopia de contraste de fase
Permite a observação de microrganismos vivos, sem coloração, através do contraste
devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à fase
da luz que atravessa os microrganismos. Esta diferença de fase é conseguida por utilização
de uma objetiva de fase, que consiste num disco de vidro com um escavação circular, de
modo que a luz que atravessa a escavação tem diferença de 1/4 de fase em relação à que
travessa a outra porção do vidro. Assim, os objetos não corados podem funcionar como
verdadeiras redes de difração, pois os pormenores da sua estrutura resultam de pequenas
diferenças nos índices de refracção dos componentes celulares, e estes originam diferenças
de fase nas radiações que os atravessam
Microscópio óptico
Porção mecânica
Pé ou base – serve de apoio dos restantes componentes do microscópio.
Coluna ou Braço – fixo à base, serve de suporte a outros elementos.
Platina – onde se fixa a preparação a observar; tem uma janela por onde passam os raios
luminosos e também parafusos dentados que permitem deslocar a preparação.
Tubo ou canhão – suporta a ocular na extremidade superior.
Revólver – peça giratória portadora de objetivas de diferentes ampliações.
Parafuso macrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina,
rápidos e de grande amplitude.

Parafuso micrométrico – a sua rotação é responsável por movimentos verticais da platina,
lentos e de pequena amplitude, permitem aperfeiçoar a focagem.
Charriot - Movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina
como um todo.
Parte óptica:
Condensador – conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham
regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio.
Diafragma – permite regular a intensidade da luz que incide no campo de visão do
microscópio.
Objetivas – permitem ampliar a imagem do objeto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x.
As objetivas de 10x, 40x e 50x são designadas objetivas secas, pois entre a preparação e a
objetiva existe somente ar.
As objetivas de 90x e 100x são designadas objetivas de imersão, uma vez que, para as
utilizar, é necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre elas e a preparação, a qual,
por ter um índice de refração semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso
para fora da objetiva.
Oculares – sistema de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva,
formando uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do
observador. As oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos microscópios
binoculares também existem oculares de 12,5x, 8x e 6x.
Fonte luminosa –luz artificial, fornecida por uma lâmpada de tungstênio ou de halogênio,
incluída no aparelho juntamente com um interruptor com reostato, que permite regular a
intensidade da luz emitida

8. Aula prática 04: Microscopia a Fresco
Objetivos: utilizar o microscópio para visualizar lâminas de microrganismos
preparadas pela técnica a fresco e verificar a morfologia celular.
Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta
depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes
ou a fresco, sem coloração.
A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural dos
microrganismos e atividades celulares como a mobilidade bacteriana.
A utilização do azul de metileno como corante permite verificar a viabilidade
celular. Células coradas indicam que as células estão mortas. As células vivas permanecem
incolores quando submetidas a esse tratamento, pois usa atividade metabólica reduz o
corante tornando-o incolor.
8.1. Sem corante
1. Misturar fermento biológico em água estéril.
2. Com auxílio de uma alça de platina ou alça de inoculação estéril, transferir uma gotícula
da cultura para o centro de uma lâmina.
3. Recobrir a cultura com uma lamínula e levar a microscópio para focalização.
8.2. Com corante
1. Adicionar algumas gotas de azul de metileno à preparação de fermento e aguardar 2
min.
2. Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1).
3. Observar se as células estão coradas ou não.

8.3. Com outras culturas
1.Escolher culturas microbianas em meio sólido, isoladas em práticas anteriores.
2.Transferir com auxílio da alça de platina ou de inoculação uma gota de água estéril para
o centro de uma lâmina.
3.Com auxílio da alça de platina retirar um pouco da cultura sólida de uma placa de Petri e
transferir para a gota de água sobre a lâmina. Se desejar colocar uma gota de azul de
metileno sobre a preparação e aguardar 2 min.
4.Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1).
8.4. Relatório
1. Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos nas três lâminas.
2. Relatar o que aconteceu quando se utilizou o azul de metileno.
3. Pesquisar outros corantes que possam ser empregados em microscopia.

9. Aula prática 05: Microscopia de Gram
Objetivos: utilizar o microscópio para visualizar lâminas de microrganismos
preparadas pela técnica de Gram e verificar a morfologia celular.
A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal
violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). As Gram-positivas permanecem
roxas, enquanto as Gram-negativas ficam avermelhadas.
9.1. Esfregaço de cultura bacteriana sólida:
1- Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama.
2- Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina.
3- Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida.
4- Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinize com
movimentos circulares, para obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.
5- Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a
chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.
9.2. Adição de Corantes:
1- Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.
2- Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto.
3- Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço.
4- Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente
a lâmina.
5- Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração
que deve ocorrer em cerca de 20 segundos.

6- Cubra a lâmina com fuccina (Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave
a lâmina.
7- Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir
seque o restante da lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando”
a chama).
8- Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de
colocar uma gota de óleo para imersão sobre o esfregaço)
9.3. Relatório
1- Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a
morfologia bacteriana e a reação tintorial.
2- Fale sobre o fundamento da técnica de Gram, relacionando-o com a estrutura
celular da parede das bactérias e de outros microrganismos.

10. Aula prática 06: Inoculação de uma cultura de
leveduras por espalhamento em meio sólido
Objetivos: aplicar técnica de diluição decimal para contagem de colônias
microbianas e determinar o número de microrganismos por ml.
O objetivo desta análise é determinar o número de microrganismos por ml, para isso:
 Seleciona-se uma das placas incubadas, que contenha entre 20 e 200 colônias;
 Conta-se o número de colônias;
 Calcula-se a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte fórmula:
* UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma vez que a
contagem feita é referente às colônias e não às células presentes.
** 10 é um fator de correção.
EXEMPLO:
Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita diluição de 10-2
, o
cálculo final será:
UFC= 105 x 10 x 102
= 1,05 x 105
UFC/ml
10.1. Preparação de uma série de diluições decimais de uma
cultura de leveduras
1. Preparar tubos de ensaio contendo 9 ml de água destilada.
2. Esterilizar em autoclave durante 20 minutos a 120ºC e a 1 atm.
3. Preparar uma suspensão densa da levedura S. cerevisiae num tubo contendo água estéril
(Figura 1).
UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem)

4. Agitar o tubo de ensaio no vortex (cerca de 5 segundos).
5. Com uma pipeta estéril de 1 ml ou usando uma pipeta automática com pontas estéreis,
retirar assepticamente 1 ml da suspensão microbiana.
6. Introduzir o volume de 1ml da suspensão no primeiro tubo de diluição (10
-1
).
7. Homogeneizar a suspensão por agitação no vortex.
8. Com uma nova pipeta estéril retirar 1 ml da diluição 10
-1
e transferir para outro tubo para
obter a diluição 10
-2
.
9. Continuar este procedimento até obter a diluição 10-6
.
Figura 1: Diluições decimais de uma cultura microbiana e inoculação por espalhamento em
meio de cultura sólido.

10.2. Inoculação de uma cultura de leveduras por espalhamento
em meio sólido
1. Antes de proceder à sementeira das placas de Petri, estas devem ser marcadas na parte
marginal da sua base com as seguintes indicações: diluição, data do ensaio, identificação
do grupo de trabalho.
2. Selecionar as três últimas diluições da suspensão de S. cerevisiae 10
-4
,10
-5
e 10
-6
.
3. Agitar vigorosamente cada um dos tubos de ensaio contendo a diluição antes de
proceder à sua inoculação em meio sólido.
4. Entreabrir três placas de Petri com meio YEPD e colocar 0,1 ml de cada uma das três
diluições.
5. Mergulhar o espalhador no copo contendo álcool puro e passá-lo na chama do bico de
Bunsen. Deixar a chama apagar no espalhador e esperar cerca de 30 segundos até ele
arrefecer.
6. Passar o espalhador sobre a superfície do meio rodando as placas de Petri com cuidado.
Após algum tempo nota-se uma certa resistência na movimentação do espalhador, o que
indica que o inóculo foi absorvido pelo meio.
7. Todas as placas de Petri inoculadas devem ser incubadas à temperatura ambiente,
durante 24 a 48 horas. Verificar se todas as placas estão devidamente identificadas antes
de se colocarem na estufa (25 a 30 ºC).
As diluições decimais realizadas a partir de suspensões densas de leveduras, se
forem adequadas, permitem-nos obter, em placas com YEPD, colônias perfeitamente
isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor. É fundamental que o número de
colônias desenvolvidas nas placas não seja demasiado grande porque algumas células
poderão não formar colônias e a contagem não será correta. Também não deve ser
demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatístico da contagem. A prática
usual mais válida consiste em contar colônias apenas nas placas que tenham entre 20 e 200
colônias.

OBS:
Composição do meio YEPD*
Extrato de levedura 5 g/l
Peptona 10 g/l
Glicose 20 g/l
Agar 20 g/l (para meios de cultura sólidos)
10.3. Relatório
1. Conte o número de colônias e calcule o número de unidades formadoras de
colônias.
2. Pesquise outros procedimentos que permitam determinar a concentração de
microrganismos em uma dada amostra

11. Aula prática 07: Isolamento de microrganismos de
tecido vegetal
Objetivo: isolar microrganismos de tecido vegetal.
11.1. Desinfecção superficial
1.Deixar a amostra vegetal imersa em álcool 70%, em recipiente esterilizado, por 5 min.
2.Proceder à lavagem com água destilada estéril para remoção do álcool.
11.2. Inoculação e incubação
1.Inocular em placa de petri contendo ágar nutriente. A inoculação deve ser realizada
retirando-se pequenos pedaços do material, com auxílio de pinça esterilizada, que deverá
ser colocado ou espalhado sobre o meio.
2.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo ágar dextrose.
3.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo ágar carne
4.Incubar em estufa a 30C por alguns dias.
Atenção: não esquecer de anotar a composição e pH dos meios utilizados na prática,
bem como o fabricante.
11.3. Relatório
1.Avaliar o crescimento e, se possível contar o número de colônias diferentes que possam
ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados.
2.Comparar os resultados observados para cada placa.
OBS: É importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio
empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.12. Aula prática 08: Isolamento de
microrganismos do ar

12. Aula prática 08: Isolamento de microrganismos do ar
Objetivo: isolar microrganismos do ar.
12.1. Exposição das placas – método da sedimentação
1.Escolher o local de coleta
2.Colocar uma placa de petri contendo o meio ágar nutriente, uma contendo ágar dextrose
e duas contendo ágar carne.
3.Após 5 minutos fechar as placas de ágar nutriente, ágar dextrose e uma de ágar carne.
4.Após 10 minutos, fechar a segunda placa de ágar carne.
5.Incubar a 30 C por 48 h.
Atenção: não esquecer de anotar a composição e pH dos meios utilizados na prática,
bem como o fabricante.
12.2. Relatório
1.Avaliar o crescimento e, se possível contar o número de colônias diferentes que possam
ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados para os microrganismos isolados do ar.
2.Comparar os resultados observados para cada placa do item 2, destacando as diferenças
observadas em ralação ao tempo de exposição das placas contendo ágar carne.
OBS: É importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio
empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.

13. Aula prática 09: Estragando o mingau
Objetivo: Perceber a necessidade de guardar bem os alimentos para que eles não se
contaminem.
13.1. Procedimento
1. Prepare o mingau com o amido de milho e 1 copo de água. Misture bem e leve ao fogo
até engrossar.
2. Coloque o mingau ainda quente até a metade dos bécheres numerados de 1 a 5.
3. Deixe o bécher 1 aberto, em cima da pia do laboratório.
4. Cubra o 2 com o filme plástico, vede-o, e deixe-o também sobre a pia.
5. O 3 é completado com 1 colher de sopa de óleo.
6. E o 4, completado com 1 colher de sopa de vinagre.
7. O 5 é colocado na geladeira, sem cobertura.
13.2. Relatório
1. Observe em qual mingau apareceram as primeiras alterações. Depois de uma
semana, descrever a aparência de cada bécher.
2. Discuta os resultados obtidos.
3. Faça pesquisas sobre técnicas antigas de conservação de alimentos compare com as
modernas.

14. Aula prática 10: Microrganismos em Processos
Biotecnológicos
Objetivo: Identificar os microrganismos presentes em produtos comerciais obtidos
pela atividade microbiana.
14.1. Procedimento
1.Preparar lâminas a fresco e coradas pelo método de Gram, a partir de fermento de pão,
iogurte, yakult, vinho, etc.
2.Visualizar através de microscópio óptico.
3.Identificar os microrganismos presentes.
14.2. Relatório
Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a
morfologia microbiana e a reação tintorial.

15. Confecção dos relatórios
 Começar os relatórios com uma breve introdução, de forma a deixar claro os
objetivos e as técnicas que serão empregadas na prática em questão. Não é
necessário incluir o procedimento constante do roteiro.
 Mostrar os resultados obtidos.
 Pesquisar o que foi pedido no roteiro, neste caso colocando a bibliografia utilizada.
 Fazer uma conclusão.
OBS: A data de entrega do relatório será sempre uma semana após a conclusão da
prática. O não cumprimento do prazo implicará na diminuição do valor do mesmo.

Apostila prática de microbiologia industrial

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Destacado

Destacado (20)

Similar a Apostila prática de microbiologia industrial

Similar a Apostila prática de microbiologia industrial (20)

Último

Último (20)

Apostila prática de microbiologia industrial