LABORATORIO DE EXTRACCIÓN DE ADN

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Área de Biología Molecular., Dr. Giovanni ...
Protocolo de extracción y procedimiento

    1. Adicionar y triturar el material vegetal o animal (licuadora):

La finalid...
¿Qué es una enzima proteolítica?



3. Ladea tu tubo de ensayo y lentamente vierte el alcohol (isopropílico al 70-95% o al...
a.   Posterior a la incubación se le agregó a cada muestra 500µl de PCI, agitándose

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Laboratorio 2 de extraccion de adn

  1. 1. LABORATORIO DE EXTRACCIÓN DE ADN Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Área de Biología Molecular., Dr. Giovanni González Objetivo, Enseñar una técnica de extracción de ADN convencional, con el objeto de observar todo el proceso y obtener una concentración de ADN visible. La extracción se compone de tres sencillo pasos: Alcohol Detergente Enzima proteolítica (ablandador de carne) Primero se necesita encontrar material vegetal y animal para extraer ADN: Espinacas Hígado de pollo Cebollas Brócoli
  2. 2. Protocolo de extracción y procedimiento 1. Adicionar y triturar el material vegetal o animal (licuadora): La finalidad de la trituración o maceración del material a extraer ADN siendo la primera destrucción física de la muestra a aislar ADN. Fuente de ADN (más o menos 100 ml o 1/2 de taza de espinacas, Hígado, cebollas o Brócoli) Un pellizco grande de Cloruro de sodio sal de mesa (menos de un ml o 1/8 de cucharadita) Agua fría (en hielo). El doble de la cantidad de tu fuente de ADN (más o menos 200 ml o 1 taza) Maceración por licuado a alta velocidad por 15 segundos. El licuado separa las células de las unas de otras, por lo que ahora básicamente se obtiene una solución muy diluida de sopa de células (vegetal y animal). Cada grupo sigua estos tres pasos: 1. Vierte el concentrado de células a través de un colador dentro de otro contenedor (como una taza medidora por ejemplo). ¿Cuánta concentrado de células tienes? Añade como 1/6 de esa cantidad de detergente líquido (más o menos 30 ml o dos cucharadas soperas) y mézclalo. Deja reposar la mezcla entre 5 y 10 minutos. Vierte la mezcla en tubos de ensayo u en otros contenedores pequeños de vidrio, cada uno como 1/3 lleno. Prueba usar uno detergentes o el que sea que tengas a mano. ¿Por qué estoy usando detergente? 2. Añade un pellizquito de enzima a cada tubo de ensayo y agítalo suavemente. ¡Se cuidadoso! Si lo agitas demasiado fuerte romperás el ADN haciéndolo más difícil de ver. Usa ablandador de carne como enzima. (Si no puedes encontrar ablandador proteolítico, jugo de piña o solución limpiadora para lentes de contacto)
  3. 3. ¿Qué es una enzima proteolítica? 3. Ladea tu tubo de ensayo y lentamente vierte el alcohol (isopropílico al 70-95% o alcohol etílico) sobre la pared del tubo de manera que forme una capa sobre la mezcla. Sigue vertiendo hasta que tengas en el tubo aproximadamente la misma cantidad de alcohol que de mezcla. El ADN se elevará desde la mezcla hasta la capa de alcohol. Puede usar pistilo de madera para arrastrar el ADN que está en el alcohol. ¿Qué es ese material pegajoso? El alcohol es menos denso que el agua, por lo que flota en la parte superior. Debido a que se formaron dos capas separadas, toda la grasa y proteína que rompimos en los dos primeros pasos. En este caso, la proteína y la grasa irán al fondo, que es la capa acuosa, donde se sienten más confortables, mientras que el ADN prefiere la capa superior, el alcohol. El ADN es una larga y pegajosa molécula a la que le gusta formar grumos. En estos momentos ustedes realizaron una extracción de ADN TECNICA DE EXTRACCION DE ADN CONVENCIONAL FENOL-CLOROFORMO Método Fenol-Cloroformo. Esta técnica se usa en laboratorios de Biologia Molecular convencional. Las muestras son incididas y transferidas a un tubo de 1.5ml que contenía 500 ul de buffer de extracción CTAB 2X (Bromuro de cetil-trimetil-amonio). Los tejidos son macerados dentro del tubo con un pistilo plástico y se le adiciono 12 ul de proteinasa K (Promega) 10mg/ml y se incubaron en agitación a 55ºC durante toda la noche. Separación de ADN En el proceso de separación del ADN, se realizaron en total cuatro lavados, dos con PCI (Phenol-cloroformo-alcohol Isoamilico, 25:24:1) y dos con CI (cloroformo alcohol isoamilico, 24:1).
  4. 4. a. Posterior a la incubación se le agregó a cada muestra 500µl de PCI, agitándose manualmente durante un período de 5 minutos y se centrifugó a 12000 rpm por 3 minutos a una temperatura de 4ºC. b. Al terminar la centrifugación se transfirió el sobrenadante (fase acuosa) a un nuevo tubo de 1.5 ml para repetir el paso anterior con PCI. c. Terminado estos dos lavados, se transfirió nuevamente el sobrenadante a otro tubo nuevo de 1.5ml al cual se le agrego 500µl de CI y se agitó manualmente por espacio de 5 minutos y se centrifugó a 12000 rpm por 3 minutos a una temperatura de 4ºC. d. Nuevamente se transfirió el sobrenadante a nuevo tubo de 1.5ml, se procede a repetir el paso anterior con CI.

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