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GENÉTICA Y CÁNCER


           Enrique Lastra Aras
       Sección de Oncología Médica
       Unidad de Consejo Genético
         Hospital General Yagüe
CONTENIDOS
•   El material genético
•   El ciclo celular
•   Apoptosis
•   Genética y cáncer de pulmón
•   Genética y cáncer colorrectal
•   Genética y cáncer de mama
•   Consejo genético en cáncer hereditario
RESUMEN



   ADN              REPLICACION. El ADN forma copias idénticas.




  ARN                   TRANSCRIPCION. Formación del mARN.

                                                                            NUCLEO
                                                                   mARN
                                    Splicing

                                                                     CITOPLASMA
Proteína          TRASLACION. La lectura del mARN se realiza en el citoplasma.



                                   La proteína es liberada al citoplasma.

El ribosoma lee en sentido 5’ 3’
Módulo I                                                                             27
REPARACION DEL ADN
 Las modificaciones que puede sufrir el ADN por efecto de las mutaciones
 se conocen como Lesión del ADN (ADN Damage).
 Las células poseen mecanismos para reparar estas lesiones (ADN repair).
 Existen distintas causas de lesión que provocan diferentes respuestas
 en las células que reparan mediante distintos mecanismos de acción.
 En una situación normal, si la lesión del ADN no puede ser reparada
 la célula se autodestruye (Apoptosis). En caso que la lesión persista y
 la célula escape a la Apoptosis, el daño celular se transmite a través de
 la duplicación del ADN.

           CAUSAS                    RESPUESTAS                     MECANISMOS
                                  • Inversión de la lesión
                                         del ADN              • Fotoreactivación del ADN.
         • Alteraciones              (Reversal of DNA
                                                                      • O6MGT
      químicas espontáneas               damage).
       en las moléculas
           del ADN.              • Corte de la lesión ADN         • Base Excision Repair
                                    (Excision of DNA           • Nucleotide Excision Repair
                                         damage).                    • Mismach Repair
        • Alteraciones
    producidas por factores
                                  • Tolerancia a la lesión
        ambientales.
                                    (Tolerance of DNA           • Recombinational repair
                                         damage)                       (HR, RJ)

Módulo I                                                                                      28
ALTERACIONES QUIMICAS ESPONTANEAS EN LAS MOLECULAS DEL ADN

              DEAMINACION DE BASES                             DEPURINACION
            • Pérdida del grupo amino (NH2)
                                                    • Pérdida de bases Púricas o
              en Adenina. Citosina, Guanina
                                                      Pirimidínicas.
              y Metil-citosina.
               NH2 (Perdida)
                                          O
                                                                                     A      Pérdida
Adenina       A                                                               9
                        Conversión                   5’CH2OH
                                                           o
                        Hypo-Xantina
                                                    4’C                       C 1’
             NH2 (Perdida)                                    H       H
                                         O           H                         OH         La zona sin
                                                          3’C         C 2’                 la base se
Guanina       G
                                                          OH          H                  conoce como
                        Conversión
                         Xantina
                                                                                         APURINICA
             NH2(Pérdida)                                                                    (AP).
                                          O

Citosina      C                          U
                           Conversión                     5’CH2OH
                                                                o                  AP
                            Uracilo
                                                     4’C                          C 1’
             NH2(Pérdida)                                         H       H
                                          O               H                        OH
                     CH3                      CH3
 Metil                                                        3’C         C 2’
              mC                         T
                           Conversión
Citosina                                                      OH          H
                            Timina
 Módulo I                                                                                             29
ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-II

                                           RADIACIONES UV

• La radiación ultravioleta (UV) provoca en la cadena de ADN uniones de Timinas que
  se conocen con el nombre de anillos de cilobutano o dímeros de timina.


                     T
     5’CH2OH 1
           o                               Los dímeros de Timina
                                               distorsionan la
   4’C               C 1’
             H   H                          doble hélice de ADN.
     H                OH
           3’C   C 2’
            O    H
                                       T
    O       P    O       5’CH2 o       1
                     4’C               C 1’
            O                 H    H
                        H               OH
                            3’C    C 2’
                            OH     H




Módulo I                                                                              30
ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-III

                              AGENTES ALKILANTES

    • Los agentes alkilantes son componentes químicos que transfieren grupos metílicos
      o etílicos a las bases del ADN, por lo tanto modifican químicamente a las bases.

                                                           CH3        O
           O
                                La metilación del Carbono 6            6
           6                     de la Guanina, produce la
                                       metil-Guanina.                 mG
           G


                                                                      CH
   CH3         O                                                        3

                                       La Metil-Guanina se           A T G     C T G
                                       aparea con la Timina
               6                       en lugar de la Citosina.
                                                                    T A     T G A C
                                                                            C
               mG


                                                            Aparece una mutación puntual.
Módulo I                                                                                    31
ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-III
                                       CROSS-LINKING
Diversos elementos químicos, como mostazas nitogenadas, ácido nitroso, mitomicina y
los derivados del platino, pueden unirse al ADN provocando abultamientos e inestabilidad
de la doble hélice.
                        EL Cis-Platino se une a las G del ADN de formas distintas

     Interstrand               Intrastrand          Monoadduct                ADN-Protein
     cross-linking             cross-linking                                  cross-linking




                                      G                      G                       G
            G

                      PT                       PT                   PT                        PT
       G                             G                      G                       G

                                                                                              P
                                                                                              R
                                                                                              O
                                                                                              T
                                                                                              E
                                                                                              I
                                                                                              N

                     La unión Intercadenas es la más citotóxica.
Módulo I                                                                                           32
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN

                                     O6MGT
• La enzima O6 METIL-GUANINA-METILTRANSFERASA (O6MGT) es capaz de
  transferir los grupos metilos de la METIL-GUANINA al residuo de CISTEINA del Enzima.
             METIL-GUANINA
                                                               •O6MGT
     CH3      O
              6
             mG                                         HS      CH2



     CH3      O GUANINA                       METIL-CISTEINA

              6
                                              CH3        HS     CH2



                       La mutación se repara sin corte del ADN.
Módulo I                                                                                 33
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN

                                                           BASE EXCISION REPAIR (BER)
                           Base Mutada
 •ADN
    A      T       G       C       T       G       A       C       G                             A        T       G    C   T   G    A       C   G

   T       A       C       G               C       T       G       C                          T       A       C       G        C    T       G   C

                                                                                                                      GLICOLASA
La mutación puede estar producida por una                                              La enzima GLICOLASA reconoce y elimina
deaminación o depurinación.                                                                        la base mutada.
                                                                                                                       Zona AP

       A       T       G       C       T       G       A       C       G                          A       T       G    C   T   G        A   C   G

       T   A           C    G                  C       T       G       C                         T    A           C    G       C    T       G   C

 La enzima AP ENDONUCLEASA elimina                                                                                AP Endonucleasa
                                                                                           La zona sin la base se conoce como zona AP y es
 la ribosa y el fósforo, generando un gap.
                                                                                           donde se une la enzima AP ENDONUCLEASA.


           ADN POLIMERASA                                  A       T       G   C   T   G      A       C       G            La ADN POLIMERASA y
                  +                                                                                                        la LIGASA, restablecen la
               LIGASA                                  T       A       C       G   A   C     T        G       C            cadena original.
Módulo I                                                                                                                                               34
MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN
                            NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER)
                 Lesión del ADN                      3º Acción de ENDONUCLEASAS, ERCC1 corta
                                                                 en 5’ y XPG corta en 3’.

                                                                     XPA   RPA
                                                                    XPC-R23
1º- Proteínas específicas detectan la lesión.                     E           X
                                                                  R           P
                       XPA   RPA                                  C           G
                                                                      TFIIH
                       XPC-R23                                    C
                                                                  1
                                                       Son eliminados de 25 a 30 nucleótidos
                                                               cercanos a la lesión.
  2º- Desenrollamiento del ADN, cerca de la lesión
          por el complejo proteíco TFIIH.

                         XPA   RPA
                         XPC-R23                     4º Polimerasas (Pol d) PCNA y LIGASAS
                                                            sintetizan una nueva cadena.
                                                                 Pol d            LIGS
                           TFIIH

                                                                         PCNA
Módulo I                                                                                       35
EL CICLO CELULAR

        ● La capacidad de una célula en transformarse en dos es
          una propiedad fundamental de los organismos vivos. Con
          el nombre de Ciclo Celular agrupamos el conjunto de
          eventos biológicos que permiten la división celular.

        ● La división celular consta de cuatro fases coordinadas:

               1. Crecimiento Celular.
               2. Duplicación del ADN.
               3. Correcta distribución del ADN a las células hijas.
               4. División en dos células hijas (Cytokinesis).

        ● La progresión en cada una de estas fases está controlada
          por un complejo conjunto proteico.

Módulo II                                                              1
CICLO CELULAR: FASES

                                       2n
                           4n
                                             I MITOSIS:
 IV G2. Intervalo                      2n      División celular. Cada
    antes de la                                célula hija tiene 2n
    Mitosis. Gran                              cromosomas.
    actividad                      M
    metabólica. Se         G2                      II G1. Intervalo antes de
    sintetizan las                                    la fase de síntesis. Hay
    proteínas para                                    crecimiento y actividad
    la Mitosis.                                       celular, pero no
                                                      duplicación del ADN.
                                                      La célula es todavía 2n.
            4n
                       S
III S. Fase                                         2n
    de Síntesis.                            G1
    Se duplica el
    ADN celular.
    La célula es 4n.
Módulo II                                                                        2
CICLO CELULAR: TIEMPOS
            La duración del ciclo celular varía considerablemente según el tipo de
            tejido. En cultivo, el ciclo celular dura 24 horas.


                     4h                         M
                                      G2                          1h

                       G2                                           M

                                 S                                      11h
                  8h                                 G1

                                          11h
                   S                            8h                      G1
                                                      4h
                                     1h

                                     M G1 S           G2
Módulo II                                                                            3
CICLO CELULAR: VARIACIONES

      La finalidad del ciclo celular es la división de la célula.
      Las células del organismo pueden dividirse en cuatro grupos
      en función de sus capacidades de proliferación.

               1. Células con alta capacidad proliferativa.

               2. Células con nula capacidad proliferativa.

               3. Células con capacidad proliferativa ocasional.

                4. Células con capacidad proliferativa constante.

     El ciclo celular presenta características propias en cada uno de
     estos grupos.

Módulo II                                                               4
CICLO CELULAR: VARIACIONES
                1. Células con alta capacidad proliferativa.
      Es característica de células que se dividen a gran velocidad,
      como sucede en las primeras fases de la embriogénesis y
      ciertos tipos tumorales. El ciclo celular puede durar 30 minutos.
      No hay fases G1 y G2, la Mitosis (M) alterna con la fase de
      síntesis (S).
                                             M                      2n
                                                      4n
            M                                                       2n
                                   2n
                                             S
   4n                 4n                    M
                                   2n                               2n
            S
                                                      4n
                                             S                      2n
Módulo II                                                                 5
CICLO CELULAR: VARIACIONES
               2. Células con nula capacidad proliferativa
      Son grupos celulares altamente diferenciados y que han perdido
      su capacidad de división. Por ejemplo, células nerviosas y
      músculo cardíaco.
               G2
    S




                     M
            G1




                       División celular         Alta diferenciación
                       sólo durante la          celular. Se pierde la
                       embriogénesis.              capacidad de
                                                      división.
Módulo II                                                               6
CICLO CELULAR: VARIACIONES
               3. Células con capacidad proliferativa ocasional
        Algunos tejidos se caracterizan porque sus células abandonan la fase G1
        y entran en fase G0, que se caracteriza por tener baja actividad metabólica
        y nula proliferación (quiescencia). Sin embargo, cuando las condiciones lo
        requieren, entran de nuevo en G1 y continúan la división celular.
                                                     2n
                          M         4n
            G2                                       2n

                                                           Cuando hay lesión o muerte
                                                           celular, factores externos
                                                           favorecen la entrada en G1.

                                                               Fibroblastos y células
    S                                                   G0     epiteliales de: Hígado,
                                                               Pulmón, Páncreas,
                                  G1                           Riñón, Próstata y Mama.
                                                               Entran en fase
                                                               quiescente G0.
Módulo II                                                                                7
CICLO CELULAR: VARIACIONES
             4. Células con capacidad proliferativa constante.
       En los tejidos con alta tasa de proliferación y muerte celular, como tejido
       epitelial, tracto digestivo y sangre, existen células con gran capacidad de
       división, son las células madre, que reemplazan a las células diferenciadas
       que desaparecen.
                                                           Diferenciación
                                 Célula madre                  celular
                                                    2n
                                   4n
                    M
            G2
                                                    2n Célula madre

      S
                         G1

        Algunos tumores se caracterizan por presentar sólo células madre; no hay
        diferenciación celular.
Módulo II                                                                            8
CONTROL DEL CICLO CELULAR
 Diversos factores de crecimiento, permiten que las células en G0, entren en el ciclo
 celular al final de la fase G1. Es el Restriction Point (RP). Existen, además, tres
 puntos de chequeo “Checkpoints” (ChP). Al final de G1, al final de G2 y al final
 de M. Los ChP aseguran que el ADN está en perfectas condiciones para seguir a
 través del ciclo celular.

                           Al final de la Mitosis hay un checkpoint que
                       asegura una distribución equitativa de cromosomas
                                         a cada célula hija.


   Si el ADN no se ha                                            Factores de crecimiento, PDGF,
  replicado totalmente                  ChP                      EGF e IGF-I, inducen las células
                                              M                  en G0, entran en el ciclo celular,
            en la Fase S,         G2                             superan el Restriction Point (RP) y
        el ciclo se para      ChP
    en G2, impidiendo                                            siguen por la Fase S.
 el inicio de la Mitosis
           hasta que la                                          El RP es, además, un punto de
             Replicación
            es completa.      S                        RP        chequeo frente a lesiones
                                                                 externas del ADN. La p53 actúa
   Lesiones en el ADN
 frenan el ciclo en G2,                            G1            a este nivel, frena el ciclo e impide
                                                                 que el ADN lesionado entre en
  hasta su reparación.                                           Fase S.
Módulo II                                                                                                9
MOLÉCULAS QUE REGULAN EL CICLO CELULAR. NIVEL G2/M
  Actúa la proteína cdc2 (cell division cycle mutant) conocida también como
  Cdk1(Cyclin-dependent kinase). En la fase G2/M, la Cdk1 se une a una ciclina B
  (CyB) que se sintetiza durante la fase S. El dímero Cdk1-CyB, permite la Mitosis .
  Al complejo Cdk1-CyB también se le conoce como MPF (Maturation Promoting
  Factor).
                           Desfosforilación       CyB
               CyB         aa14 y aa15
                                                                   CyB   Complejo activador
                                                         14
                                                         14   P
                   14 P
                   14                             Cdk1            Cdk1   de la MITOSIS
               Cdk1                               161    15
                                                         15
                      15
                      15                                           161
                161
                                                  P      P               Al final de la Mitosis se
               P      P                                            P
                                                                         degrada la CyB
        Se fosforilan los aa 167(THR),15(TYR) y
                    14 (THR) de Cdk1                                                       CyB
                                                                  G2     M
    CyB                                                                                    Cdk1
                                                                                            161
    Cdk1
                                                                                           P
Al inicio de G2, Cdk1 se une a la CyB
                                                         S
             Síntesis de CiclinaB durante
   CyB       la fase S. Alcanza un máximo
             al inicio de G2                                                 G1
Módulo II                                                                                            10
MOLÉCULAS QUE REGULAN EL CICLO CELULAR
              Distintas ciclinas y Cdk actúan a lo largo de las fases G1 y S.
                                                              DURANTE G1

                                                          CyD                   CyD
                                           M
                                                          Cdk2                  Cdk4
                            G2
                                                                     CyD
                                                                     Cdk6

PROGRESIÓN A
 TRAVÉS DE   S
   FASE S.                                                      AL FINAL DE G1
                                                    G1
                                                                    CyE
            CyA
                                                                    Cdk2
            Cdk2
                                                    Permiten la transición de G1 a S.
Módulo II                                                                               11
DIVISIÓN CELULAR: LA MITOSIS
  En los mamíferos, durante la mitosis se producen los eventos
  siguientes:
   • El ADN se condensa, se duplica y los cromosomas se hacen
     visibles al microscopio.
   • Se rompe la membrana nuclear.
   • El citoesqueleto celular se reorganiza y forma el huso mitótico.
   • Los cromosomas se desplazan y se unen a los filamentos del
     huso mitótico.
   • Los cromosomas duplicados se separan y se reparten
     equitativamente a cada polo celular.
   • Aparición de una nueva membrana nuclear que envuelve a los
     cromosomas.
Módulo II                                                               12
DIVISIÓN CELULAR: FASES DE LA MITOSIS

    Todos los eventos anteriormente citados se han dividido
    en cuatro períodos de tiempo que se conocen como:


                    ● PROFASE

                    ● METAFASE

                    ● ANAFASE

                    ● TELOFASE
Módulo II                                                     13
PROFASE-I
      CyB    Acción del complejo activador de la
      Cdk1               MITOSIS.
      161

      P         Condensación del ADN.
                Aparición de los cromosomas.



                             Cada cromosoma está duplicado: 2 cromátidas.

                                      El centrosoma se duplica y
                                     se deplaza hacia los polos.

                                Los microtúbulos se constituyen a partir de los
                                centrosomas para formar el huso mitótico.




                              Se degrada la membrana nuclear.
Módulo II                                                                         14
PROFASE-II
                          Los microtúbulos conectan con zonas
                          muy específicas de los cromosomas,
                          denominadas Centrosomas.

                             Los centrosomas son la zona de unión de las
                             dos cromátidas.
                                                   En los centrosomas
                                                   se unen proteínas
                                                   específicas para formar
                                                   el Kinetocoro.




            Los microtúbulos                        Los microtúbulos están
            se unen al Kinetocoro.                  formados por unidades
                                                    de α y β tubulina.


Módulo II                                                                    15
METAFASE




            Durante la metafase los microtúbulos
             se sitúan en el ecuador de la célula
                 formando el huso mitótico.

Módulo II                                           16
ANAFASE




               En la anafase hay una contracción
            (despolimerización) de los microtúbulos,
                que separan las dos cromátidas.

Módulo II                                              17
TELOFASE

  Contracción de la membrana           Formación de membranas
        citoplasmática.                      nucleares.




            Descompactación de las cromátidas y distribución
               equitativa de cromosomas en cada núcleo.

Módulo II                                                       18
TELOFASE
                   Al final de la Mitosis se degrada la CyB               CyB
                                                                          Cdk1
                                                                           161

                                                                          P




            Aparece un anillo de contracción formado por ACTINA y MIOSINA II,
            que permite la separación de las dos células hijas: es la CITOKINESIS.




Módulo II                                                                            19
MUTACIONES: DEFINICIONES


            TÉRMINO                   DEFINICIÓN


     MUTACIÓN: Cambio hereditable en la secuencia genética de un organismo.

     MUTANTE: Organismo portador de una o más mutaciones en su genoma.

     GENOTIPO: Información genética codificada en el genoma de un organismo.

     FENOTIPO: Manifestación externa del genotipo.

     MUTÁGENO: Agente que incrementa la frecuencia de mutaciones.

     MUTAGÉNESIS: Procesos que conducen a las mutaciones.


Módulo II                                                                      20
MUTACIÓN PUNTUAL: SUSTITUCIÓN DE UNA BASE

                         ADN NO MUTADO
    5’                  PROMOTOR                                                  3’

     C      G   G   C     G    G   C   C   G   A T G C T G              A C G A C T
                                                             ACCATC

    G       C   C   G    C    C    G   G   C   T A C G A C TGGTAG
                                                T A                     T G C T G A
                                                                                      5’

   3’                                            EXÓN 1       Intrón1    EXÓN 2


                              ADN MUTADO

    5’                  PROMOTOR                                                  3’

     C      G   G   C     G    G   C   C   G   A T G A T G              A C G A C T
                                                           ACCATC

    G       C   C   G    C    C    G   G   C   T A C T A C TGGTAG
                                                T A                     T G C T G A
                                                                                      5’

   3’                                           EXÓN 1       Intrón1     EXÓN 2

         Mutación localizada en exón 1, cambio de C por A en el segundo codón.
Módulo II                                                                                  21
MUTACION PUNTUAL: SUSTITUCIÓN DE UNA BASE
                                                                              ADN MUTADO A por G
            La mutación en el ADN se transmite                                                              3’
                      en el mARN,                       A T G A T G                            A C G A C T
            ZONA PROMOTORA ACTIVADA                                            ACCATC
  5’
                                                       U A C           C      UGGUAG U G C
                                                                   U A                     U G A
   C    G       G    C   G      G    C    C   G

                                                                           mARN
  G    C       C     G   C   C      G     G   C


 3’                                                      T A C G A C TGGTAG                T G C T G A
                                                                                                             5’
       CODÓN WT
                     Codifica
                       para
        G      A C                  ASP
                                              5’      A U      G                                            3’
                                                                    U   A C      U    G    C    U   G   A
       CODÓN MUTADO
                                              m7G
                     Codifica
                       para
        U      A C                  TYR
                                                    Codifica       Codifica      Codifica No codifica para
                                                      para           para          para ningún aminoácido.
            CAMBIO DE UN SOLO
            NUCLEÓTIDO SUPONE
            CAMBIO DE AA                              MET            TYR             CYS        STOP
Módulo II                                                                                                        22
MUTACIÓN PUNTUAL: TIPOS


            TÉRMINO                DEFINICIÓN

            TRANSICIÓN     Cambio (>) de una base Púrica por otra Púrica
                           o Pirimidínica por otra Pirimidínica.
                            G>A, A>G, C>T, T>C


            TRANSVERSIÓN   Cambio de una base Púrica por otra
            Pirimidínica
                           o una Pirimidínica por una Púrica.
                            G>T, G>C, A>T, A>C, T>A, T>G,
                            C>A, C>G




Módulo II                                                                  23
MUTACIÓN PUNTUAL: INCORPORACIÓN DE UNA BASE
                 (FRAMESHIFT +)

    5’                          PROMOTOR                                                                       3’
                                                                ADN NO MUTADO
      C     G       G       C       G       G       C        C       G      A T G C T G              A C G A C T
                                                                                           ACCATC

    G       C       C       G       C       C       G       G       C       T A C G A C TGGTAG
                                                                             T A                     T G C T G A
                                                                                                                   5’

   3’                                                                        EXÓN 1        Intrón1    EXÓN 2


      5’                        PROMOTOR                            ADN MUTADO                                     3’

        C       G       G       C       G       G       C       C       G   A T G CT T G              A C G A C T
                                                                                           ACCATC

      G     C       C       G       C       C       G        G       C      T A C G A C TGGTAG
                                                                             T A                     T G C T G A
                                                                                                                   5’

    3’
                                                                             EXÓN 1        Intrón1    EXÓN 2


                                                            INCORPORACIÓN DE UNA TIMINA (T)
                                                            EN EL SEGUNDO CODÓN DEL EXÓN 1.
Módulo II                                                                                                               24
MUTACIÓN PUNTUAL: INCORPORACIÓN DE UNA BASE (FRAMESHIFT +)
                                                                ADN TEMPLATE CON T INCORPORADA
         Incorporación de A en el mARN                                                                          3’
                                                                 A T G CT T G                      A C G A C T
             ZONA PROMOTORA ACTIVADA                                                  ACCATC
   5’
                                                                U A C G A A C
                                                                              UGGUAG U G C
                                                                                           U G A
    C       G   G     C     G     G     C    C    G

                                                                                   mARN
   G     C      C     G     C    C    G     G    C


  3’                                                               T A C G A C TGGTAG              T G C T G A
                                                                                                                      5’
 mARN WT. Lectura codones en base 3                                 mARN mutado. Lectura codones en base 3

    A U G           G A C       U G C U         G A                        A U G G A A C U G C U           G A




   Codifica Codifica
                                         No codifica para
                                Codifica ningún aminoácido                Codifica Codifica Codifica Codifica
                                                                            para     para     para     para
     para     para                para
        MET          ASP          CYS       STOP      Proteína distinta     MET      GLU     LEU     LEU

                                                                  La incorporación de A altera la pauta de lectura.
        Secuencia proteína WT                                      Secuencia proteína mutada
Módulo II                                                                                                             25
CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES
            SECUENCIA WT             AU G G AC U G C U G A


            PROTEÍNA WT              MET     ASP      CYS STOP

    TIPO          CAUSAS                              EJEMPLOS

                                      CODÓN WT         CODÓN MUTADO              PROTEÍNA MUTADA
MISSENSE
                • Mutación         G AC       ASP       U AC          TYR       MET TYR CYS STOP
                  Puntual

                • Adición          G AC      ASP       A AC           GLU       MET GLU LEU LEU
                  de bases
                                                      La incorporación de A altera la pauta de lectura
                  Frameshift +
                • Delección
                                   G AC      ASP        AC U          THR       MET THR ALA
                  de bases
                  Frameshift -                  La pérdida de una base (G) altera la pauta de lectura

                                     EFECTOS FENOTÍPICOS
        Pérdida total de la función de la proteína o Pérdida parcial de la función proteica
                        o Ganancia de función o Alteración de la función.
Módulo II                                                                                                26
CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES

             SECUENCIA WT              AU G G AC U G C U G A


               PROTEÍNA WT               MET   ASP    CYS STOP

     TIPO         CAUSAS                          EJEMPLOS


                                    CODÓN WT         CODÓN MUTADO
 SILENTE                                                             Cuando la mutación
                  • Mutación      G AC      ASP       GA U       ASP está en la tercera base
                    Puntual                                          no cambia el AA.

                                         MET ASP CYS STOP           No hay cambio proteico.


                                   EFECTOS FENOTÍPICOS

        No hay cambio de AA. La proteína queda igual. No hay ningún efecto detectable.



Módulo II                                                                                      27
CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES
       SECUENCIA WT               AU G G AC U G C U G A


        PROTEÍNA WT               MET      ASP      CYS STOP

    TIPO          CAUSAS                              EJEMPLOS

NONSENSE                         Se produce siempre que una mutación puntual o un
                • Mutación       frameshift + ó -, introduce uno de los tres codones de paro.
                  Puntual                         UAG , UAA , UGA
                                     CODÓN WT            CODÓN MUTADO
                • Adición
                                  G AC        ASP       U G AC                                  STOP
                 de bases                                                  U G AC
                 Frameshift +                     Adición de U      Cambio pauta lectura
                • Delección
                  de bases                                                       PROTEÍNA MUTADA
                  Frameshift -                                                       MET STOP

                                      EFECTOS FENOTÍPICOS
           Se produce una proteína truncada que puede dar lugar a: Pérdida total de la
                                             función
        o Pérdida parcial de la función o Ganancia de función o Alteración de la función.
Módulo II                                                                                              28
LOCALIZACIÓN Y EFECTOS DE LAS MUTACIONES
     5’                   PROMOTOR                                                      3’

      C     G   G      C    G   G    C   C     G     A T G C T G              A C G A C T
                                                                   ACCATC

     G      C   C     G    C    C   G    G    C      T A C G A C TGGTAG
                                                      T A                    T G C T G A
                                                                                           5’

    3’                                                 EXÓN 1      Intrón1     EXÓN 2



                  EN ZONA                         EN ZONA           EN ZONA
                PROMOTORA                         EXÓNICA          INTRÓNICA


                     EFECTOS                      EFECTOS           EFECTOS
                      • Aumento              •Mut. Missense         •Sin efectos
                           o                                       •Excepto si se
                    Reducción de             •Mut. Nonsense        producen en
                     la expresión                                    áreas de
                        génica.              •Mut. Silentes          Splicing.


Módulo II                                                                                       29
APOPTOSIS
   ●   La apoptosis es un mecanismo de autodestrucción celular.
   ●   Las células poseen en sus membranas celulares unas
       proteínas que actúan como sensores y que se conocen como
       “Death Receptors”.
   ●   Los “Death Receptors” se activan por la presencia de
       señales externas (Ligandos, “Death Ligands”).
   ●   La unión Death Receptors - Death Ligands activa
       reacciones bioquímicas en el citoplasma celular que
       conducen a la muerte celular, apoptosis.
   ●   La característica más típica de apoptosis es la
       fragmentación del ADN.

Módulo III                                                        1
APOPTOSIS
      CARACTERÍSTICAS DE LOS “DEATH RECEPTORS” (SENSORES)


                  3º-Los ligandos         1º-Porción extracelular
    Espacio -     “Death Ligands”         presenta aminoácidos
   Extracelular   se unen al CRDs.           ricos en cisteínas
                                         (Cysteine-Rich-Domain)
                                                  (CRDs).

 Membrana
Citoplasmática

                    4º-Proteínas        2º- Porción citoplasmática
                    adaptadoras              se conoce como
   Espacio -
                   se unen a los             “Death Domain”
 Citoplasmático
                      “Death                       (DD).
                     Domain”.

Módulo III                                                           2
APOPTOSIS
         PRINCIPALES “DEATH RECEPTORS” Y “DEATH LIGANDS”
     ● Cada “DEATH RECEPTOR” tiene su “DEATH LIGAND”.
     ● Los “DEATH RECEPTORS” y los “DEATH LIGANDS” tienen diferentes
       nombres:
        DEATH                          DEATH
      RECEPTORS        SINÓNIMO       LIGANDS        SINÓNIMO
               Fas       CD95            FasL           CD95L
                         Apo-1
             TNFR1        P55            TNF
                        CD120a
              DR3        Apo3           Apo3L          TWEAK
                        WSL-1
                        TRAMP
                         LARD
             DR4/DR5     Apo2           Apo2L           TRAIL
                       TRAIL-R2
                        TRICK2
                        KILLER
Módulo III                                                             3
APOPTOSIS A TRAVÉS DE FAS
                         DEATH
                                                           DEATH
                         LIGAND
                                                         RECEPTOR
                      FasL/CD95L
                                                         FAS/CD95



                                               DD         En una zona de la proteína
                                                           FADD denominda “ Death
                                                            Effector Domain” se une
                                               FADD       una proteasa (procaspasa 8)
        El acoplamiento del                                 que es transformada en
           Ligando con el                                         CASPASA 8.
                                             Procaspasa 8
        Receptor, induce la
        unión de proteínas
           denominadas               Caspasa 8 que
          Fas-Associated             activa Caspasa 3.
           Death Domain
          (FADD) o Mort             Caspasa 3                   Caspasa 3
             en la zona            Produce
        Death Domain (DD)          APOPTOSIS
     de la proteína receptora.     por fragmentación
Módulo III                         del ADN.                                        4
CONTROL MITOCONDRIAL DE LA APOPTOSIS
      ● La liberación de Citocromo C mitocondrial es el principal
        factor activador de la apoptosis.

      ● Existen proteínas que inhiben la liberación de Citocromo C,
        son las anti-apoptóticas.

      ● Existen proteínas que activan la liberación de Citocromo C,
        son las pro-apoptóticas.

                 ANTI-APOPTOSIS         PRO-APOPTOSIS

                       Bcl-2                 Bad
                                             Bid
                     BcL-XL                  Bax
                                             Bim

Módulo III                                                            5
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA Bcl-2

     LOCALIZACIÓN: Cromosoma 18q21.
     PROTEÍNA: Consta de 239 aminoácidos.
      • Presenta zonas hidrofóbicas que permiten su anclaje
        a las membranas celulares.
      • Estas zonas son necesarias para su actividad
        anti-apoptosis.
      • Principalmente se localiza en la cara externa de la
        membrana mitocondrial.
     FUNCIÓN: Inhibe la liberación del Citocromo C, que es un
     activador de las caspasas que activan la apoptosis.
       • Bcl-2 es inhibido por las proteínas Bax y Bim.
       • En los tumores, el gen está hipometilado en la zona
         promotora y, por lo tanto, la proteína está
         sobreexpresada.
Módulo III                                                      6
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA Bcl-XL

     LOCALIZACIÓN: Cromosoma 20q11.1.
     PROTEÍNA: Consta de 233 aminoácidos.
      • Se han descrito mutaciones que afectan a la función
        proteica.
      • Las localizadas en los aa 131, 133, 138 y 148, afectan
        a la unión con Bax.
      • Se localiza en la cara externa de la membrana
        mitocondrial.
     FUNCIÓN: Inhibe la liberación del Citocromo C, que es
     un activador de las caspasas que activan la apoptosis.
      • Bcl-XL es inhibido por la proteína Bad.

Módulo III                                                       7
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BAD

     LOCALIZACIÓN: Cromosoma 11q13.1.

     PROTEÍNA: Consta de 168 aminoácidos.
      • Se localiza en la cara externa de la membrana
        mitocondrial.
      • Cuando está fosforilada (en los aa Ser-75, Ser-99 y
        Ser-118) se localiza en el citoplasma.

     FUNCIÓN: Promueve la apoptosis.
      • Inhibe la acción de las proteínas anti-apoptosis,
        Bcl-2 y Bcl-XL.

Módulo III                                                    8
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BID

    LOCALIZACIÓN: Cromosoma 22q11.1.

    PROTEÍNA: Consta de 195 aminoácidos.
     • Su localización es predominantemente
       citoplasmática.

    FUNCIÓN: Promueve la apoptosis.
     • La caspasa 8 rompe la proteína formando una
       subunidad (tBid) que se une a la membrana
       mitocondrial, favoreciendo la liberación del
       citocromo.


Módulo III                                            9
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BAX

     LOCALIZACIÓN: Cromosoma 19q13.3-q13.4.

     PROTEÍNA: Consta de 192 aminoácidos.
      • Variaciones en el aa 11 se asocia al plasmocitoma,
        variaciones en el aa 67 a la leucemia linfoblástica
        aguda y variaciones en el aa 108, con el linfoma
        de Burkitt.
      • Se localiza en la cara externa de la membrana
        mitocondrial.

     FUNCIÓN: Promueve la apoptosis por liberación
     del Citocromo C mitocondrial.
Módulo III                                                    10
GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BIM

    LOCALIZACIÓN: Cromosoma 2q12.3.

    PROTEÍNA: Consta de 198 aminoácidos.
     • Existen dos isoformas (BimL y BimEL), la
       Isoforma BimL presenta variaciones en los aa 42
       a 101 y es más potente que la Isoforma BimEL.
     • Se localiza en las membranas intra
       citoplasmáticas.

    FUNCIÓN: Promueve la apoptosis, inhibe la acción
    de Bcl-2.


Módulo III                                               11
APOPTOSIS A TRAVÉS DE BID
                      DEATH
                                                            DEATH
                      LIGAND
                                                          RECEPTOR
                   FasL/CD95L                              FAS/CD95



                                                DD              En una zona de la proteína
                                                                FADD denominada “ Death
                                                   FADD          Effector Domain” se une
                   Caspasa 8                                    una proteasa (procaspasa 8)
                                                                  que es transformada en
                                             Procaspasa 8              CASPASA 8.
                                                                                Caspasa -9
                                                                          C
                                                            C
             BID                tBid        tBid
                                                                          Caspasa -3
                               tBid activa y libera
     Caspasa 8
                               el Citocromo C
Fracciona la proteína
                               mitocondrial que
        bid.
                               activa caspasa 9 y 3.
                                                                       APOPTOSIS
Módulo III                                                                                    12
BCL-2 Y BCL-XL
    Bcl-2 y Bcl-XL inihen la síntesis de Citocromo C y, en consecuencia,
    inhiben la apoptosis.



                 Bcl-XL                          Bcl-2


                                                               Caspasa -9
                                    C                     C


                                                           Caspasa -3


               Diversos factores activan
               el Citocromo C mitocondrial,
               que liberado al citoplasma se une a       APOPTOSIS
               las caspasas activando la apoptosis.
Módulo III                                                                  13
APOPTOSIS A TRAVÉS DE BAX Y BIM

                              Diversos estímulos externos
                              pueden activar Bax y Bim.




                Bax                     Bim

                      Bax       Bim     Bax y Bim se unen a la
                                        membrana mitocondrial
                                        e inhiben la acción de
                      Bcl-2     Bcl-2
                                        Bcl-2.



Módulo III                                                       14
CÁNCER DE PULMÓN

• Generalidades.

• Genes y proteínas relacionados con el
  cáncer de pulmón.

• Mecanismos de acción de los genes y
  proteínas relacionados con el cáncer de
  pulmón.

                                            1
GENERALIDADES DEL CÁNCER DE PULMÓN

Histológica y clínicamente el cáncer de pulmón se
divide en SCLC (cáncer de célula pequeña) y NSCLC
(cáncer de célula no pequeña).


 • SCLC. Características neuroendocrinas.


 • NSCLC. Incluye:
             Adenocarcinoma.
             Carcinoma escamoso.
             Carcinoma células grandes.

                                                    2
PRINCIPALES ALTERACIONES MOLECULARES
 RELACIONADAS CON EL CÁNCER DE PULMÓN

  GENES SUPRESORES           GENES RELACIONADOS
   TUMORALES (TSG)            CON ACTIVACIÓN DE
                                   SEÑALES
p53
p16INK4a-CiclinaD1-CDK4-RB     RAS           KIT
FHIT                           EGFR          GRP
RASSF1A                        HER2/neu      MYC



 ALTERACIONES DE LA             INESTABILIDAD
    METILACIÓN                 GENÓMICA (MSI)

         p16INK4a
                                 CROMOSOMAS
          DAPK
                              3p, 5q, 9p, 11q, 13q, 17p,
          GSTP1
                                     18q y 22q
          MGMT

                                                           3
GENERALIDADES DEL GEN p53

LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3.

GEN: Consta de 11 exones.

PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos.
• Posee 3 dominios: uno, en extremo inicial N, activador de la
  transcripción; uno, central para unirse al ADN, y uno,
  en extremo C terminal de oligomerización.
• p53 es funcional cuando está en forma tetramérica.
MUTACIONES: En el cáncer de pulmón, la mayor parte
de las mutaciones están localizadas en los exones 5 y 8.

EFECTOS DEL TABACO: Produce transversiones G-T
y mutaciones en codones 157, 248 y 273.
                                                                 4
GENERALIDADES DEL GEN p53
            FRECUENCIA MUTACIONES p53

                              SCLC

                           75-100%


                             NSCLC
                               47%
                 Adenocarcinomas              - 39%
                 Carcinomas escamosos         - 51%
                 Carcinomas células grandes   - 54%



Tammemagi MC et al. 1999. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8:625-634
                                                                       5
GENERALIDADES DEL GEN p53
CARACTERÍSTICAS DE LAS MUTACIONES DE p53

      • 70-80% son mutaciones missense que prolongan
           la vida media de la proteína y pueden ser
              detectadas por inmunohistoquímica.


       • 20-30% son mutaciones nonsense, delecciones,
           inserciones o errores de splicing y no son
             detectables por inmunohistoquímica.


          • Mutaciones de p53 en adenocarcinomas se
                 asocian a un mal pronóstico.

Mitsudomi et al 2000. Clin Cancer Res 6:4055-4063.
                                                        6
LA PROTEÍNA p53
                               FORMA LINEAL
Extremo amino-terminal          Parte Central               Extremo Carboxiterminal


       N                                                                    C


     Responsable de activar    Zona de unión al ADN.         Responsable de la
        la transcripción.                              oligomerización de la proteína.


   FORMA GLOBULAR
   La forma activa de p53
        es globular y
         tetramérica



                                                                                         7
CÓMO ACTÚA p53
                1º                                                 2º




                 p53
                                                   M
                                                                         p21 3º
                                      G2
                                                              G1
                                                       CyE CyD
                                 5º        XPA RPA
                                                       Cdk2 Cdk4
                                        E XPC-R23 X       p21
                                        R
                                        C
                                                  P
                                                  G
                                                                        4º
                                        C   TFIIH
                                        1
                                               S
   1º Una lesión en el ADN estimula la síntesis de p53, su tetramerización y su vida media en el

      citoplasma celular.
   2º p53 se une al ADN para estimular la síntesis de p21.
   3º p21 se une a los complejos CyE/Cdk2 y CyD/Cdk4, parando el ciclo celular en G1.
4º Durante la parada del ciclo celular actúan los enzimas que repararán la lesión del ADN.
5º Una vez reparada la lesión, continúan las fases de síntesis, G2 y mitosis.
                                                                                                   8
LA PROTEÍNA p53 MUTADA
                                  FORMA LINEAL
Extremo amino-terminal               Parte Central                  Extremo Carboxiterminal


        N                  1º                                                     C
                                            157 245 /248
                                                          273 282
                                                              Responsable de la
     Responsable de activar        Zona de unión al ADN oligomerización de la proteína
        la transcripción
                                                      2º


  FORMA GLOBULAR
    p53 MUTADA



 1º Las mutaciones más frecuentes aparecen en la zona de la proteína que se une al ADN.

2º Las mutaciones cambian la estructura de la proteína.

                                                                                              9
CÓMO ACTÚA p53 MUTADA
               1º                                                      2º




                                                    M
                                                                             p21 3º
                                      G2
                                6º                                G1
                                                         CyE CyD
                                                         Cdk2 Cdk4
                                                                            4º
                                                        5º
                                                S
1º Una lesión en el ADN estimula la síntesis de p53. 3º La ausencia de p21 impide la parada del ciclo celular.
   Si p53 está mutada hay dificultades en la
                                                    4º No hay reparación de la lesión del ADN.
   tetramerización y la vida media de la proteína
   en el citoplasma celular es muy corta.             5º Los errores se acumulan y propagan en las fases de
                                                         síntesis, G2 y Mitosis.
2º p53 mutada no puede unirse al ADN y, por lo
   tanto, no hay síntesis de p21.                   6º Las mutaciones pueden conducir a la carcinogénesis.

                                                                                                                 10
p53 COMO TERAPIA GÉNICA
      En tumores accesibles              La finalidad es que p53
           por punción                 active la apoptosis tumoral




      Se inyecta p53 normal               Con reducción total
                                          o parcial del tumor
           RESULTADOS CLÍNICOS VARIABLES
                         • En 19 pacientes:
  RC 1(5%), RP 11(58%), EE 3(16%), PE 2 (11%), NE 2(11%)
          (Swisher et al 1999. J Natl Cancer Inst 91:763-771)
                         • En 25 pacientes:
No diferencias entre quimioterapia sola versus quimioterapia + p53
     (48% respuestas objetivas versus 58%, respectivamente)
         (Schuler et al 2001. J Clin Oncol 19:1750-1758)             11
GENERALIDADES DEL COMPLEJO
              p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB
El complejo p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB regula la transición de G1
a S en el ciclo celular.
                            p16INK4a
El gen MTS1 da lugar a un mARN llamado INK4a, que codifica para
una proteína denominada p16INK4a .

     GEN MTS1


                 mARN INK4a



                Proteína p16 INK4a


          Proteína p16INK4a inhibe el complejo ciclina D1-CDK4
                                                                     12
GENERALIDADES DEL COMPLEJO
               p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB
                          El gen Rb
El gen Rb (Retinoblastoma) consta de 27 exones y codifica para una
proteína de 928 aminoácidos.
La proteína Rb se expresa en todas las células del organismo, y
cuando está hipofosforilada se une a las proteínas E2F. El complejo
Rb-E2F bloquea el ciclo celular en las fases de G1 a S.

       Rb
                                    G2       M


       E2F
                              S                 Rb

                                                 G1
                                                E2F                   13
GENERALIDADES DEL COMPLEJO
    p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB
El complejo proteico Ciclina D1-CDK4 hiperfosforila a la
   proteína Rb.
            G2       M


                          P
        S        P        Rb P                CyD
                          G1                  Cdk4
                          E2F
Cuando Rb está hiperfosforilada, Rb se libera de E2F, se
desbloquea el ciclo celular y E2F activa la transcripción de
genes.
            G2       M


                         P
       S         P   Rb P

                         G1
                         E2F                                   14
GENERALIDADES DEL COMPLEJO
              p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB
La proteína p16 inhibe la acción del complejo Ciclina D1-CDK4, por
lo que no hay hiperfosforilización de Rb.

              G2     M


                         P
                                     p16   INK4a
          S         P Rb P                         CyD
                         G1                        Cdk4
                         E2F
Si p16 está inactivado (por mutación, delección o hipermetilación) no
     hay inhibición del complejo Ciclina D1-CDK4 y sí fosforilación
continua de Rb, con la consecuente progresión del ciclo Celular y
transcripción de genes.
              G2     M


                         P
          S              Rb P                       CyD
                    P
                         G1
                                                    Cdk4
                               E2F                                      15
EL COMPLEJO p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB y
           CÁNCER DE PULMÓN


• En NSCLC la hipermetilación en la zona promotora
  de p16 se ha observado en un 30-70%.

• La inactivación de RB es más frecuente en SCLC
  (90%) que en NSCLC (15-30%).

• La inactivación simultánea de p16 y Rb no es frecuente
  en el cáncer de pulmón.


                                                           16
GENERALIDADES DEL GEN K-RAS
           EN CÁNCER DE PULMÓN

LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1.
PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos. Se une
          a la cara interna de la membrana
          citoplásmatica por el aa 186 y al
          GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119.

MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61. En el
cáncer de pulmón la frecuencia de mutaciones es del 15-20%.
   • Los adenocarcinomas representan 20-30%.
   • El 70% de las mutaciones son transversiones G-T.
   • Las más frecuentes en el codon 12, el wt (wild type) es
      GGT (Glicina) y las mutaciones pueden ser TGT
      (Cisteína) o GTT (Valina).
                                                               17
CÓMO ACTÚA Ras NORMAL
1º Ras debe anclarse en la cara             2º Si no hay estímulo externo,
interna de la membrana celular                     Ras está inactivo




                       Farnesilo


                 Ras                                             P P
                                                          Ras    GDP
La proteína Ras (p21) consta de 121 aa.
Los tres últimos aa de Ras son eliminados   Como miembro de la superfamilia de
 por la enzima Farnesil Transferasa (FT).         proteínas G, Ras se une
                                              con gran afinidad a GDP o GTP.
  La FT incorpora un grupo Farnesilo,
 que permite el anclaje de Ras a la cara    Cuando Ras está unido a GDP, está
    interna de la membrana celular.                en forma inactiva.

                                                                                 18
CÓMO SE ACTIVA Ras NORMAL
1º      GF




                            3º
P                P   2º
P                P
                                                    4º
                              SOS
                                          P P P
P                P   Grb2                                               P P P
                                    Ras   GTP
                                                                  Ras   GTP




1º Un factor de crecimiento (GF) se une a un receptor de membrana y activa su
   fosforilación.
     2º La proteína Grb2 actúa como puente entre el GF fosforilado y la proteína SOS
        que fosforila Ras.
3º La proteína SOS es una Guanine nucleotide Exchange Factor (GEF), se une a
   Grb2 y este complejo permite la fosforilación del GDP del Ras, en GTP.
     4º El complejo Ras-GTP es la forma activa de Ras.
                                                                                       19
GENERALIDADES DEL COMPLEJO
              p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB
La proteína p16 inhibe la acción del complejo Ciclina D1-CDK4, por
lo que no hay hiperfosforilización de Rb.

              G2     M


                         P
                                     p16   INK4a
          S         P Rb P                         CyD
                         G1                        Cdk4
                         E2F
Si p16 está inactivado (por mutación, delección o hipermetilación) no
     hay inhibición del complejo Ciclina D1-CDK4 y sí fosforilación
continua de Rb, con la consecuente progresión del ciclo Celular y
transcripción de genes.
              G2     M


                         P
          S              Rb P                       CyD
                    P
                         G1
                                                    Cdk4
                               E2F                                      15
CÓMO ACTÚA Ras NORMAL ACTIVADO



       1º      2º             3º               4º
       P P P                                                 ER
 Ras   GTP          MEK               ERK                      K
 Raf


                                                    5º

1º Ras activado se une a la proteína Raf-kinasa.
2º El complejo Ras-GTP-Raf, activa la proteína MEK (MAP-kinasa/ERK Kinasa).
3º La proteína MEK activa a proteínas de la familia ERK (Extracellular
   signal-Regulated Kinase).
4º Las proteínas ERK se unen al ADN y actúan como factores de transcripción.
5º Los factores de transcripción activan la DIVISIÓN CELULAR.
                                                                               20
CÓMO SE REGULA Ras NORMAL ACTIVADO




                 GAP
         P P P                P P
   Ras   GTP           Ras GDP           MEK            ERK               ER
   Raf                                                                      K
                       Raf

            1º               2º

  AUSENCIA DE PROLIFERACIÓN CELULAR



1º La actividad de Ras es abolida por la enzima GAP (GTPase Activating Proteins)
   que produce la hidrólisis de GTP a GDP.
2º El complejo Ras-GDP, es inactivo, no permite la unión a Raf y, en consecuencia,
   no hay activación de MEK, ERK ni actividad mitótica.
                                                                                     21
CÓMO ACTÚA Ras MUTADO



           1º            2º   GAP   3º
       P P P                                                        ER
 Ras   GTP
                       P PP               MEK        ERK              K
                 Ras
 Raf                   GTP
                Raf
                                                           4º




1º Las mutaciones de Ras en el codón 12 son suficientes para cambiar la estructura
   de la proteína.
2º Ras mutado impide la actuación de GAP.
3º Al no actuar GAP, Ras está permanentemente en forma activa.
4º Hay proliferación celular constante.
                                                                                     22
OTROS GENES IMPLICADOS EN EL CÁNCER DE PULMÓN
                            • EGFR
  • Sobre-expresado en NSCLC (principalmente en carcinoma escamoso)
    Es raro en SCLC. El fármaco IRESSA® (gefitinib) inhibe el EGFR.
    Sirotnak et al 2000. Clin Cancer Res 60: 1871-1877.
                          • HER2/neu
  • Se expresa en un 30% en NSCLC (adenocarcinoma) y se asocia a
  una
    pobre supervivencia. El fármaco monoclonal HERCEPTIN®
  (trastuzumab) bloquea la actividad de HER2/neu. Agus DB et al 2000.
  Semin Oncol 27: 53-63.
                       RECEPTOR -KIT
  • Actúa como factor autocrino en el desarrollo del SCLC. El fármaco
    GLIVEC® (imatinib) ha comenzado a ensayarse en el SCLC.

          • GASTRIN-RELEASING-PEPTIDE (GRP)
  • El gen GRP se expresa en un 20-60% en SCLC y es poco frecuente
    en NSCLC .
                                                                        23
OTROS GENES IMPLICADOS EN EL CÁNCER DE PULMÓN



                     • FAMILIA MYC

   La familia MYC consta de 3 miembros: MYC, MYCN y MYCL.

   • Amplificaciones de MYCN y MYCL son características de
     SCLC. MYC se expresa en SCLC y en NSCLC, aunque de
     forma desigual .
                      • MYC en NSCLC: 8%
                      • MYC en SCLC: 18%




                                                             24
CÁNCER COLORRECTAL

           ● Generalidades.
           ● Genes y proteínas relacionados con el cáncer
             colorrectal.
           ● Mecanismos de acción de los genes y proteínas
             relacionados con el cáncer colorrectal.



Módulo V                                                     1
GENERALIDADES DEL CÁNCER COLORRECTAL

 Entre el 5 y el 10% de los cánceres colorrectales son
 hereditarios; hay dos formas de presentación:

 1- Poliposis Familiar Adenomatosa (FAP).
 Presenta numerosos Adenomas y mutaciones germinativas
 en el gen APC.

 2- Cáncer Hereditario no Polipósico (HNPCC o Síndrome de
 Lynch).
 Presenta mutaciones germinales en los genes que
 intervienen en la reparación de ADN, principalmente en
 hMSH2 en cromosoma 2p21 y hMSH1 en cromosoma 3p21.


Módulo V                                                    2
ALTERACIONES MOLECULARES RELACIONADAS CON
            EL CÁNCER COLORRECTAL

                              PÉRDIDAS DE
            GENES
                            HETEROZIGOCIDAD
               APC               (LOH)
                p53             CROMOSOMAS
               K-ras
               DCC                     50%
             hMSH2                17          18
              hMLH1
              hPMS1                    25%
              hPMS2       1q, 4p, 5q, 6p, 6q, 8p, 18p, 22q
           GTBP (hMSH6)
           hMSH3 (DUG)

Módulo V                                                     3
GENERALIDADES DEL GEN APC
               (Adenomatous Polyposis Coli, APC)

           LOCALIZACIÓN: Cromosoma 5q21.

           GEN: Consta de 15 exones.

           PROTEÍNA: Formada por 2843 aminoácidos. Su función
           no está del todo definida, pero se sugiere que regula la
           unión de la β-catenina con las proteínas del citoesqueleto.

       MUTACIONES: Se han descrito mutaciones en el cáncer
       colorrectal que afectan a los aminoácidos siguientes:
       890, 906, 911, 1027, 1307, 1313, 1317 y 1422.

Módulo V                                                                 4
CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL APC

                      GEN: CONSTA DE 15 EXONES




             CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE 2843 AA
           171   722 817 890 911 1176 1307 1317 1422          2738

    AA1                                                                 AA2843
     N                                                                   C

            414 784    880   906 1027 1184 1313 1348 1508   2621 2839

    Se han detectado mutaciones en el cáncer colorrectal que afectan
                     a los aminoácidos indicados.
Módulo V                                                                         5
CARACTERÍSTICAS DE LAS MUTACIONES-APC
       Nº AA       AA WT*   AA Mutado         Localización
          171       Ser       Ile       FAP
          414       Arg       Cys       FAP
          722       Ser       Gly       FAP
          784       Ser       Thr       FAP
          880       Ile       Thr       C Colorrectal, Sind Turcot
          890       Val       Ile       C Colorrectal, Sind Turcot
          906       Ser       Tyr       C Colorrectal
          911       Glu       Gly       FAP, C Colorrectal
          1027      Tyr       Cys       C Colorrectal
          1176      Pro       Leu       FAP
          1184      Ala       Pro       FAP
          1307      Ile       Lys       Población Ashkenazi
          1313      Thr       Ala       C Colorrectal
          1317      Glu       Glu       C Colorrectal
          1348      Arg       Trp       FAP
          1422      Asp       His       C Colorrectal
          1508      Ala       Val       C Colorrectal, Sind Turcot
          2621      Ser       Cys       FAP
          2738      Ile       Thr       FAP
          2839      Leu       Phe       FAP
 *WT: Wild type.

Módulo V                                                             6
PROBABLE MECANISMO DE ACCIÓN DE LA PROTEÍNA APC
                                                                   Filamentos de
                                            caderinas    cateninas     actina




                                                                       APC
                                            APC


                                                                       APC
                                           APC




   1º Las caderinas y las cateninas intervienen en las uniones inter-celulares.
 2º Las caderinas α β y γ se unen entre sí para formar uniones con los
    microfilamentos de actina y con las caderinas.
   3º La APC se une a la β catenina. Mutaciones que afecten a APC pueden
      alterar las uniones con el citoesqueleto (actina) y las cateninas de unión.
   4º El gen APC actúa como un gen tumoral supresor.
Módulo V                                                                            7
GENERALIDADES DEL GEN p53

      LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3, con 11 exones.

      GEN: Consta de 11 exones.

      PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos y posee
      3 dominios: uno en extremo inicial N, activador de la
      Transcripción; uno central para unirse al ADN, y uno
      en extremo C terminal de oligomerización .
      p53 es funcional cuando está en forma tetramérica.

      MUTACIONES: La mayor parte de las mutaciones están
      localizadas en los exones 4, 8 y “hotspots”, en los codones
      175, 245, 248 273 y 282.

Módulo V                                                            8
GENERALIDADES DEL GEN K-RAS


  LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1.

  PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos. Se une a la
  cara interna de la membrana citoplásmatica por el
  aa 186 y al GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119.

  MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61.
  En el Cáncer Colorrectal los codones 12 y 13 están
  mutados en el 40% de los casos.

Módulo V                                               13
GENERALIDADES DEL GEN DCC
                   (Deleted in Colorectal Carcinoma, DCC)


           LOCALIZACIÓN: Cromosoma 18q21.3.
           GEN: Contiene 27 exones.
           PROTEÍNA: La proteína DCC normal consta de 1447 aa.
           Es una proteína de membrana celular con dominios extra-
           celular (aa 1 al 1097), transmembrana (aa 1098 al 1122) y
           citoplasmático (aa 1123 al 1447). En condiciones normales
           el dominio extra-celular es un receptor para netrin-1, que
           es una proteína que orienta la dirección de los axones.
           ALTERACIONES: El DCC se comporta como un gen
           supresor tumoral. En el cáncer CR es característica la
           pérdida de heterozigosidad en el cromosoma 18q.
Módulo V                                                                19
CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE DCC
     La proteína DCC consta de 1447 aminoácidos, distribuidos de la
     siguiente forma:
                              En condiciones normales DCC
                              es un receptor de netrin-1.


                          Del aa 1 al 1097 son extra-celular.



                                    Del aa 1098 al 1122 son trans-membrana.


                          Del aa 1123 al 1447 son citoplasmáticos.



  La unión con netrin-1 bloquea la apoptosis y dirige la orientación de los axones.

Módulo V                                                                              20
CÁNCER COLORRECTAL Y DCC
      En el cáncer colorrectal se pierden los aminoácidos 25 al 1447.




En individuos polimórficos las pérdidas cromosómicas (LOH) del 18q
 en la zona donde está el gen que codifica para DCC se asocian a un
               mal pronóstico en el cáncer colorrectal.

Módulo V                                                                21
PÉRDIDA DE HETEROZIGOZIDAD Y DCC
 Marcadores moleculares                                  Las células tumorales
en el cromosoma 18q.                                     pierden una secuencia
                                                         en uno de los cromosomas.




                           Las secuencias cromosómicas
                           pueden ser amplificadas por
                            PCR y detectadas en geles
                                   de agarosa.



Como son polimórficas,                           En las células tumorales sólo se
las secuencias tienen                            amplifica la secuencia en uno de
distinto número de bases                         los cromosomas; en el otro se ha
amplificadas y emigran                LOH        perdido (deleccionado).
a distintos niveles.
Módulo V                                                                             22
GENERALIDADES DEL GEN hMLH1
                (human MutantL Homolog, hMLH1)

      LOCALIZACIÓN: Cromosoma 3p21.3.

      GEN: Consta de 19 Exones.
     PROTEÍNA: Está formada por 756 aminoácidos y se
     localiza en el núcleo celular, donde actúa como proteína
     reparadora de las lesiones del ADN.
     ALTERACIONES: Mutaciones en este gen se asocian a
     tumores hereditarios como: Cáncer de colon no polipósico
     hereditario (Síndrome de Lynch), Síndrome de Turcot,
     Síndrome de Muir-Torre, Tumores gastrointestinales y
     Tumores urogenitales.

Módulo V                                                        23
CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL GEN hMLH1
                     GEN: CONSTA DE 19 EXONES
            CON VARIACIONES EN LOS SIGUIENTES EXONES:




    Exón      Exón Exón Exón Exón                 Exón Exón       Exón       Exón Exón
      2         4    6    7    8                   12   13         16         17   19

           CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE 756 AMINOÁCIDOS.
             LAS VARIACIONES EN LOS EXONES AFECTAN A
                         LOS AA SIGUIENTES:
               67                 322    487     596
    AA1                                                                       AA756
     N                                                                          C

             62     107 117 226    406     497         616 618 659 714 716

Módulo V                                                                                 24
CARACTERÍSTICAS DE LAS
                       VARIACIONES DEL GEN–hMLH1
             EXON                CAMBIO
                                                   Nº AA.AAWT*- MUT
                               NUCLEÓTIDO
                2             184. C-T              62. Gln-Stop
                2             199. G-A              67. Gly-Arg
                4             320. T-G              107. Ile-Arg
                4             350. C-T              117. Thr-Met
                6             965. G-A              322. Gly-Asp
                7             1216. C-T             406. Arg-Stop
                8             676. C-T              226. Arg-Stop
                12            1786-ATT Delet        596. Delet Asp
                13            1459. C-T             487. Arg-Stop
                13            1490. C Insert        497. Frameshif
                16            1852. AA.GG           618. Lys-Ala
                16            1846. AAG Dele        616. Delet Lys
                16            3,5 kilobase delet    3,5. Delet kb
                17            1975. C-T             659. Arg-Stop
                19            2141. G-A             714. Trp-Stop
                19            2146. G-A             716. Val-Met
     *WT: Wild type.


Módulo V                                                              25
ALTERACIONES CROMOSÓMICAS Y
                CÁNCER COLORRECTAL
    • Existe una gran variabilidad de secuencias genéticas entre los individuos
      y muchas de estas variaciones se localizan en zonas no codificantes del ADN
      (zonas intrónicas). Estas regiones no codificantes se utilizan para crear
      finger-prints genéticos.
    • Estas regiones son unidades repetitivas de ADN, que se clasifican en
      función de su tamaño de repetición.

                     TIPOS DE ADN FINGER-PRINTS

                            • SATÉLITES

                            • MINISATÉLITES

                            • MICROSATÉLITES

Módulo V                                                                            26
CARACTERÍSTICAS DE LOS FINGER-PRINTS


                  TAMAÑO    TAMAÑO EN KB       CARACTERÍSTICAS
        TIPO
                   EN PB*     (Cromosoma)

                                                    Se localiza en
      Satélite     5-200       Megabases          heterocromatina y
                                                    centrómeros.

                                             Se localiza a lo largo de todo
 Minisatélites      9-70        1-20 kb          el genoma y de forma
                                              especial en los telómeros.

                                               Son monounidades de
                    1-4       menos de 1kb   Adeninas o dinucleótidos de
Microsatélites
                                               CA/CG a lo largo del
                                                      genoma.
*Pares de bases

 Módulo V                                                                     27
INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES DEL GEN hMLH1
  • El gen hMLH1 tiene la función de codificar para una proteína (hMLH1) que reconoce y
    repara las lesiones del ADN.
  • En el cáncer de colon no polipósico hereditario es característica la presencia de
    alteraciones en el ADN del gen hMLH1, que se conocen como Inestabilidad de
    Microsatélites (Microsatellite Instability, MSI).
    •Los microsatélites son secuencias altamente polimórficas entre la población sana.




                                       Alelo 1        Alelo 2
           CACACACACACACACACACA                               CACACACACACA
           Secuencia CA repetida 10 veces.               Secuencia CA repetida 6 veces.




           Previa amplificación por
           PCR. Las secuencias
           (CA)n en un gel migran
           a distintos niveles.
Módulo V                                                                                  28
INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES DEL GEN hMLH1

 Células normales que                                           Las células tumorales
 son heterozigotas para                                         pierden CA en uno de los
 el microsatélite (CA)n                                         alelos.
 en el cromosoma 18q.



                             Las secuencias de microsatélites
                              pueden ser amplificadas por
                               PCR y detectadas en geles
                                      de agarosa.



                                                       En las células tumorales que han
  Como son polimórficas,                               perdido secuencias CA, emigran
  las secuencias tienen
                                                       a distinto nivel.
  distinto número de bases
  amplificadas y emigran
  a distintos niveles.                  MSI
Módulo V                                                                                   29
CÁNCER DE MAMA

       ●    Genes y Proteínas relacionados
            con el cáncer de mama.

       ●    Mecanismos de acción de los Genes y Proteínas

            relacionados con el cáncer de mama.




Módulo IV                                                   1
GENES, PROTEÍNAS Y HORMONAS RELACIONADAS
              CON EL CÁNCER DE MAMA


            GEN            PROTEÍNA
            K-ras             p21
            p53               p21
            ERBB2             ERBB2
            BRCA1             BRCA1
            BRCA2             BRCA2

            GEN            HORMONA
                          ESTEROIDEA

            Estradiol         Estradiol


Módulo IV                                      2
GENERALIDADES DEL GEN K-RAS


    LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1


    PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos.
     ● Se une a la cara interna de la membrana citoplasmática
       por el aa 186 y al GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119.


    MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61.
     ● En el cáncer de mama las mutaciones de k-Ras son muy
       bajas (<10%).


Módulo IV                                                          3
GENERALIDADES DEL GEN p53

        LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3, con 11 exones.
     PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos.
      ● Posee 3 dominios: uno en extremo inicial N, activador de
        la transcripción; uno central para unirse al ADN y uno
        en extremo C terminal de oligomerización.
      ● p53 es funcional cuando está en forma tetramérica.

     MUTACIONES: 20-25% en cáncer de mama.
      ● El 90% de las mutaciones están localizadas entre los
        exones 5 al 9.
      ● Las mutaciones más frecuentes están en los codones
        175, 248 y 273.
      ● Las mutaciones relacionadas con peor pronóstico están
        en los codones 165-185 y 235-252.
Módulo IV                                                          9
GENERALIDADES DEL ERBB2 (HER2 /NEU)

            LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17q 21.1.

            PROTEÍNA: Consta de 1.225 aminoácidos.
             ● Presenta tres dominios: uno extracelular para unión a
               factores de crecimiento; uno transmembrana y uno
             citoplasmático con actividad tirosin-kinasa.

            VARIACIONES: El gen ERBB2 está amplificado y
            sobreexpresado en un 20-25% en el cáncer de mama.
              ● Los tumores con sobreexpresión de ERBB2 suelen
                asociarse a receptores de estrógenos negativos y son
                del tipo ductal invasivo.
              ● Niveles altos de ERBB2 se relacionan con mal pronóstico.
              ● ERBB2 está permanentemente activado cuando hay una
                delección de la zona extracelular de la proteína.

Módulo IV                                                              14
CÓMO ACTÚA ERBB2 NORMAL
      1º       EGF
                              2º




 3º
                                   4º
       P                  P
                                                                                          ER
                                        MEK                  ERK                            K




   1º ERBB2 presenta tres dominios: extracelular, transmembrana y citoplasmático.

   2º Diversos ligandos, como EGF o TGFα, se pueden unir a ERBB2.

      3º La unión del ligando con ERBB2 supone la fosforilación de la parte citoplasmática de la proteína y en
         consecuencia su activación.
      4º La activación de ERBB2 activa la vía de la MAPkinasa y, por lo tanto, la proliferación celular.

Módulo IV                                                                                                        15
CÓMO ACTÚA ERBB2 AMPLIFICADO
             EGF                   EGF               EGF




                              4º
       P              P   P               P    P               P


                                                                        ER
                                   MEK             ERK                    K




  En condiciones anormales, ERBB2 puede estar amplificado. Ello supone que con poco ligando
  habrá fosforilación y activación de MAP-Kinasa, con proliferación celular constante.

Módulo IV                                                                                     16
CÓMO ACTÚA ERBB2 DELECCIONADO




            P           P                                                        ER
                                      MEK               ERK                        K




     En condiciones anormales la parte extracelular de la proteína puede estar deleccionada.
     Este fenómemo supone que ERBB2 permanece fosforilado constantemente, activando
     MAPKinasa y la proliferación celular.

Módulo IV                                                                                      17
GENERALIDADES BRCA1 (BReast CAncer)
            LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17q 21.
            GEN: Consta de 22 exones.
             ● El exón 11 representa el 50% de toda la secuencia
               codificante (5592 nucleótidos).
            PROTEÍNA: Está formada por 1863 aa y con dominios
            de unión a ADN, ARN, p53, BRCA2 y zinc.
              ● Presenta funciones diversas: reparación de ADN,
                control ciclo celular y activación transcripción (gen
                supresor tumoral).
            VARIACIONES: Las mutaciones del gen BRCA1 están
            asociadas al cáncer de mama hereditario (15-20%).
              ● Las mutaciones pueden estar dispersas por todo el
                genoma. Las más significativas son las localizadas en
                las posiciones 185 (delección de AG), 5382 (inserción
                de C) y en aa 61 y 64.
Módulo IV                                                               18
BRCA1
                                         24 EXONES



 POSICIÓN 185. DELECCIÓN AG                        POSICIÓN 5382. INSERCIÓN C
                 1                      PROTEÍNA                       1863 aa

            N        RFM    p53   NSL                  BRCA2    ARN
                                                                 Pol
                                                                          C
                61     64                      Ph.S

   El gen de BRCA1 consta de 24 exones. Se han detectado unas 500 mutaciones que
    están muy dispersas en el genoma. En posiciones 185 y 5382 están localizadas las
  mutaciones de la población Judia Ashkenazy.
   El gen BRCA1 codifica para una proteína de 1863 aa, que en zona aminoterminal
    presenta dominios RING Finger Motif (RFM). Mutaciones en esta posición y en los
    aa 61 y 64, están relacionadas con el cáncer de mama familiar. Hay otros dominios
    de unión para p53 y proteínas nucleares (NSL).
   En zona carboxi terminal presenta uniones para BRCA2 y ARN pol II.
   Zona de unión para ATM, que fosforila las Serinas (Ph.S) de BRCA1 en respuesta
    al daño celular.
Módulo IV                                                                           19
Genética y cáncer
Genética y cáncer
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Genética y cáncer

  • 1. GENÉTICA Y CÁNCER Enrique Lastra Aras Sección de Oncología Médica Unidad de Consejo Genético Hospital General Yagüe
  • 2. CONTENIDOS • El material genético • El ciclo celular • Apoptosis • Genética y cáncer de pulmón • Genética y cáncer colorrectal • Genética y cáncer de mama • Consejo genético en cáncer hereditario
  • 3. RESUMEN ADN REPLICACION. El ADN forma copias idénticas. ARN TRANSCRIPCION. Formación del mARN. NUCLEO mARN Splicing CITOPLASMA Proteína TRASLACION. La lectura del mARN se realiza en el citoplasma. La proteína es liberada al citoplasma. El ribosoma lee en sentido 5’ 3’ Módulo I 27
  • 4. REPARACION DEL ADN Las modificaciones que puede sufrir el ADN por efecto de las mutaciones se conocen como Lesión del ADN (ADN Damage). Las células poseen mecanismos para reparar estas lesiones (ADN repair). Existen distintas causas de lesión que provocan diferentes respuestas en las células que reparan mediante distintos mecanismos de acción. En una situación normal, si la lesión del ADN no puede ser reparada la célula se autodestruye (Apoptosis). En caso que la lesión persista y la célula escape a la Apoptosis, el daño celular se transmite a través de la duplicación del ADN. CAUSAS RESPUESTAS MECANISMOS • Inversión de la lesión del ADN • Fotoreactivación del ADN. • Alteraciones (Reversal of DNA • O6MGT químicas espontáneas damage). en las moléculas del ADN. • Corte de la lesión ADN • Base Excision Repair (Excision of DNA • Nucleotide Excision Repair damage). • Mismach Repair • Alteraciones producidas por factores • Tolerancia a la lesión ambientales. (Tolerance of DNA • Recombinational repair damage) (HR, RJ) Módulo I 28
  • 5. ALTERACIONES QUIMICAS ESPONTANEAS EN LAS MOLECULAS DEL ADN DEAMINACION DE BASES DEPURINACION • Pérdida del grupo amino (NH2) • Pérdida de bases Púricas o en Adenina. Citosina, Guanina Pirimidínicas. y Metil-citosina. NH2 (Perdida) O A Pérdida Adenina A 9 Conversión 5’CH2OH o Hypo-Xantina 4’C C 1’ NH2 (Perdida) H H O H OH La zona sin 3’C C 2’ la base se Guanina G OH H conoce como Conversión Xantina APURINICA NH2(Pérdida) (AP). O Citosina C U Conversión 5’CH2OH o AP Uracilo 4’C C 1’ NH2(Pérdida) H H O H OH CH3 CH3 Metil 3’C C 2’ mC T Conversión Citosina OH H Timina Módulo I 29
  • 6. ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-II RADIACIONES UV • La radiación ultravioleta (UV) provoca en la cadena de ADN uniones de Timinas que se conocen con el nombre de anillos de cilobutano o dímeros de timina. T 5’CH2OH 1 o Los dímeros de Timina distorsionan la 4’C C 1’ H H doble hélice de ADN. H OH 3’C C 2’ O H T O P O 5’CH2 o 1 4’C C 1’ O H H H OH 3’C C 2’ OH H Módulo I 30
  • 7. ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-III AGENTES ALKILANTES • Los agentes alkilantes son componentes químicos que transfieren grupos metílicos o etílicos a las bases del ADN, por lo tanto modifican químicamente a las bases. CH3 O O La metilación del Carbono 6 6 6 de la Guanina, produce la metil-Guanina. mG G CH CH3 O 3 La Metil-Guanina se A T G C T G aparea con la Timina 6 en lugar de la Citosina. T A T G A C C mG Aparece una mutación puntual. Módulo I 31
  • 8. ALTERACIONES PRODUCIDAS POR FACTORES AMBIENTALES-III CROSS-LINKING Diversos elementos químicos, como mostazas nitogenadas, ácido nitroso, mitomicina y los derivados del platino, pueden unirse al ADN provocando abultamientos e inestabilidad de la doble hélice. EL Cis-Platino se une a las G del ADN de formas distintas Interstrand Intrastrand Monoadduct ADN-Protein cross-linking cross-linking cross-linking G G G G PT PT PT PT G G G G P R O T E I N La unión Intercadenas es la más citotóxica. Módulo I 32
  • 9. MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN O6MGT • La enzima O6 METIL-GUANINA-METILTRANSFERASA (O6MGT) es capaz de transferir los grupos metilos de la METIL-GUANINA al residuo de CISTEINA del Enzima. METIL-GUANINA •O6MGT CH3 O 6 mG HS CH2 CH3 O GUANINA METIL-CISTEINA 6 CH3 HS CH2 La mutación se repara sin corte del ADN. Módulo I 33
  • 10. MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN BASE EXCISION REPAIR (BER) Base Mutada •ADN A T G C T G A C G A T G C T G A C G T A C G C T G C T A C G C T G C GLICOLASA La mutación puede estar producida por una La enzima GLICOLASA reconoce y elimina deaminación o depurinación. la base mutada. Zona AP A T G C T G A C G A T G C T G A C G T A C G C T G C T A C G C T G C La enzima AP ENDONUCLEASA elimina AP Endonucleasa La zona sin la base se conoce como zona AP y es la ribosa y el fósforo, generando un gap. donde se une la enzima AP ENDONUCLEASA. ADN POLIMERASA A T G C T G A C G La ADN POLIMERASA y + la LIGASA, restablecen la LIGASA T A C G A C T G C cadena original. Módulo I 34
  • 11. MECANISMOS DE REPARACION DEL ADN NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR (NER) Lesión del ADN 3º Acción de ENDONUCLEASAS, ERCC1 corta en 5’ y XPG corta en 3’. XPA RPA XPC-R23 1º- Proteínas específicas detectan la lesión. E X R P XPA RPA C G TFIIH XPC-R23 C 1 Son eliminados de 25 a 30 nucleótidos cercanos a la lesión. 2º- Desenrollamiento del ADN, cerca de la lesión por el complejo proteíco TFIIH. XPA RPA XPC-R23 4º Polimerasas (Pol d) PCNA y LIGASAS sintetizan una nueva cadena. Pol d LIGS TFIIH PCNA Módulo I 35
  • 12. EL CICLO CELULAR ● La capacidad de una célula en transformarse en dos es una propiedad fundamental de los organismos vivos. Con el nombre de Ciclo Celular agrupamos el conjunto de eventos biológicos que permiten la división celular. ● La división celular consta de cuatro fases coordinadas: 1. Crecimiento Celular. 2. Duplicación del ADN. 3. Correcta distribución del ADN a las células hijas. 4. División en dos células hijas (Cytokinesis). ● La progresión en cada una de estas fases está controlada por un complejo conjunto proteico. Módulo II 1
  • 13. CICLO CELULAR: FASES 2n 4n I MITOSIS: IV G2. Intervalo 2n División celular. Cada antes de la célula hija tiene 2n Mitosis. Gran cromosomas. actividad M metabólica. Se G2 II G1. Intervalo antes de sintetizan las la fase de síntesis. Hay proteínas para crecimiento y actividad la Mitosis. celular, pero no duplicación del ADN. La célula es todavía 2n. 4n S III S. Fase 2n de Síntesis. G1 Se duplica el ADN celular. La célula es 4n. Módulo II 2
  • 14. CICLO CELULAR: TIEMPOS La duración del ciclo celular varía considerablemente según el tipo de tejido. En cultivo, el ciclo celular dura 24 horas. 4h M G2 1h G2 M S 11h 8h G1 11h S 8h G1 4h 1h M G1 S G2 Módulo II 3
  • 15. CICLO CELULAR: VARIACIONES La finalidad del ciclo celular es la división de la célula. Las células del organismo pueden dividirse en cuatro grupos en función de sus capacidades de proliferación. 1. Células con alta capacidad proliferativa. 2. Células con nula capacidad proliferativa. 3. Células con capacidad proliferativa ocasional. 4. Células con capacidad proliferativa constante. El ciclo celular presenta características propias en cada uno de estos grupos. Módulo II 4
  • 16. CICLO CELULAR: VARIACIONES 1. Células con alta capacidad proliferativa. Es característica de células que se dividen a gran velocidad, como sucede en las primeras fases de la embriogénesis y ciertos tipos tumorales. El ciclo celular puede durar 30 minutos. No hay fases G1 y G2, la Mitosis (M) alterna con la fase de síntesis (S). M 2n 4n M 2n 2n S 4n 4n M 2n 2n S 4n S 2n Módulo II 5
  • 17. CICLO CELULAR: VARIACIONES 2. Células con nula capacidad proliferativa Son grupos celulares altamente diferenciados y que han perdido su capacidad de división. Por ejemplo, células nerviosas y músculo cardíaco. G2 S M G1 División celular Alta diferenciación sólo durante la celular. Se pierde la embriogénesis. capacidad de división. Módulo II 6
  • 18. CICLO CELULAR: VARIACIONES 3. Células con capacidad proliferativa ocasional Algunos tejidos se caracterizan porque sus células abandonan la fase G1 y entran en fase G0, que se caracteriza por tener baja actividad metabólica y nula proliferación (quiescencia). Sin embargo, cuando las condiciones lo requieren, entran de nuevo en G1 y continúan la división celular. 2n M 4n G2 2n Cuando hay lesión o muerte celular, factores externos favorecen la entrada en G1. Fibroblastos y células S G0 epiteliales de: Hígado, Pulmón, Páncreas, G1 Riñón, Próstata y Mama. Entran en fase quiescente G0. Módulo II 7
  • 19. CICLO CELULAR: VARIACIONES 4. Células con capacidad proliferativa constante. En los tejidos con alta tasa de proliferación y muerte celular, como tejido epitelial, tracto digestivo y sangre, existen células con gran capacidad de división, son las células madre, que reemplazan a las células diferenciadas que desaparecen. Diferenciación Célula madre celular 2n 4n M G2 2n Célula madre S G1 Algunos tumores se caracterizan por presentar sólo células madre; no hay diferenciación celular. Módulo II 8
  • 20. CONTROL DEL CICLO CELULAR Diversos factores de crecimiento, permiten que las células en G0, entren en el ciclo celular al final de la fase G1. Es el Restriction Point (RP). Existen, además, tres puntos de chequeo “Checkpoints” (ChP). Al final de G1, al final de G2 y al final de M. Los ChP aseguran que el ADN está en perfectas condiciones para seguir a través del ciclo celular. Al final de la Mitosis hay un checkpoint que asegura una distribución equitativa de cromosomas a cada célula hija. Si el ADN no se ha Factores de crecimiento, PDGF, replicado totalmente ChP EGF e IGF-I, inducen las células M en G0, entran en el ciclo celular, en la Fase S, G2 superan el Restriction Point (RP) y el ciclo se para ChP en G2, impidiendo siguen por la Fase S. el inicio de la Mitosis hasta que la El RP es, además, un punto de Replicación es completa. S RP chequeo frente a lesiones externas del ADN. La p53 actúa Lesiones en el ADN frenan el ciclo en G2, G1 a este nivel, frena el ciclo e impide que el ADN lesionado entre en hasta su reparación. Fase S. Módulo II 9
  • 21. MOLÉCULAS QUE REGULAN EL CICLO CELULAR. NIVEL G2/M Actúa la proteína cdc2 (cell division cycle mutant) conocida también como Cdk1(Cyclin-dependent kinase). En la fase G2/M, la Cdk1 se une a una ciclina B (CyB) que se sintetiza durante la fase S. El dímero Cdk1-CyB, permite la Mitosis . Al complejo Cdk1-CyB también se le conoce como MPF (Maturation Promoting Factor). Desfosforilación CyB CyB aa14 y aa15 CyB Complejo activador 14 14 P 14 P 14 Cdk1 Cdk1 de la MITOSIS Cdk1 161 15 15 15 15 161 161 P P Al final de la Mitosis se P P P degrada la CyB Se fosforilan los aa 167(THR),15(TYR) y 14 (THR) de Cdk1 CyB G2 M CyB Cdk1 161 Cdk1 P Al inicio de G2, Cdk1 se une a la CyB S Síntesis de CiclinaB durante CyB la fase S. Alcanza un máximo al inicio de G2 G1 Módulo II 10
  • 22. MOLÉCULAS QUE REGULAN EL CICLO CELULAR Distintas ciclinas y Cdk actúan a lo largo de las fases G1 y S. DURANTE G1 CyD CyD M Cdk2 Cdk4 G2 CyD Cdk6 PROGRESIÓN A TRAVÉS DE S FASE S. AL FINAL DE G1 G1 CyE CyA Cdk2 Cdk2 Permiten la transición de G1 a S. Módulo II 11
  • 23. DIVISIÓN CELULAR: LA MITOSIS En los mamíferos, durante la mitosis se producen los eventos siguientes: • El ADN se condensa, se duplica y los cromosomas se hacen visibles al microscopio. • Se rompe la membrana nuclear. • El citoesqueleto celular se reorganiza y forma el huso mitótico. • Los cromosomas se desplazan y se unen a los filamentos del huso mitótico. • Los cromosomas duplicados se separan y se reparten equitativamente a cada polo celular. • Aparición de una nueva membrana nuclear que envuelve a los cromosomas. Módulo II 12
  • 24. DIVISIÓN CELULAR: FASES DE LA MITOSIS Todos los eventos anteriormente citados se han dividido en cuatro períodos de tiempo que se conocen como: ● PROFASE ● METAFASE ● ANAFASE ● TELOFASE Módulo II 13
  • 25. PROFASE-I CyB Acción del complejo activador de la Cdk1 MITOSIS. 161 P Condensación del ADN. Aparición de los cromosomas. Cada cromosoma está duplicado: 2 cromátidas. El centrosoma se duplica y se deplaza hacia los polos. Los microtúbulos se constituyen a partir de los centrosomas para formar el huso mitótico. Se degrada la membrana nuclear. Módulo II 14
  • 26. PROFASE-II Los microtúbulos conectan con zonas muy específicas de los cromosomas, denominadas Centrosomas. Los centrosomas son la zona de unión de las dos cromátidas. En los centrosomas se unen proteínas específicas para formar el Kinetocoro. Los microtúbulos Los microtúbulos están se unen al Kinetocoro. formados por unidades de α y β tubulina. Módulo II 15
  • 27. METAFASE Durante la metafase los microtúbulos se sitúan en el ecuador de la célula formando el huso mitótico. Módulo II 16
  • 28. ANAFASE En la anafase hay una contracción (despolimerización) de los microtúbulos, que separan las dos cromátidas. Módulo II 17
  • 29. TELOFASE Contracción de la membrana Formación de membranas citoplasmática. nucleares. Descompactación de las cromátidas y distribución equitativa de cromosomas en cada núcleo. Módulo II 18
  • 30. TELOFASE Al final de la Mitosis se degrada la CyB CyB Cdk1 161 P Aparece un anillo de contracción formado por ACTINA y MIOSINA II, que permite la separación de las dos células hijas: es la CITOKINESIS. Módulo II 19
  • 31. MUTACIONES: DEFINICIONES TÉRMINO DEFINICIÓN MUTACIÓN: Cambio hereditable en la secuencia genética de un organismo. MUTANTE: Organismo portador de una o más mutaciones en su genoma. GENOTIPO: Información genética codificada en el genoma de un organismo. FENOTIPO: Manifestación externa del genotipo. MUTÁGENO: Agente que incrementa la frecuencia de mutaciones. MUTAGÉNESIS: Procesos que conducen a las mutaciones. Módulo II 20
  • 32. MUTACIÓN PUNTUAL: SUSTITUCIÓN DE UNA BASE ADN NO MUTADO 5’ PROMOTOR 3’ C G G C G G C C G A T G C T G A C G A C T ACCATC G C C G C C G G C T A C G A C TGGTAG T A T G C T G A 5’ 3’ EXÓN 1 Intrón1 EXÓN 2 ADN MUTADO 5’ PROMOTOR 3’ C G G C G G C C G A T G A T G A C G A C T ACCATC G C C G C C G G C T A C T A C TGGTAG T A T G C T G A 5’ 3’ EXÓN 1 Intrón1 EXÓN 2 Mutación localizada en exón 1, cambio de C por A en el segundo codón. Módulo II 21
  • 33. MUTACION PUNTUAL: SUSTITUCIÓN DE UNA BASE ADN MUTADO A por G La mutación en el ADN se transmite 3’ en el mARN, A T G A T G A C G A C T ZONA PROMOTORA ACTIVADA ACCATC 5’ U A C C UGGUAG U G C U A U G A C G G C G G C C G mARN G C C G C C G G C 3’ T A C G A C TGGTAG T G C T G A 5’ CODÓN WT Codifica para G A C ASP 5’ A U G 3’ U A C U G C U G A CODÓN MUTADO m7G Codifica para U A C TYR Codifica Codifica Codifica No codifica para para para para ningún aminoácido. CAMBIO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO SUPONE CAMBIO DE AA MET TYR CYS STOP Módulo II 22
  • 34. MUTACIÓN PUNTUAL: TIPOS TÉRMINO DEFINICIÓN TRANSICIÓN Cambio (>) de una base Púrica por otra Púrica o Pirimidínica por otra Pirimidínica. G>A, A>G, C>T, T>C TRANSVERSIÓN Cambio de una base Púrica por otra Pirimidínica o una Pirimidínica por una Púrica. G>T, G>C, A>T, A>C, T>A, T>G, C>A, C>G Módulo II 23
  • 35. MUTACIÓN PUNTUAL: INCORPORACIÓN DE UNA BASE (FRAMESHIFT +) 5’ PROMOTOR 3’ ADN NO MUTADO C G G C G G C C G A T G C T G A C G A C T ACCATC G C C G C C G G C T A C G A C TGGTAG T A T G C T G A 5’ 3’ EXÓN 1 Intrón1 EXÓN 2 5’ PROMOTOR ADN MUTADO 3’ C G G C G G C C G A T G CT T G A C G A C T ACCATC G C C G C C G G C T A C G A C TGGTAG T A T G C T G A 5’ 3’ EXÓN 1 Intrón1 EXÓN 2 INCORPORACIÓN DE UNA TIMINA (T) EN EL SEGUNDO CODÓN DEL EXÓN 1. Módulo II 24
  • 36. MUTACIÓN PUNTUAL: INCORPORACIÓN DE UNA BASE (FRAMESHIFT +) ADN TEMPLATE CON T INCORPORADA Incorporación de A en el mARN 3’ A T G CT T G A C G A C T ZONA PROMOTORA ACTIVADA ACCATC 5’ U A C G A A C UGGUAG U G C U G A C G G C G G C C G mARN G C C G C C G G C 3’ T A C G A C TGGTAG T G C T G A 5’ mARN WT. Lectura codones en base 3 mARN mutado. Lectura codones en base 3 A U G G A C U G C U G A A U G G A A C U G C U G A Codifica Codifica No codifica para Codifica ningún aminoácido Codifica Codifica Codifica Codifica para para para para para para para MET ASP CYS STOP Proteína distinta MET GLU LEU LEU La incorporación de A altera la pauta de lectura. Secuencia proteína WT Secuencia proteína mutada Módulo II 25
  • 37. CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES SECUENCIA WT AU G G AC U G C U G A PROTEÍNA WT MET ASP CYS STOP TIPO CAUSAS EJEMPLOS CODÓN WT CODÓN MUTADO PROTEÍNA MUTADA MISSENSE • Mutación G AC ASP U AC TYR MET TYR CYS STOP Puntual • Adición G AC ASP A AC GLU MET GLU LEU LEU de bases La incorporación de A altera la pauta de lectura Frameshift + • Delección G AC ASP AC U THR MET THR ALA de bases Frameshift - La pérdida de una base (G) altera la pauta de lectura EFECTOS FENOTÍPICOS Pérdida total de la función de la proteína o Pérdida parcial de la función proteica o Ganancia de función o Alteración de la función. Módulo II 26
  • 38. CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES SECUENCIA WT AU G G AC U G C U G A PROTEÍNA WT MET ASP CYS STOP TIPO CAUSAS EJEMPLOS CODÓN WT CODÓN MUTADO SILENTE Cuando la mutación • Mutación G AC ASP GA U ASP está en la tercera base Puntual no cambia el AA. MET ASP CYS STOP No hay cambio proteico. EFECTOS FENOTÍPICOS No hay cambio de AA. La proteína queda igual. No hay ningún efecto detectable. Módulo II 27
  • 39. CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES SECUENCIA WT AU G G AC U G C U G A PROTEÍNA WT MET ASP CYS STOP TIPO CAUSAS EJEMPLOS NONSENSE Se produce siempre que una mutación puntual o un • Mutación frameshift + ó -, introduce uno de los tres codones de paro. Puntual UAG , UAA , UGA CODÓN WT CODÓN MUTADO • Adición G AC ASP U G AC STOP de bases U G AC Frameshift + Adición de U Cambio pauta lectura • Delección de bases PROTEÍNA MUTADA Frameshift - MET STOP EFECTOS FENOTÍPICOS Se produce una proteína truncada que puede dar lugar a: Pérdida total de la función o Pérdida parcial de la función o Ganancia de función o Alteración de la función. Módulo II 28
  • 40. LOCALIZACIÓN Y EFECTOS DE LAS MUTACIONES 5’ PROMOTOR 3’ C G G C G G C C G A T G C T G A C G A C T ACCATC G C C G C C G G C T A C G A C TGGTAG T A T G C T G A 5’ 3’ EXÓN 1 Intrón1 EXÓN 2 EN ZONA EN ZONA EN ZONA PROMOTORA EXÓNICA INTRÓNICA EFECTOS EFECTOS EFECTOS • Aumento •Mut. Missense •Sin efectos o •Excepto si se Reducción de •Mut. Nonsense producen en la expresión áreas de génica. •Mut. Silentes Splicing. Módulo II 29
  • 41. APOPTOSIS ● La apoptosis es un mecanismo de autodestrucción celular. ● Las células poseen en sus membranas celulares unas proteínas que actúan como sensores y que se conocen como “Death Receptors”. ● Los “Death Receptors” se activan por la presencia de señales externas (Ligandos, “Death Ligands”). ● La unión Death Receptors - Death Ligands activa reacciones bioquímicas en el citoplasma celular que conducen a la muerte celular, apoptosis. ● La característica más típica de apoptosis es la fragmentación del ADN. Módulo III 1
  • 42. APOPTOSIS CARACTERÍSTICAS DE LOS “DEATH RECEPTORS” (SENSORES) 3º-Los ligandos 1º-Porción extracelular Espacio - “Death Ligands” presenta aminoácidos Extracelular se unen al CRDs. ricos en cisteínas (Cysteine-Rich-Domain) (CRDs). Membrana Citoplasmática 4º-Proteínas 2º- Porción citoplasmática adaptadoras se conoce como Espacio - se unen a los “Death Domain” Citoplasmático “Death (DD). Domain”. Módulo III 2
  • 43. APOPTOSIS PRINCIPALES “DEATH RECEPTORS” Y “DEATH LIGANDS” ● Cada “DEATH RECEPTOR” tiene su “DEATH LIGAND”. ● Los “DEATH RECEPTORS” y los “DEATH LIGANDS” tienen diferentes nombres: DEATH DEATH RECEPTORS SINÓNIMO LIGANDS SINÓNIMO Fas CD95 FasL CD95L Apo-1 TNFR1 P55 TNF CD120a DR3 Apo3 Apo3L TWEAK WSL-1 TRAMP LARD DR4/DR5 Apo2 Apo2L TRAIL TRAIL-R2 TRICK2 KILLER Módulo III 3
  • 44. APOPTOSIS A TRAVÉS DE FAS DEATH DEATH LIGAND RECEPTOR FasL/CD95L FAS/CD95 DD En una zona de la proteína FADD denominda “ Death Effector Domain” se une FADD una proteasa (procaspasa 8) El acoplamiento del que es transformada en Ligando con el CASPASA 8. Procaspasa 8 Receptor, induce la unión de proteínas denominadas Caspasa 8 que Fas-Associated activa Caspasa 3. Death Domain (FADD) o Mort Caspasa 3 Caspasa 3 en la zona Produce Death Domain (DD) APOPTOSIS de la proteína receptora. por fragmentación Módulo III del ADN. 4
  • 45. CONTROL MITOCONDRIAL DE LA APOPTOSIS ● La liberación de Citocromo C mitocondrial es el principal factor activador de la apoptosis. ● Existen proteínas que inhiben la liberación de Citocromo C, son las anti-apoptóticas. ● Existen proteínas que activan la liberación de Citocromo C, son las pro-apoptóticas. ANTI-APOPTOSIS PRO-APOPTOSIS Bcl-2 Bad Bid BcL-XL Bax Bim Módulo III 5
  • 46. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA Bcl-2 LOCALIZACIÓN: Cromosoma 18q21. PROTEÍNA: Consta de 239 aminoácidos. • Presenta zonas hidrofóbicas que permiten su anclaje a las membranas celulares. • Estas zonas son necesarias para su actividad anti-apoptosis. • Principalmente se localiza en la cara externa de la membrana mitocondrial. FUNCIÓN: Inhibe la liberación del Citocromo C, que es un activador de las caspasas que activan la apoptosis. • Bcl-2 es inhibido por las proteínas Bax y Bim. • En los tumores, el gen está hipometilado en la zona promotora y, por lo tanto, la proteína está sobreexpresada. Módulo III 6
  • 47. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA Bcl-XL LOCALIZACIÓN: Cromosoma 20q11.1. PROTEÍNA: Consta de 233 aminoácidos. • Se han descrito mutaciones que afectan a la función proteica. • Las localizadas en los aa 131, 133, 138 y 148, afectan a la unión con Bax. • Se localiza en la cara externa de la membrana mitocondrial. FUNCIÓN: Inhibe la liberación del Citocromo C, que es un activador de las caspasas que activan la apoptosis. • Bcl-XL es inhibido por la proteína Bad. Módulo III 7
  • 48. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BAD LOCALIZACIÓN: Cromosoma 11q13.1. PROTEÍNA: Consta de 168 aminoácidos. • Se localiza en la cara externa de la membrana mitocondrial. • Cuando está fosforilada (en los aa Ser-75, Ser-99 y Ser-118) se localiza en el citoplasma. FUNCIÓN: Promueve la apoptosis. • Inhibe la acción de las proteínas anti-apoptosis, Bcl-2 y Bcl-XL. Módulo III 8
  • 49. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BID LOCALIZACIÓN: Cromosoma 22q11.1. PROTEÍNA: Consta de 195 aminoácidos. • Su localización es predominantemente citoplasmática. FUNCIÓN: Promueve la apoptosis. • La caspasa 8 rompe la proteína formando una subunidad (tBid) que se une a la membrana mitocondrial, favoreciendo la liberación del citocromo. Módulo III 9
  • 50. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BAX LOCALIZACIÓN: Cromosoma 19q13.3-q13.4. PROTEÍNA: Consta de 192 aminoácidos. • Variaciones en el aa 11 se asocia al plasmocitoma, variaciones en el aa 67 a la leucemia linfoblástica aguda y variaciones en el aa 108, con el linfoma de Burkitt. • Se localiza en la cara externa de la membrana mitocondrial. FUNCIÓN: Promueve la apoptosis por liberación del Citocromo C mitocondrial. Módulo III 10
  • 51. GENERALIDADES DE LA PROTEÍNA BIM LOCALIZACIÓN: Cromosoma 2q12.3. PROTEÍNA: Consta de 198 aminoácidos. • Existen dos isoformas (BimL y BimEL), la Isoforma BimL presenta variaciones en los aa 42 a 101 y es más potente que la Isoforma BimEL. • Se localiza en las membranas intra citoplasmáticas. FUNCIÓN: Promueve la apoptosis, inhibe la acción de Bcl-2. Módulo III 11
  • 52. APOPTOSIS A TRAVÉS DE BID DEATH DEATH LIGAND RECEPTOR FasL/CD95L FAS/CD95 DD En una zona de la proteína FADD denominada “ Death FADD Effector Domain” se une Caspasa 8 una proteasa (procaspasa 8) que es transformada en Procaspasa 8 CASPASA 8. Caspasa -9 C C BID tBid tBid Caspasa -3 tBid activa y libera Caspasa 8 el Citocromo C Fracciona la proteína mitocondrial que bid. activa caspasa 9 y 3. APOPTOSIS Módulo III 12
  • 53. BCL-2 Y BCL-XL Bcl-2 y Bcl-XL inihen la síntesis de Citocromo C y, en consecuencia, inhiben la apoptosis. Bcl-XL Bcl-2 Caspasa -9 C C Caspasa -3 Diversos factores activan el Citocromo C mitocondrial, que liberado al citoplasma se une a APOPTOSIS las caspasas activando la apoptosis. Módulo III 13
  • 54. APOPTOSIS A TRAVÉS DE BAX Y BIM Diversos estímulos externos pueden activar Bax y Bim. Bax Bim Bax Bim Bax y Bim se unen a la membrana mitocondrial e inhiben la acción de Bcl-2 Bcl-2 Bcl-2. Módulo III 14
  • 55. CÁNCER DE PULMÓN • Generalidades. • Genes y proteínas relacionados con el cáncer de pulmón. • Mecanismos de acción de los genes y proteínas relacionados con el cáncer de pulmón. 1
  • 56. GENERALIDADES DEL CÁNCER DE PULMÓN Histológica y clínicamente el cáncer de pulmón se divide en SCLC (cáncer de célula pequeña) y NSCLC (cáncer de célula no pequeña). • SCLC. Características neuroendocrinas. • NSCLC. Incluye: Adenocarcinoma. Carcinoma escamoso. Carcinoma células grandes. 2
  • 57. PRINCIPALES ALTERACIONES MOLECULARES RELACIONADAS CON EL CÁNCER DE PULMÓN GENES SUPRESORES GENES RELACIONADOS TUMORALES (TSG) CON ACTIVACIÓN DE SEÑALES p53 p16INK4a-CiclinaD1-CDK4-RB RAS KIT FHIT EGFR GRP RASSF1A HER2/neu MYC ALTERACIONES DE LA INESTABILIDAD METILACIÓN GENÓMICA (MSI) p16INK4a CROMOSOMAS DAPK 3p, 5q, 9p, 11q, 13q, 17p, GSTP1 18q y 22q MGMT 3
  • 58. GENERALIDADES DEL GEN p53 LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3. GEN: Consta de 11 exones. PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos. • Posee 3 dominios: uno, en extremo inicial N, activador de la transcripción; uno, central para unirse al ADN, y uno, en extremo C terminal de oligomerización. • p53 es funcional cuando está en forma tetramérica. MUTACIONES: En el cáncer de pulmón, la mayor parte de las mutaciones están localizadas en los exones 5 y 8. EFECTOS DEL TABACO: Produce transversiones G-T y mutaciones en codones 157, 248 y 273. 4
  • 59. GENERALIDADES DEL GEN p53 FRECUENCIA MUTACIONES p53 SCLC 75-100% NSCLC 47% Adenocarcinomas - 39% Carcinomas escamosos - 51% Carcinomas células grandes - 54% Tammemagi MC et al. 1999. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8:625-634 5
  • 60. GENERALIDADES DEL GEN p53 CARACTERÍSTICAS DE LAS MUTACIONES DE p53 • 70-80% son mutaciones missense que prolongan la vida media de la proteína y pueden ser detectadas por inmunohistoquímica. • 20-30% son mutaciones nonsense, delecciones, inserciones o errores de splicing y no son detectables por inmunohistoquímica. • Mutaciones de p53 en adenocarcinomas se asocian a un mal pronóstico. Mitsudomi et al 2000. Clin Cancer Res 6:4055-4063. 6
  • 61. LA PROTEÍNA p53 FORMA LINEAL Extremo amino-terminal Parte Central Extremo Carboxiterminal N C Responsable de activar Zona de unión al ADN. Responsable de la la transcripción. oligomerización de la proteína. FORMA GLOBULAR La forma activa de p53 es globular y tetramérica 7
  • 62. CÓMO ACTÚA p53 1º 2º p53 M p21 3º G2 G1 CyE CyD 5º XPA RPA Cdk2 Cdk4 E XPC-R23 X p21 R C P G 4º C TFIIH 1 S 1º Una lesión en el ADN estimula la síntesis de p53, su tetramerización y su vida media en el citoplasma celular. 2º p53 se une al ADN para estimular la síntesis de p21. 3º p21 se une a los complejos CyE/Cdk2 y CyD/Cdk4, parando el ciclo celular en G1. 4º Durante la parada del ciclo celular actúan los enzimas que repararán la lesión del ADN. 5º Una vez reparada la lesión, continúan las fases de síntesis, G2 y mitosis. 8
  • 63. LA PROTEÍNA p53 MUTADA FORMA LINEAL Extremo amino-terminal Parte Central Extremo Carboxiterminal N 1º C 157 245 /248 273 282 Responsable de la Responsable de activar Zona de unión al ADN oligomerización de la proteína la transcripción 2º FORMA GLOBULAR p53 MUTADA 1º Las mutaciones más frecuentes aparecen en la zona de la proteína que se une al ADN. 2º Las mutaciones cambian la estructura de la proteína. 9
  • 64. CÓMO ACTÚA p53 MUTADA 1º 2º M p21 3º G2 6º G1 CyE CyD Cdk2 Cdk4 4º 5º S 1º Una lesión en el ADN estimula la síntesis de p53. 3º La ausencia de p21 impide la parada del ciclo celular. Si p53 está mutada hay dificultades en la 4º No hay reparación de la lesión del ADN. tetramerización y la vida media de la proteína en el citoplasma celular es muy corta. 5º Los errores se acumulan y propagan en las fases de síntesis, G2 y Mitosis. 2º p53 mutada no puede unirse al ADN y, por lo tanto, no hay síntesis de p21. 6º Las mutaciones pueden conducir a la carcinogénesis. 10
  • 65. p53 COMO TERAPIA GÉNICA En tumores accesibles La finalidad es que p53 por punción active la apoptosis tumoral Se inyecta p53 normal Con reducción total o parcial del tumor RESULTADOS CLÍNICOS VARIABLES • En 19 pacientes: RC 1(5%), RP 11(58%), EE 3(16%), PE 2 (11%), NE 2(11%) (Swisher et al 1999. J Natl Cancer Inst 91:763-771) • En 25 pacientes: No diferencias entre quimioterapia sola versus quimioterapia + p53 (48% respuestas objetivas versus 58%, respectivamente) (Schuler et al 2001. J Clin Oncol 19:1750-1758) 11
  • 66. GENERALIDADES DEL COMPLEJO p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB El complejo p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB regula la transición de G1 a S en el ciclo celular. p16INK4a El gen MTS1 da lugar a un mARN llamado INK4a, que codifica para una proteína denominada p16INK4a . GEN MTS1 mARN INK4a Proteína p16 INK4a Proteína p16INK4a inhibe el complejo ciclina D1-CDK4 12
  • 67. GENERALIDADES DEL COMPLEJO p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB El gen Rb El gen Rb (Retinoblastoma) consta de 27 exones y codifica para una proteína de 928 aminoácidos. La proteína Rb se expresa en todas las células del organismo, y cuando está hipofosforilada se une a las proteínas E2F. El complejo Rb-E2F bloquea el ciclo celular en las fases de G1 a S. Rb G2 M E2F S Rb G1 E2F 13
  • 68. GENERALIDADES DEL COMPLEJO p16INK4a –CiclinaD1-CDK4-RB El complejo proteico Ciclina D1-CDK4 hiperfosforila a la proteína Rb. G2 M P S P Rb P CyD G1 Cdk4 E2F Cuando Rb está hiperfosforilada, Rb se libera de E2F, se desbloquea el ciclo celular y E2F activa la transcripción de genes. G2 M P S P Rb P G1 E2F 14
  • 69. GENERALIDADES DEL COMPLEJO p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB La proteína p16 inhibe la acción del complejo Ciclina D1-CDK4, por lo que no hay hiperfosforilización de Rb. G2 M P p16 INK4a S P Rb P CyD G1 Cdk4 E2F Si p16 está inactivado (por mutación, delección o hipermetilación) no hay inhibición del complejo Ciclina D1-CDK4 y sí fosforilación continua de Rb, con la consecuente progresión del ciclo Celular y transcripción de genes. G2 M P S Rb P CyD P G1 Cdk4 E2F 15
  • 70. EL COMPLEJO p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB y CÁNCER DE PULMÓN • En NSCLC la hipermetilación en la zona promotora de p16 se ha observado en un 30-70%. • La inactivación de RB es más frecuente en SCLC (90%) que en NSCLC (15-30%). • La inactivación simultánea de p16 y Rb no es frecuente en el cáncer de pulmón. 16
  • 71. GENERALIDADES DEL GEN K-RAS EN CÁNCER DE PULMÓN LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1. PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos. Se une a la cara interna de la membrana citoplásmatica por el aa 186 y al GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119. MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61. En el cáncer de pulmón la frecuencia de mutaciones es del 15-20%. • Los adenocarcinomas representan 20-30%. • El 70% de las mutaciones son transversiones G-T. • Las más frecuentes en el codon 12, el wt (wild type) es GGT (Glicina) y las mutaciones pueden ser TGT (Cisteína) o GTT (Valina). 17
  • 72. CÓMO ACTÚA Ras NORMAL 1º Ras debe anclarse en la cara 2º Si no hay estímulo externo, interna de la membrana celular Ras está inactivo Farnesilo Ras P P Ras GDP La proteína Ras (p21) consta de 121 aa. Los tres últimos aa de Ras son eliminados Como miembro de la superfamilia de por la enzima Farnesil Transferasa (FT). proteínas G, Ras se une con gran afinidad a GDP o GTP. La FT incorpora un grupo Farnesilo, que permite el anclaje de Ras a la cara Cuando Ras está unido a GDP, está interna de la membrana celular. en forma inactiva. 18
  • 73. CÓMO SE ACTIVA Ras NORMAL 1º GF 3º P P 2º P P 4º SOS P P P P P Grb2 P P P Ras GTP Ras GTP 1º Un factor de crecimiento (GF) se une a un receptor de membrana y activa su fosforilación. 2º La proteína Grb2 actúa como puente entre el GF fosforilado y la proteína SOS que fosforila Ras. 3º La proteína SOS es una Guanine nucleotide Exchange Factor (GEF), se une a Grb2 y este complejo permite la fosforilación del GDP del Ras, en GTP. 4º El complejo Ras-GTP es la forma activa de Ras. 19
  • 74. GENERALIDADES DEL COMPLEJO p16INK4a –Ciclina D1-CDK4-RB La proteína p16 inhibe la acción del complejo Ciclina D1-CDK4, por lo que no hay hiperfosforilización de Rb. G2 M P p16 INK4a S P Rb P CyD G1 Cdk4 E2F Si p16 está inactivado (por mutación, delección o hipermetilación) no hay inhibición del complejo Ciclina D1-CDK4 y sí fosforilación continua de Rb, con la consecuente progresión del ciclo Celular y transcripción de genes. G2 M P S Rb P CyD P G1 Cdk4 E2F 15
  • 75. CÓMO ACTÚA Ras NORMAL ACTIVADO 1º 2º 3º 4º P P P ER Ras GTP MEK ERK K Raf 5º 1º Ras activado se une a la proteína Raf-kinasa. 2º El complejo Ras-GTP-Raf, activa la proteína MEK (MAP-kinasa/ERK Kinasa). 3º La proteína MEK activa a proteínas de la familia ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase). 4º Las proteínas ERK se unen al ADN y actúan como factores de transcripción. 5º Los factores de transcripción activan la DIVISIÓN CELULAR. 20
  • 76. CÓMO SE REGULA Ras NORMAL ACTIVADO GAP P P P P P Ras GTP Ras GDP MEK ERK ER Raf K Raf 1º 2º AUSENCIA DE PROLIFERACIÓN CELULAR 1º La actividad de Ras es abolida por la enzima GAP (GTPase Activating Proteins) que produce la hidrólisis de GTP a GDP. 2º El complejo Ras-GDP, es inactivo, no permite la unión a Raf y, en consecuencia, no hay activación de MEK, ERK ni actividad mitótica. 21
  • 77. CÓMO ACTÚA Ras MUTADO 1º 2º GAP 3º P P P ER Ras GTP P PP MEK ERK K Ras Raf GTP Raf 4º 1º Las mutaciones de Ras en el codón 12 son suficientes para cambiar la estructura de la proteína. 2º Ras mutado impide la actuación de GAP. 3º Al no actuar GAP, Ras está permanentemente en forma activa. 4º Hay proliferación celular constante. 22
  • 78. OTROS GENES IMPLICADOS EN EL CÁNCER DE PULMÓN • EGFR • Sobre-expresado en NSCLC (principalmente en carcinoma escamoso) Es raro en SCLC. El fármaco IRESSA® (gefitinib) inhibe el EGFR. Sirotnak et al 2000. Clin Cancer Res 60: 1871-1877. • HER2/neu • Se expresa en un 30% en NSCLC (adenocarcinoma) y se asocia a una pobre supervivencia. El fármaco monoclonal HERCEPTIN® (trastuzumab) bloquea la actividad de HER2/neu. Agus DB et al 2000. Semin Oncol 27: 53-63. RECEPTOR -KIT • Actúa como factor autocrino en el desarrollo del SCLC. El fármaco GLIVEC® (imatinib) ha comenzado a ensayarse en el SCLC. • GASTRIN-RELEASING-PEPTIDE (GRP) • El gen GRP se expresa en un 20-60% en SCLC y es poco frecuente en NSCLC . 23
  • 79. OTROS GENES IMPLICADOS EN EL CÁNCER DE PULMÓN • FAMILIA MYC La familia MYC consta de 3 miembros: MYC, MYCN y MYCL. • Amplificaciones de MYCN y MYCL son características de SCLC. MYC se expresa en SCLC y en NSCLC, aunque de forma desigual . • MYC en NSCLC: 8% • MYC en SCLC: 18% 24
  • 80. CÁNCER COLORRECTAL ● Generalidades. ● Genes y proteínas relacionados con el cáncer colorrectal. ● Mecanismos de acción de los genes y proteínas relacionados con el cáncer colorrectal. Módulo V 1
  • 81. GENERALIDADES DEL CÁNCER COLORRECTAL Entre el 5 y el 10% de los cánceres colorrectales son hereditarios; hay dos formas de presentación: 1- Poliposis Familiar Adenomatosa (FAP). Presenta numerosos Adenomas y mutaciones germinativas en el gen APC. 2- Cáncer Hereditario no Polipósico (HNPCC o Síndrome de Lynch). Presenta mutaciones germinales en los genes que intervienen en la reparación de ADN, principalmente en hMSH2 en cromosoma 2p21 y hMSH1 en cromosoma 3p21. Módulo V 2
  • 82. ALTERACIONES MOLECULARES RELACIONADAS CON EL CÁNCER COLORRECTAL PÉRDIDAS DE GENES HETEROZIGOCIDAD APC (LOH) p53 CROMOSOMAS K-ras DCC 50% hMSH2 17 18 hMLH1 hPMS1 25% hPMS2 1q, 4p, 5q, 6p, 6q, 8p, 18p, 22q GTBP (hMSH6) hMSH3 (DUG) Módulo V 3
  • 83. GENERALIDADES DEL GEN APC (Adenomatous Polyposis Coli, APC) LOCALIZACIÓN: Cromosoma 5q21. GEN: Consta de 15 exones. PROTEÍNA: Formada por 2843 aminoácidos. Su función no está del todo definida, pero se sugiere que regula la unión de la β-catenina con las proteínas del citoesqueleto. MUTACIONES: Se han descrito mutaciones en el cáncer colorrectal que afectan a los aminoácidos siguientes: 890, 906, 911, 1027, 1307, 1313, 1317 y 1422. Módulo V 4
  • 84. CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL APC GEN: CONSTA DE 15 EXONES CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE 2843 AA 171 722 817 890 911 1176 1307 1317 1422 2738 AA1 AA2843 N C 414 784 880 906 1027 1184 1313 1348 1508 2621 2839 Se han detectado mutaciones en el cáncer colorrectal que afectan a los aminoácidos indicados. Módulo V 5
  • 85. CARACTERÍSTICAS DE LAS MUTACIONES-APC Nº AA AA WT* AA Mutado Localización 171 Ser Ile FAP 414 Arg Cys FAP 722 Ser Gly FAP 784 Ser Thr FAP 880 Ile Thr C Colorrectal, Sind Turcot 890 Val Ile C Colorrectal, Sind Turcot 906 Ser Tyr C Colorrectal 911 Glu Gly FAP, C Colorrectal 1027 Tyr Cys C Colorrectal 1176 Pro Leu FAP 1184 Ala Pro FAP 1307 Ile Lys Población Ashkenazi 1313 Thr Ala C Colorrectal 1317 Glu Glu C Colorrectal 1348 Arg Trp FAP 1422 Asp His C Colorrectal 1508 Ala Val C Colorrectal, Sind Turcot 2621 Ser Cys FAP 2738 Ile Thr FAP 2839 Leu Phe FAP *WT: Wild type. Módulo V 6
  • 86. PROBABLE MECANISMO DE ACCIÓN DE LA PROTEÍNA APC Filamentos de caderinas cateninas actina APC APC APC APC 1º Las caderinas y las cateninas intervienen en las uniones inter-celulares. 2º Las caderinas α β y γ se unen entre sí para formar uniones con los microfilamentos de actina y con las caderinas. 3º La APC se une a la β catenina. Mutaciones que afecten a APC pueden alterar las uniones con el citoesqueleto (actina) y las cateninas de unión. 4º El gen APC actúa como un gen tumoral supresor. Módulo V 7
  • 87. GENERALIDADES DEL GEN p53 LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3, con 11 exones. GEN: Consta de 11 exones. PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos y posee 3 dominios: uno en extremo inicial N, activador de la Transcripción; uno central para unirse al ADN, y uno en extremo C terminal de oligomerización . p53 es funcional cuando está en forma tetramérica. MUTACIONES: La mayor parte de las mutaciones están localizadas en los exones 4, 8 y “hotspots”, en los codones 175, 245, 248 273 y 282. Módulo V 8
  • 88. GENERALIDADES DEL GEN K-RAS LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1. PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos. Se une a la cara interna de la membrana citoplásmatica por el aa 186 y al GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119. MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61. En el Cáncer Colorrectal los codones 12 y 13 están mutados en el 40% de los casos. Módulo V 13
  • 89. GENERALIDADES DEL GEN DCC (Deleted in Colorectal Carcinoma, DCC) LOCALIZACIÓN: Cromosoma 18q21.3. GEN: Contiene 27 exones. PROTEÍNA: La proteína DCC normal consta de 1447 aa. Es una proteína de membrana celular con dominios extra- celular (aa 1 al 1097), transmembrana (aa 1098 al 1122) y citoplasmático (aa 1123 al 1447). En condiciones normales el dominio extra-celular es un receptor para netrin-1, que es una proteína que orienta la dirección de los axones. ALTERACIONES: El DCC se comporta como un gen supresor tumoral. En el cáncer CR es característica la pérdida de heterozigosidad en el cromosoma 18q. Módulo V 19
  • 90. CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DE DCC La proteína DCC consta de 1447 aminoácidos, distribuidos de la siguiente forma: En condiciones normales DCC es un receptor de netrin-1. Del aa 1 al 1097 son extra-celular. Del aa 1098 al 1122 son trans-membrana. Del aa 1123 al 1447 son citoplasmáticos. La unión con netrin-1 bloquea la apoptosis y dirige la orientación de los axones. Módulo V 20
  • 91. CÁNCER COLORRECTAL Y DCC En el cáncer colorrectal se pierden los aminoácidos 25 al 1447. En individuos polimórficos las pérdidas cromosómicas (LOH) del 18q en la zona donde está el gen que codifica para DCC se asocian a un mal pronóstico en el cáncer colorrectal. Módulo V 21
  • 92. PÉRDIDA DE HETEROZIGOZIDAD Y DCC Marcadores moleculares Las células tumorales en el cromosoma 18q. pierden una secuencia en uno de los cromosomas. Las secuencias cromosómicas pueden ser amplificadas por PCR y detectadas en geles de agarosa. Como son polimórficas, En las células tumorales sólo se las secuencias tienen amplifica la secuencia en uno de distinto número de bases los cromosomas; en el otro se ha amplificadas y emigran LOH perdido (deleccionado). a distintos niveles. Módulo V 22
  • 93. GENERALIDADES DEL GEN hMLH1 (human MutantL Homolog, hMLH1) LOCALIZACIÓN: Cromosoma 3p21.3. GEN: Consta de 19 Exones. PROTEÍNA: Está formada por 756 aminoácidos y se localiza en el núcleo celular, donde actúa como proteína reparadora de las lesiones del ADN. ALTERACIONES: Mutaciones en este gen se asocian a tumores hereditarios como: Cáncer de colon no polipósico hereditario (Síndrome de Lynch), Síndrome de Turcot, Síndrome de Muir-Torre, Tumores gastrointestinales y Tumores urogenitales. Módulo V 23
  • 94. CARACTERÍSTICAS MOLECULARES DEL GEN hMLH1 GEN: CONSTA DE 19 EXONES CON VARIACIONES EN LOS SIGUIENTES EXONES: Exón Exón Exón Exón Exón Exón Exón Exón Exón Exón 2 4 6 7 8 12 13 16 17 19 CODIFICA PARA UNA PROTEÍNA DE 756 AMINOÁCIDOS. LAS VARIACIONES EN LOS EXONES AFECTAN A LOS AA SIGUIENTES: 67 322 487 596 AA1 AA756 N C 62 107 117 226 406 497 616 618 659 714 716 Módulo V 24
  • 95. CARACTERÍSTICAS DE LAS VARIACIONES DEL GEN–hMLH1 EXON CAMBIO Nº AA.AAWT*- MUT NUCLEÓTIDO 2 184. C-T 62. Gln-Stop 2 199. G-A 67. Gly-Arg 4 320. T-G 107. Ile-Arg 4 350. C-T 117. Thr-Met 6 965. G-A 322. Gly-Asp 7 1216. C-T 406. Arg-Stop 8 676. C-T 226. Arg-Stop 12 1786-ATT Delet 596. Delet Asp 13 1459. C-T 487. Arg-Stop 13 1490. C Insert 497. Frameshif 16 1852. AA.GG 618. Lys-Ala 16 1846. AAG Dele 616. Delet Lys 16 3,5 kilobase delet 3,5. Delet kb 17 1975. C-T 659. Arg-Stop 19 2141. G-A 714. Trp-Stop 19 2146. G-A 716. Val-Met *WT: Wild type. Módulo V 25
  • 96. ALTERACIONES CROMOSÓMICAS Y CÁNCER COLORRECTAL • Existe una gran variabilidad de secuencias genéticas entre los individuos y muchas de estas variaciones se localizan en zonas no codificantes del ADN (zonas intrónicas). Estas regiones no codificantes se utilizan para crear finger-prints genéticos. • Estas regiones son unidades repetitivas de ADN, que se clasifican en función de su tamaño de repetición. TIPOS DE ADN FINGER-PRINTS • SATÉLITES • MINISATÉLITES • MICROSATÉLITES Módulo V 26
  • 97. CARACTERÍSTICAS DE LOS FINGER-PRINTS TAMAÑO TAMAÑO EN KB CARACTERÍSTICAS TIPO EN PB* (Cromosoma) Se localiza en Satélite 5-200 Megabases heterocromatina y centrómeros. Se localiza a lo largo de todo Minisatélites 9-70 1-20 kb el genoma y de forma especial en los telómeros. Son monounidades de 1-4 menos de 1kb Adeninas o dinucleótidos de Microsatélites CA/CG a lo largo del genoma. *Pares de bases Módulo V 27
  • 98. INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES DEL GEN hMLH1 • El gen hMLH1 tiene la función de codificar para una proteína (hMLH1) que reconoce y repara las lesiones del ADN. • En el cáncer de colon no polipósico hereditario es característica la presencia de alteraciones en el ADN del gen hMLH1, que se conocen como Inestabilidad de Microsatélites (Microsatellite Instability, MSI). •Los microsatélites son secuencias altamente polimórficas entre la población sana. Alelo 1 Alelo 2 CACACACACACACACACACA CACACACACACA Secuencia CA repetida 10 veces. Secuencia CA repetida 6 veces. Previa amplificación por PCR. Las secuencias (CA)n en un gel migran a distintos niveles. Módulo V 28
  • 99. INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES DEL GEN hMLH1 Células normales que Las células tumorales son heterozigotas para pierden CA en uno de los el microsatélite (CA)n alelos. en el cromosoma 18q. Las secuencias de microsatélites pueden ser amplificadas por PCR y detectadas en geles de agarosa. En las células tumorales que han Como son polimórficas, perdido secuencias CA, emigran las secuencias tienen a distinto nivel. distinto número de bases amplificadas y emigran a distintos niveles. MSI Módulo V 29
  • 100. CÁNCER DE MAMA ● Genes y Proteínas relacionados con el cáncer de mama. ● Mecanismos de acción de los Genes y Proteínas relacionados con el cáncer de mama. Módulo IV 1
  • 101. GENES, PROTEÍNAS Y HORMONAS RELACIONADAS CON EL CÁNCER DE MAMA GEN PROTEÍNA K-ras p21 p53 p21 ERBB2 ERBB2 BRCA1 BRCA1 BRCA2 BRCA2 GEN HORMONA ESTEROIDEA Estradiol Estradiol Módulo IV 2
  • 102. GENERALIDADES DEL GEN K-RAS LOCALIZACIÓN: Cromosoma 12p12.1 PROTEÍNA: Consta de 189 aminoácidos. ● Se une a la cara interna de la membrana citoplasmática por el aa 186 y al GTP por los aa 10-17, 57-61 y 116-119. MUTACIONES: Localizadas en los codones 12, 13 y 61. ● En el cáncer de mama las mutaciones de k-Ras son muy bajas (<10%). Módulo IV 3
  • 103. GENERALIDADES DEL GEN p53 LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17p3, con 11 exones. PROTEÍNA: Consta de 393 aminoácidos. ● Posee 3 dominios: uno en extremo inicial N, activador de la transcripción; uno central para unirse al ADN y uno en extremo C terminal de oligomerización. ● p53 es funcional cuando está en forma tetramérica. MUTACIONES: 20-25% en cáncer de mama. ● El 90% de las mutaciones están localizadas entre los exones 5 al 9. ● Las mutaciones más frecuentes están en los codones 175, 248 y 273. ● Las mutaciones relacionadas con peor pronóstico están en los codones 165-185 y 235-252. Módulo IV 9
  • 104. GENERALIDADES DEL ERBB2 (HER2 /NEU) LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17q 21.1. PROTEÍNA: Consta de 1.225 aminoácidos. ● Presenta tres dominios: uno extracelular para unión a factores de crecimiento; uno transmembrana y uno citoplasmático con actividad tirosin-kinasa. VARIACIONES: El gen ERBB2 está amplificado y sobreexpresado en un 20-25% en el cáncer de mama. ● Los tumores con sobreexpresión de ERBB2 suelen asociarse a receptores de estrógenos negativos y son del tipo ductal invasivo. ● Niveles altos de ERBB2 se relacionan con mal pronóstico. ● ERBB2 está permanentemente activado cuando hay una delección de la zona extracelular de la proteína. Módulo IV 14
  • 105. CÓMO ACTÚA ERBB2 NORMAL 1º EGF 2º 3º 4º P P ER MEK ERK K 1º ERBB2 presenta tres dominios: extracelular, transmembrana y citoplasmático. 2º Diversos ligandos, como EGF o TGFα, se pueden unir a ERBB2. 3º La unión del ligando con ERBB2 supone la fosforilación de la parte citoplasmática de la proteína y en consecuencia su activación. 4º La activación de ERBB2 activa la vía de la MAPkinasa y, por lo tanto, la proliferación celular. Módulo IV 15
  • 106. CÓMO ACTÚA ERBB2 AMPLIFICADO EGF EGF EGF 4º P P P P P P ER MEK ERK K En condiciones anormales, ERBB2 puede estar amplificado. Ello supone que con poco ligando habrá fosforilación y activación de MAP-Kinasa, con proliferación celular constante. Módulo IV 16
  • 107. CÓMO ACTÚA ERBB2 DELECCIONADO P P ER MEK ERK K En condiciones anormales la parte extracelular de la proteína puede estar deleccionada. Este fenómemo supone que ERBB2 permanece fosforilado constantemente, activando MAPKinasa y la proliferación celular. Módulo IV 17
  • 108. GENERALIDADES BRCA1 (BReast CAncer) LOCALIZACIÓN: Cromosoma 17q 21. GEN: Consta de 22 exones. ● El exón 11 representa el 50% de toda la secuencia codificante (5592 nucleótidos). PROTEÍNA: Está formada por 1863 aa y con dominios de unión a ADN, ARN, p53, BRCA2 y zinc. ● Presenta funciones diversas: reparación de ADN, control ciclo celular y activación transcripción (gen supresor tumoral). VARIACIONES: Las mutaciones del gen BRCA1 están asociadas al cáncer de mama hereditario (15-20%). ● Las mutaciones pueden estar dispersas por todo el genoma. Las más significativas son las localizadas en las posiciones 185 (delección de AG), 5382 (inserción de C) y en aa 61 y 64. Módulo IV 18
  • 109. BRCA1 24 EXONES POSICIÓN 185. DELECCIÓN AG POSICIÓN 5382. INSERCIÓN C 1 PROTEÍNA 1863 aa N RFM p53 NSL BRCA2 ARN Pol C 61 64 Ph.S  El gen de BRCA1 consta de 24 exones. Se han detectado unas 500 mutaciones que están muy dispersas en el genoma. En posiciones 185 y 5382 están localizadas las mutaciones de la población Judia Ashkenazy.  El gen BRCA1 codifica para una proteína de 1863 aa, que en zona aminoterminal presenta dominios RING Finger Motif (RFM). Mutaciones en esta posición y en los aa 61 y 64, están relacionadas con el cáncer de mama familiar. Hay otros dominios de unión para p53 y proteínas nucleares (NSL).  En zona carboxi terminal presenta uniones para BRCA2 y ARN pol II.  Zona de unión para ATM, que fosforila las Serinas (Ph.S) de BRCA1 en respuesta al daño celular. Módulo IV 19

Notas del editor

  1. 27 Basic Genetics ASCO Curriculum: Cancer Genetics &amp; Cancer Predisposition Testing