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Sesión II:

Terapia Génica




Eva García Alegría
Sumario
CAPITULO I
 HISTORIA
 CONCEPTOS PREVIOS
   Ingeniería genética
   Técnica del ADN recombinante
   Transferencia Génica
      Eficacia de Transfección
      Genes integrados/ no integrados

 TERAPIA GENICA
 OBJETIVOS
 COMPONENTES
Sumario

CAPITULO II

 TIPOS DE TERAPIA
   En cuanto a las células diana
   En cuanto a la técnica empleada

 VECTORES
   Características de elección
   Marcaje celular
   Clasificación de los vectores.
      Vectores no virales
      Vectores virales
Sumario
CAPITULO III

 Estrategias con Ácidos nucleicos
    Terapia antisentido
    Reparación génica
    Ribozimas
 Aplicaciones de la terapia génica
    Enfermedades monogénicas
    Cáncer
    VIH
 Jurisprudencia y ética en Terapia génica
HISTORIA
•Enero 1989 Estados Unidos aprueba el protocolo
clínico para insertar un gen extraño en las células del
sistema inmunitario de pacientes de cáncer. la
“tecnología para insertar genes en humanos había
llegado”.
•Septiembre de 1990, se aprobaba el primer ensayo
clínico de auténtica terapia génica, introducir el gen que
codifica para la enzima adenosin desaminasa (ADA) en
niños que padecen una inmunodeficiencia combinada
severa (SCID). Febrero 1991 se autorizó también en
Italia
•En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los
resultados de su experimentación clínica: eficacia de la
técnica de TG ex vivo en los “niños burbuja”.
HISTORIA
•A partir de 1990 los protocolos experimentales de
TG aumentaron en un progreso continuo.
El RAC estimaba 567 pacientes incluidos en los 106
experimentos aprobados de los que sólo una pequeña
fracción de ellos están encaminados a la corrección
de genes defectuosos, la mayor parte están diseñados
para inducir en células específicas, proteínas que
hagan a estas células vulnerables al ataque por el
sistema inmune de los pacientes.
Conceptos previos
Ingeniería genética
La manipulación de la información genética, con miras
al análisis genético o al mejoramiento de una especie.
Técnica de ADN recombinante
Transferencia génica
Técnicas de genética molecular que permiten intercalar un
También conocido como Transducción ó tranfección:
segmento de ADN extraño en un ADN receptor. una
es la introducción de material genómico en
célula
 Eficacia de transferencia:
  Factor que determina si los genes introducidos en la
 células se expresan en cantidad adecuada. Dependerá
 en gran manera de la integración
Conceptos
 Genes integrados en el cromosoma.
Perpetuarse por replicación cromosómica pasando a la
progenie            expresión estable a largo plazo.
Interesante en células madre, población inmortal de
células que se perpetúan a sí mismas y de las que derivan
el resto de células de un tejido.
Inserción al azar. Enorme variabilidad de
localización, pudiendo no expresarse.
 Puede provocar la muerte celular por integrarse en
la secuencia de un gen crucial inactivándolo.
 Riesgo de cáncer por variar los patrones de
expresión de los genes de proliferación celular.
Inactivación gen supresor ó activación de un oncogen
Conceptos
 Genes no integrados:

Quedan en la célula como elementos extracromosómicos
(episomas).

 En células en división activa puede darse una
segregación diferente en las células hijas del gen
introducido. Varia la expresión a largo plazo.

 Difícil curar enfermedades que requieran una
expresión estable, pero efectivo en terapias como la del
cáncer que persiguen una acción del gen hasta la
eliminación del tumor.
Transferencia génica realizada en células de
individuos humanos con el fin de corregir
deficiencias heredadas ó adquiridas y
obtener así un beneficio terapéutico
OBJETIVOS
Complementar ó sustituir el defecto en la función
del gen introduciendo una copia del gen normal en
estas células. “Inserción génica ó cirugía génica”
Inhibir ó bloquear el funcionamiento de genes que
contribuyen al desarrollo de la enfermedad. Ej.
Terapia del cáncer frente a oncogenes.
“Modificación génica”
Introducir la información que permita a la célula
sintetizar una proteína con efecto terapéutico. Ej:
estimulación del sistema inmune
Componentes
• Gen de interés terapéutico
•     Célula diana: célula a la cual va dirigida la
transferencia génica.
  • Fuertes para resistir la manipulación
  • Susceptibles de ser extraídas del organismo humano y
  reintroducidas en él con facilidad
  • Larga vida mejor toda la vida del paciente, (médula ósea,
  la piel e hígado las que más se ajustan a estos criterios, son
  las más firmes candidatas para la terapia génica).
• Vector: sistema ó vehículo utilizado para transferir
el material genético al interior de la célula diana
Terapia génica
Tipos de Terapia Génica
Atendiendo a la célula diana

Terapia génica germinal:
      Dirigida a modificar el acervo genético de las
células germinales, implicadas en la formación de los
gametos y por tanto transmisibles a la descendencia.

Terapia génica somática:
       Dirigida a modificar las célulcas somáticas que
constituyen un organismo. Dicha modificación no es
transmisible a la descendencia. Actualmente UNICA
TERAPIA CON ENSAYOS CLINICOS
Atendiendo a la metodología aplicada
• In vivo:
  El material genético es introducido mediante vectores
  directamente en las células diana del individuo a
  través del torrente circulatorio. No hay extracción
  previa ni manipulación in vitro.
• In situ:
       La modificación genética de las células del
paciente se realiza introduciendo el ADN
directamente en el propio órgano defectuoso del
individuo (fibrosis quística, distrofia muscular de
Duchenne o la supresión de tumores por “suicidio”
celular)
• Ex vivo:
  Las células a tratar son previamente extraídas,
  aisladas y crecidas en cultivo realizando la
  transferencia génica in vitro. Se devolverán al
  paciente solo las poblaciones celulares
  seleccionadas del cultivo en las que se ha
  comprobado      la    integración    y   correcto
  funcionamiento del transgen. Ej. “Niños Burbuja”
Qué metodología elegir

   Rasgos fisiológicos del tejido diana
    Naturaleza del tejido respecto de los genes a
    transferir
    Facilidad de transferir los genes dentro de las
    células
   La habilidad para llegar al tejido
    La respuesta inmune frente al método de
    transfección
V
E
C
T
O
R
E
S
Características de
                 elección de un vector
• Buena eficiencia en la transferencia
  génica.
• La expresión del transgen sea duradera.
  Dependerá de el tipo de integración del
  material génico.
• Tamaño del ADN capaz de transducir.
  Limita mucho el desarrollo de vacunas.
• Baja inmunogeneicidad.
Marcaje celular

Permite identificar y seleccionar in vitro las células
diana que hayan incorporado el transgen ó
comprobar el grado de transferencia in vivo.

Marcaje simple: con gen de resistencia a antibiótico
(ej: neomicina)
Marcaje doble: cuando se requiera suspender un
tratamiento se añade al marcaje simple un gen de
selección negativa in vivo. , Ej. enzima Timidina
Quinasa del Herpes simple, capaz de fosforilar el
Ganciclovir, activando y provocando la muerte de la
 célula transfectada.
Clasificación de vectores
 Vectores No virales          Vectores Virales
 Métodos químicos:
 –fosfato cálcico            Retrovirus
 –Liposomas
 – Mediados por receptores
                             Adenovirus
Métodos físicos
 –Biolística ó disparo de    Herpes virus
 partículas
 –Microinyección
 –Electroporación            Virus adenosasociados
VECTORES NO VIRALES

   METODOS QUIMICOS
    METODOS FISICOS
 Primeros vectores desarrollados
 ADN exógeno integrado en un plásmido que se
 mantendrá de manera episómica, independiente
 del genoma de la célula diana.

 Sencillos de producir y más económicos
 No tienen limitaciones de tamaño del ADN
  vehiculizado
 Poca toxicidad no inmunogénicos

 Baja eficiencia de transducción
Algunos solo validos in vitro
Métodos Químicos
1.Fosfato cálcico:
Los iones Ca 2+ precipitan el ADN provocando su
entrada por endocitosis en el interior de la célula

   No provoca toxicidad

 Expresión transitoria del
transgen
 Eficacia de transfección del
10%
 Utilización sólo en cultivo ex
vivo
Métodos Químicos
2.Liposomas catiónicos:
Bolsas rodeadas de membrana lipídica capaces de
interaccionar con los fosfatos del ADN, condensándolo y
con las cargas negativas de la membrana celular mediante
enlaces electroestáticos.

  Libera el ADN en el citoplasma, evitando la
 degradación lisosomal.
  El ADN compactado queda protegido de nucleasas
  No tiene límite de tamaño de ADN a transducir
  Baja inmunogenicidad
  In vivo eficacia de transfección disminuida.
Métodos Químicos
3.Mediado por receptores :
Se insertan partículas que serán reconocidas por
receptores presentes en el tipo celular diana. Permite un
interacción específica transportador/célula.
Se les asocian moléculas “fusiógenas” que actúan al
acidificarse el medio desestabilizando la membrana del
endosoma evadiendo así la acción lisosomal.

Endocitosis           endosoma        acidificación del
interior           lisosoma degradación.
Métodos Físicos
 1.BIOLISTICA
 ADN situado en gotas de 1-3
 micras de oro o tungsteno y
 aceleradas por gas ó por
 descarga eléctrica.

Fácil manejo.
Varias integraciones en un disparo

Muerte celular en la zona
Capacidad penetración limitada
Variable eficacia de la
expresión
Necesidad de muchas dosis.
Métodos Físicos
2. MICROINYECCION
ADN introducido en el núcleo de las células gracias a un
micromanipulador. Se utiliza frecuentemente en estudios
ex vivo


 Evita la degradación lisosomal y citoplasmática
Alta eficiencia en la expresión

  laborioso, necesita células aisladas.
 Existen células que no sobreviven
Técnica del ADN desnudo
Inyección directa de la parte codificadora a un tejido. In
vivo
ADN introducido con una solución salina y administrado
intramuscularmente. Se desconoce el mecanismo por el
cual entra en la célula.
Método directo, simple, económico
Baja toxicidad
Utilización en Vacunas al alcanzar respuesta
inmunológica
Baja eficacia transfección. No se integra en el genoma
Expresión génica corta (días)
Métodos Físicos
3.ELECTROPORACION
Apertura de los poros de membrana mediante la
aplicación de corriente eléctrica, permitiendo la
entrada del gen.
 Células pueden ser
aisladas y sometidas a
control. Selección de las
mejores, cultivadas antes de
implantarlas al paciente.

 Muchas células no soportan
el choque eléctrico. Indicado
en células con alta tasa de
proliferación
V
                  I
                  R
                  A
                  L
                  E
•RETROVIRUS       S
•ADENOVIRUS
•ADENOASOCIADOS
•HERPEXVIRUS
Formación de virus defectivos:
Eliminación de 1 ó mas genes virales
imprescindibles para la replicación y sustitución
por el gen terapéutico.
Mantendrá la capacidad de infectar pero no la
replicación y virulencia.
Las secuencias necesarias para la replicación se
añaden en células ayudantes que soportan la
producción del vector, funcionando en trans.
 Vectores más utilizados actualmente.
 Elevada eficacia de transfección ( incluso 100%)
Limitaciones de su uso:

Tamaño del gen terapéutico en función del
tamaño del virus.
Transferencia y expresión de genes virales
     Transferencia no deseada del virus nativo
     Activación de un virus patógeno
    Activación de un oncogen por recombinación
  génica con el genoma del huésped
Reacción inmunitaria in vivo por muerte de las
células modificadas.
RETROVIRUS
Características
Genoma es ARNss y durante su ciclo vital utiliza la
maquinaria replicativa de la célula huésped para lo
cual se retrotranscribe a ADNds integrándose en el
genoma.

Organización del genoma: 10Kb que codifican 3 genes
      gag: antígenos, proteínas de cápsida y matriz
      pol: transcriptasa inversa, proteasa e integrasa
      env: proteínas de la envoltura del virus
LTRs: Extremos del genoma (ADN ya) con actividades
promotoras y secuencias para la integración.
Vector retroviral
                           Virus defectivo para genes
                           de proteínas estructurales,
                           gag, pol y env.
                           Extremos LTRs
                           Secuencia de
                           empaquetamiento
                           Unidad transcripcional con
                           el gen de interés.

Línea de células envase: contiene copias integradas de
los genes virales pero no la señal de empaquetamiento,
permite así el desarrollo del vector.
Ventajas e inconvenientes
 Estrategia pionera en técnicas ex vivo.
 Eficaz transducción.Integra hasta 8 kb tamaño.
 Integración y expresión persistente

 La mayoría se integran en células que se replican
(excepto el VIH), lo cual limita su uso como vector.
 Derivación oncogénica por incorporación de
protooncogenes ó por mutagénesis insercional activando
un oncogen adyacente.
 Precaución para asegurar la ausencia de virus de
replicación competente.
A
D
E
N
O
V
I
R
U
S
Características
Genoma es ADNds lineal. Su ciclo vital requiere la
división celular y provoca una infección productiva de
células tolerantes durante la cual se acumulan en el
núcleo grandes cantidades de virus. Están asociadas
con enfermedades benignas en humanos
Organización del genoma: 35 Kb con varias unidades
de transcripción, proceso que se realiza de manera
secuencial.
Genes E1 activa otros genes tempranos
Genes E2 proteínas involucradas en la replicación ADN
Genes E3 funciones para detener mecanismos de defensa
Genes E4 funciones regulan la transcripción entre las fases
primaria y secundaria del ciclo viral
Vector adenoviral
 Deficientes para
 replicarse por lo que
 necesitan un sistema
 celular de
 complementación que
 produzca los elementos
 E1 que han sido
 suprimidos. Línea
 celular humana 293 que
 aporta las proteínas.
Ventajas e inconvenientes
 Puede insertar 20Kb
 Capaces de transferir el gen en amplia cantidad
de células y tejidos
 Fáciles de producir en grandes cantidades
 Infecta células en reposo ó en división

 Expresa varias proteínas virales inmunogénicas,
separándose más rápido el vector de las células por
la repuesta del hospedador. limitando la duración de
la expresión y la capacidad de repetir la dosis
ADENOASOCIADOS “AAV”
Características
Genoma ADNs lineal. Virus muy pequeño y simple..
Requiere la coinfección con adenovirus u otros para
replicarse.
Extendido en humanos pero no asociado a enfermedad
conocida. Se integran de manera específica en el
cromosoma 19 en ausencia de virus ayudante.
Organización del genoma muy simple, solo 2 genes
      rep: proteinas involucradas en replicación e
integración
      cap: 3 proteínas estructurales
Extremos TR
Vector AAV

 Vectores muy simples
con solo las secuencias
TR.
Lleva consigo la
introducción de un
plásmido que codifica
rep y cap para proveer
de las funciones de virus
ayudante.
Ventajas e inconvenientes

 Expresión a largo plazo en células que no se dividen.
 Estructuralmente simples.
 Provocan menor respuesta del hospedador

 Tamaño solo de 4 Kb
 Transducen células infectadas por Adenovirus
 Difíciles de desarrollar en grandes cantidades

Se están realizando nuevos VAA que combinen la
habilidad de integrarse con mayores fragmentos ADN
HERPESVIRUS
Características
Genoma ADNds lineal. Virus de 100-250Kb.
 Gamma: infección latente en células en división,
replicándose con la célula y siendo heredado.
 Alfa: no pueden mantener la infección latente en células
en división. Puede mantenerse de manera episómica
indefinidamente en células de larga duración (ej: neuronas
sensoriales en HSV) Tropismo específico por el SNC
 Beta: desconocimiento de la naturaleza de la infección
latente

Organización del genoma 2 trozos de ADNds unidos
llamados molécula L y molécula S, las cuales se unen por
sus secuencias terminales TRL y TRS. Pueden unirse de
4 formas diferentes “isómeros”
Vector Herpesvirus
Gran variedad en función
del tipo de herpes virus.
El más conocido es el del
herpes simple HSV con
los promotores LAT
como elementos promesa
para dar expresión
suficiente en diferentes
tipos de neuronas.
Los genes virales
eliminados se introducen
en trans en la célula
ayudante.
Ventajase inconvenientes
 Capaces de llevar grandes secuencias de ADN.
 Pueden provocar infección latente de larga duración
sin integrarse (episoma). Gran variación dentro de esta
familia.

  Baja eficiencia transducción
  Expresión transitoria del gen.
  Gamma: asociados a daños proliferativos, incluso
 malignidad. Identificar los genes responsables y
 eliminarlos
Sumario
CAPITULO III

 Estrategias con Ácidos nucleicos
    Terapia antisentido
    Reparación génica
    Ribozimas
 Aplicaciones de la terapia génica
    Enfermedades monogénicas
    Cáncer
    VIH
 Jurisprudencia y ética en Terapia génica
ESTRATEGIAS
CON ACIDOS
NUCLÉICOS




               Terapia antisentido
               Reparación génica
               Ribozimas
TERAPIA ANTISENTIDO
      Oligonucleótidos complementarios a secuencias
específicas de un determinado ARNm (secuencia sentido)
bloqueando su traducción mediante la formación de
heteroduplex y estimulando la Ribonucleasa H.
       Se han desarrollado también secuencias antigen
“tríplices” que interaccionan con ADN formando triples
hélices que bloquean la transcripción..
 Potencial terapéutico en enfermedades autoinmunes,
el cáncer y el SIDA
  Corta vida media en la circulación sistémica
  Dificultad para acceder funcionalmente al
 citoplasma y al núcleo celular. Se cambian grupos
 fosfato para dejarlos sin carga y que penetren mejor.
TERAPIA ANTISENTIDO
Terapia génica
REPARACIÓN GÉNICA

Objetivo: reparar genes alterados por mutación
puntual conocida.

Método: la activación de los mecanismos celulares
de reparación del ADN.

Técnica: diseño de oligos específicos para
secuencias genómicas adyacentes a la mutación y
que llevan un agente capaz de lesionar el ADN
RIBOZIMAS
 ARN con actividad enzimática
       catalizan reacciones de rotura y ligamiento en
 lugares específicos de un ARN diana gracias a
 secuencias guía internas (IGS) que pueden ser
 variadas cambiando la especificidad del ribozima

 Requieren de un metal
con carga divalente para
la reacción química (ej;
Mg 2+ ).

 Capaces de cortar las
dianas y repetir el ciclo de
unión, rotura y
disociación.
RIBOZIMAS


Optimizar la función a nivel intracelular:
   • Reparto a las células apropiadas: lo más
   utilizados son los vectores retrovirales y los AAV
   • Expresión intracelular: elección del promotor
   • Co-localización con el ARN diana, aumentando
   la eficacia.
   •Reciclaje del substrato
RIBOZIMAS
RIBOZIMAS
APLICACIONES EN TERAPIA
GÉNICA HUMANA
ENFERMEDADES CANDIDATAS
• Amenazar gravemente la vida del paciente
• Órganos tejidos y tipos celulares afectados deben estar
  bien caracterizados.
• Versión normal del gen defectuoso ha de estar aislada
  y clonada.
• Gen normal debe poderse introducir en una fracción
  significativa del tejido afectado ó bien en un tejido
  accesible que revierta indirectamente en el curso de la
  enfermedad
• Gen debe poder expresarse de manera que genere
  suficiente proteína normal.
Deficiencia de la Adenosin Desaminasa
                “Niños Burbuja”
Disfunción de las células T y B provocando muerte
por infección masiva generalizada. Niños con
esperanza de vida limitada al carecer de respuesta
inmunitaria. 25% de los casos de SCID.
Tratamiento actual: transplante medula osea de
donante HLA idéntico, lo cual reduce mucho las
posibilidades y además la operación tiene una alta
mortandad. También inyecciones con ADA sintética.
Terapia Génica: introducción del gen ADA normal
por transfección con vector retroviral en linfocitos
T aislados del paciente
Problemas: resultados variables y posible mutagénesis
FIBROSIS QUISTICA

Gen de la FQ es el CF
ADNc del gen de la conductancia transmembrana
CFTR construido y clonado en vector retroviral.
Células CF- eran infectadas y seleccionadas
posteriormente por un gen de resistencia.
Las células transfectadas adicionando estimulador de
la adenilato ciclasa expresaban el gen, detectándose
funcionamiento de los canales de Cloro

La terapia génica de la FQ es también realizada
mediante métodos químicos con liposomas
catiónicos que llevan el gen CFTR.
DISTROFIA MUSCULAR DE
        DUCHEME
Mioblastos individuales “células satélite”capaces de
fusionarse con otras para la regeneración muscular.
Ideal como vector.
Se logró un ADNc del gen de la distrofina y se clonó en
un vector retroviral, con el cual se transfectaron las
células.
Comprobaron por anticuerpos que se producía la
molécula correcta y se localizaba en la membrana
celular.
Queda mucho para que tenga aplicación clínica
HEPATOCITOS
        Enfermedades metabólicas hereditarias como la
 Hipercolesterolemia familiar y Hemofilia afectan a este
 tejido por lo que se han desarrollado técnicas a partir de
 aislar y cultivar hepatocitos.

Hipercolesterolemia
provocada por la
mutación en el
receptor de la
lipoproteína de baja
densidad LDLR
HEMOFILIA B
      Inyección de un AAV que contiene el gen que
codifica para el factor IX. Se suspendió el tratamiento en
mayo de 2004 por tener resultados aislados en pocos
pacientes.
                                             PARKINSON
      Inyección de un AAV con el gen que codifica el
enzima GAD en el cerebro de pacientes afectados.
Produce estimulación del ácido GABA Primer
experimento de la fase clínica en esta enfermedad,
comenzó en agosto 2003.
                                         HEMOFILIA A
       Inyección con células del pacientes una vez
 transformadas in vitro con un plásmido que contiene
 el gen que codifica para el factor VIII plasmático. Los
 pacientes mostraron una modesta mejora.
DIABETES
      AAV transformado con el un cDNA que codifica
para insulina sintética. Se añade un promotor, activo
únicamente en células del hígado, y que estimule por la
presencia de glucosa.
También se ha adicionó un “enhancer” aumentando la
expresión y una señal que permita que la insulina sea
secretada al medio.
           ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA
      Enfermedad con degeneración en las neuronas
motoras. Experimentos en ratones portadores del gen
humano mutado de la enzima superóxido dismutasa.
Transfectados con AAV mostraron una menor
destrucción de las neuronas.
FIBROBLASTOS DE PIEL

Vehículos para transferir genes. Se obtienen fácilmente,
crecen in vitro y son infectados por vectores retrovirales.
      Mucopolisacaridosis (enfermedad hereditaria
caracterizada por deficiencia de enzimas lisosomales).
      Enfermedad de Gaucher (deficiencia del enzima
glucocerebrosidasa)
      Deficiencia de Adenosin desaminasa
     Hemofilia B: causada por déficit del factor IX
plasmático.
Células hematopoyéticas
  Células madre medulares que dan lugar a todas las
  células hematopoyéticas, utilizadas como vector
  para transportar genes al paciente.
        Fáciles de obtener
        Crecer bien in vitro
        Soportar la infección retroviral
        Fácil de devolver al paciente
        Continuar viva varios meses

Dificultades: bajo nivel de expresión del gen introducido
Clonación del producto terapéutico
Proteínas Humanas clonadas en cultivos celulares de bacterias y
levaduras y crecidas in vitro las seleccionadas con el transgen .
    Insulina (para la diabetes)
    Factor VIII (para hemofilia A)
    Factor IX (Hemofilia B)
    Hormona de crecimiento GH
    Eritropoyetina ( para tratar la anemia)
    Interferones e Interleukinas distintas
    Adenosin desaminasa (tratar la inmunodeficiencia severa
   combinada)
    Angiostatina y Endostatina (drogas contra el cáncer)……...
TERAPIA
GENICA DEL
 CANCER
Estrategias
Sustitución de oncosupresores defectuosos
Inhibición de la expresión de oncogenes por
 terapia antisentido
Inserción de vectores suicidas. Adenovirus
 oncolíticos
Inmunotoxinas
Vacunas tumorales: Aumenta la immugenicidad
 del tumor introduciendo antígenos foráneos
Aumentar la actividad antitumoral de células
 inmunes por medio de Citoquinas.
SUSTITUCIÓN DE ONCOSUPRESORES

Oncosupresor: Gen que actúa inhibiendo la
proliferación celular y cuya pérdida puede implicar la
génesis tumoral.
Los más conocidos: rb, p53, dcc,fap,nf1,nf2,wt1 y p16

Terapia genética mediada por vector retroviral que
lleve la copia intacta del oncosupresor.


Eficacia mejorada al introducir en el tumor varios
oncogenes y oncosupresores a la vez, que corrijan las
alteraciones acumuladas
INHIBICION DE ONCOGENES
Oncogenes: genes capaces de producir transformación
maligna al expresarse inadecuadamente por una
mutación o ampliación
Protooncogenes: genes normales con importante papel
en la proliferación y diferenciación celular y susceptibles
de mutación convirtiéndose en oncogenes. Más de 50
identificados actualmente.

Terapia génica antisentido para regular su expresión
bloqueando la formación de las proteínas.
Éxito in vitro en varios oncogenes, comprobando en
animales la desaparición de tumores sin recidivas ni
secuelas.
INSERCION DE VECTORES SUICIDAS

Virus defectivos cuyos genes han sido sustituidos por
un gen de selección (neomicina) y otro capaz de
inducir su propia muerte (tk de herpes virus).

En ratas se ha constatado la muerte de las células
tumorales infectadas con retrovirus defectivos al
administrar ganciclovir.
      Humanos: se encuentra en fase de ensayo clínico
en tumores cerebrales produciendo, en algunos casos
la disminución del tumor.
Actualmente se trabajan con promotores específicos
de tumor para evitar la muerte de células no
tumorales.
INMUNOTOXINAS
“BOMBAS BIOLÓGICAS” ó balas mágicas: Acoplar
anticuerpos tumorales específicos a toxinas mortales
actuando como proyectiles dirigidos a células
cancerosas.
El anticuerpo monoclonal da especificidad al estar
dirigidos contra un parte especifica de la proteína.
 Requisitos de la inmunotoxina:
      Antígeno en la superficie celular; receptores y
carbohidratos de membrana
       Penetración eficaz del complejo antígeno - anticuerpo en
       el citoplasma celular
       Que reconozcan las formas mutadas pero no las normales,
       o por lo menos se expresen menos en estas.
INMUNOTOXINAS

Las toxinas más utilizadas son: Ricina T. Diftérica y
exotoxinas de Pseudomonas. Su modo de acción es
inhibir la síntesis protéica a nivel ribosomal.

 Efecto antitumoral más rápido que el desarrollo de la
 respuesta inmunológica.


  No llegan a todas las células cancerosas, sobre todo
 en tumores sólidos.
  Pueden reaccionar con cualquier célula provocando
 toxicidad no específica.
VACUNAS
       Moléculas con capacidad para provocar
respuesta inmune frente a antígenos propios específicos
de tejido.
2 tipos de antígenos reconocidos por células T
citotóxicas:
    Proteínas aberrantes de los oncogenes exclusivas
     de células tumorales y diferentes a las de
protooncogenes.
    Productos de genes embrionarios que no se
expresan en células adultas.

 Primeros tratamientos con pequeña respuesta.
LINFOCITOS MODIFICADOS

       Linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs): se
infiltran en tumores siendo capaces de matar células
tumorales al administrarlos con el factor de
crecimiento Interleukina 2.
Estrategia terapéutica ex vivo, introducidos en
células aisladas de tumor, transfectadas por vector
retroviral y marcadas con resistencia a neomicina
para comprobar el grado de eficiencia.
El porcentaje de eficiencia en la transferencia y la
pérdida posterior de los linfocitos modificados
hacen necesarias más pruebas.
TERAPIA
 GENICA
DEL VIH
CICLO VITAL
OBJETIVOS


   Protección de las células no infectadas
   Destrucción de las células infectadas
   Reducción de la infección en pacientes
   Evitar la propagación
ESTRATEGIAS

I.    Estimular sistema inmune al transferir un gen del virus.
II.    Introducir genes inhibidores de la replicación vírica
      (interferón).
III. Transferir genes de proteínas víricas mutantes que
     compiten con las normales dificultando el ensamblaje ó la
     replicación.
IV. Secuestro de proteínas víricas reguladoras por señuelos
    de ARN, evita que se unan a sus puntos de acción.
V.    Terapia antisentido: Ribozimas y Oligonucleótidos
VI. Introducción de anticuerpos frente a proteínas del VIH,
     inmunización intracelular.
Estimulación del sistema inmune

     Vacunas génicas mediante la expresión
de proteína viral por inyección directa de
ADN plasmídico que lleva genes virales.


Problema: elevada tasa de mutación que
le permite escapar de la respuesta inmune.
Inhibición por Interferones

     ADNs copia de interferones insertados
en vectores y transfectadas células diana.
Provoca la inducción de algunas proteínas
celulares que interactúan con estructuras
virales inhibiendo la expresión de proteínas
víricas necesarias para la replicación
TERAPIA ANTISENTIDO

     Oligonucleótidos: ARN antisentido
vehiculizado por un AAV produce reducción
de más de un 90% de la replicación.
Necesitan estar en un numero muy elevado.
      Ribozimas: ARN que cataliza ARN
viral, son expresados establemente en células
 pudiendo inhibir la replicación. No
necesitan tanta cantidad porque los
ribozimas se regeneran.
Interrumpir procesos virales
 Modificación de
la molécula CD4 no
pudiendo infectar la
célula.
 Introducir
proteínas mutantes
 Secuestro de
proteínas por señales
de retención del
retículo plasmático.
JURISPRUDENCIA
Y ETICA EN LA
TERAPIA GÉNICA
LEGISLACION
• Ley de 28 de diciembre de 1988: prohibiciones y
sanciones sobre clonación y utilización de embriones y
fetos humanos.
• Artículos 159 al 162 del código penal de 1995. El 159
protege la integridad de la especie su desarrollo. El 161
defiende la intangibilidad del patrimonio genético
humano y la identidad genética de los ciudadanos.
• Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida: admite la
terapia génica en línea germinal (embriones y fetos en el
útero) solo si cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de
una enfermedad en los que la terapia sea posible
científicamente y no se influya en los rasgos hereditarios
no patológicos ni se busque selección de individuos.
LEGISLACION
• Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida:
     El gobierno del PP el año pasado delimitó el uso
de embriones destinados a investigación a los
congelados antes del 2003 y también el número de
embriones susceptibles de implantación en el útero.
 Actualmente se está llevando a cabo por el gobierno
socialista una nueva reforma que permitirá además de
la investigación de los embriones sobrantes la selección
preimplantaciónal de un determinado embrión frente a
otro con el fin de obtener un fin terapéutico a un
tercero (ej: un hermano con enfermedad hereditaria
que podrá ser transplantado con medula ó cordón
umbilical del futuro niño).
LEGISLACION
• Declaración de l a UNESCO sobre genoma Humano y
derechos Humanos (199 art. 24 invita a identificar
aquellas prácticas contrarias a la dignidad humana en
clara alusión a la TG germinal.
•Convenio Europeo de Bioética 1997. Art 13:
únicamente podrá realizarse intervenciones que tengan
como objeto modificar el genoma humano por razones
preventivas, diagnósticas ó terapéuticas siempre que no
tengan como finalidad la introducción de una
modificación en el genoma de la descendencia.
•Parlamento Europeo y del Consejo (1998) Art. 6.2b
se considera no patentables los procedimientos de
modificación de identidad genética germinal del ser
humano.
ETICA
      El fin ultimo de la terapia es obtener un beneficio
para el paciente, intentando que lleve una vida normal.
Hay peligros potenciales derivados de la técnica y
peligros de índole menos noble y más humana.

En cuanto a la técnica empleada:
     Posibilidad de despertar alelos defectivos y genes
reprimidos que conlleven incluso mortalidad.
     Reacciones inmunológicas contra una proteína
nueva provocando incluso la muerte.
      Seguridad de evitar que los vectores vuelvan a ser
virus de replicación competente. ¿Están realmente bajo
nuestro dominio seres con alta capacidad de mutación?
ETICA
      Riesgo de la Terapia en línea germinal: cualquier
modificación se transmite, nuestros descendientes serían
genéticamente distintos.
       El desafío a la ley natural de selección cribando
los más adaptados es una puerta al juego, cuanto menos
peligroso, de provocar ventajas adaptativas que
mejorasen la especie, bajo excusas nobles de salvar
vidas.
Hay que pensar siempre en las consecuencias posibles de
todas las terapias que se administran, y en este caso
especialmente porque pueden influir a toda una especie.
Por otra parte el negocio de la salud y la búsqueda de
los beneficios de todos estos avances hace al hombre
más peligroso que muchos virus, olvidando que la salud
es un derecho de todos.

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Terapia génica

  • 2. Sumario CAPITULO I  HISTORIA  CONCEPTOS PREVIOS Ingeniería genética Técnica del ADN recombinante Transferencia Génica Eficacia de Transfección Genes integrados/ no integrados  TERAPIA GENICA  OBJETIVOS  COMPONENTES
  • 3. Sumario CAPITULO II  TIPOS DE TERAPIA En cuanto a las células diana En cuanto a la técnica empleada  VECTORES Características de elección Marcaje celular Clasificación de los vectores. Vectores no virales Vectores virales
  • 4. Sumario CAPITULO III  Estrategias con Ácidos nucleicos Terapia antisentido Reparación génica Ribozimas  Aplicaciones de la terapia génica Enfermedades monogénicas Cáncer VIH  Jurisprudencia y ética en Terapia génica
  • 5. HISTORIA •Enero 1989 Estados Unidos aprueba el protocolo clínico para insertar un gen extraño en las células del sistema inmunitario de pacientes de cáncer. la “tecnología para insertar genes en humanos había llegado”. •Septiembre de 1990, se aprobaba el primer ensayo clínico de auténtica terapia génica, introducir el gen que codifica para la enzima adenosin desaminasa (ADA) en niños que padecen una inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Febrero 1991 se autorizó también en Italia •En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los resultados de su experimentación clínica: eficacia de la técnica de TG ex vivo en los “niños burbuja”.
  • 6. HISTORIA •A partir de 1990 los protocolos experimentales de TG aumentaron en un progreso continuo. El RAC estimaba 567 pacientes incluidos en los 106 experimentos aprobados de los que sólo una pequeña fracción de ellos están encaminados a la corrección de genes defectuosos, la mayor parte están diseñados para inducir en células específicas, proteínas que hagan a estas células vulnerables al ataque por el sistema inmune de los pacientes.
  • 7. Conceptos previos Ingeniería genética La manipulación de la información genética, con miras al análisis genético o al mejoramiento de una especie. Técnica de ADN recombinante Transferencia génica Técnicas de genética molecular que permiten intercalar un También conocido como Transducción ó tranfección: segmento de ADN extraño en un ADN receptor. una es la introducción de material genómico en célula Eficacia de transferencia: Factor que determina si los genes introducidos en la células se expresan en cantidad adecuada. Dependerá en gran manera de la integración
  • 8. Conceptos Genes integrados en el cromosoma. Perpetuarse por replicación cromosómica pasando a la progenie expresión estable a largo plazo. Interesante en células madre, población inmortal de células que se perpetúan a sí mismas y de las que derivan el resto de células de un tejido. Inserción al azar. Enorme variabilidad de localización, pudiendo no expresarse.  Puede provocar la muerte celular por integrarse en la secuencia de un gen crucial inactivándolo.  Riesgo de cáncer por variar los patrones de expresión de los genes de proliferación celular. Inactivación gen supresor ó activación de un oncogen
  • 9. Conceptos Genes no integrados: Quedan en la célula como elementos extracromosómicos (episomas).  En células en división activa puede darse una segregación diferente en las células hijas del gen introducido. Varia la expresión a largo plazo.  Difícil curar enfermedades que requieran una expresión estable, pero efectivo en terapias como la del cáncer que persiguen una acción del gen hasta la eliminación del tumor.
  • 10. Transferencia génica realizada en células de individuos humanos con el fin de corregir deficiencias heredadas ó adquiridas y obtener así un beneficio terapéutico
  • 11. OBJETIVOS Complementar ó sustituir el defecto en la función del gen introduciendo una copia del gen normal en estas células. “Inserción génica ó cirugía génica” Inhibir ó bloquear el funcionamiento de genes que contribuyen al desarrollo de la enfermedad. Ej. Terapia del cáncer frente a oncogenes. “Modificación génica” Introducir la información que permita a la célula sintetizar una proteína con efecto terapéutico. Ej: estimulación del sistema inmune
  • 12. Componentes • Gen de interés terapéutico • Célula diana: célula a la cual va dirigida la transferencia génica. • Fuertes para resistir la manipulación • Susceptibles de ser extraídas del organismo humano y reintroducidas en él con facilidad • Larga vida mejor toda la vida del paciente, (médula ósea, la piel e hígado las que más se ajustan a estos criterios, son las más firmes candidatas para la terapia génica). • Vector: sistema ó vehículo utilizado para transferir el material genético al interior de la célula diana
  • 14. Tipos de Terapia Génica
  • 15. Atendiendo a la célula diana Terapia génica germinal: Dirigida a modificar el acervo genético de las células germinales, implicadas en la formación de los gametos y por tanto transmisibles a la descendencia. Terapia génica somática: Dirigida a modificar las célulcas somáticas que constituyen un organismo. Dicha modificación no es transmisible a la descendencia. Actualmente UNICA TERAPIA CON ENSAYOS CLINICOS
  • 16. Atendiendo a la metodología aplicada • In vivo: El material genético es introducido mediante vectores directamente en las células diana del individuo a través del torrente circulatorio. No hay extracción previa ni manipulación in vitro. • In situ: La modificación genética de las células del paciente se realiza introduciendo el ADN directamente en el propio órgano defectuoso del individuo (fibrosis quística, distrofia muscular de Duchenne o la supresión de tumores por “suicidio” celular)
  • 17. • Ex vivo: Las células a tratar son previamente extraídas, aisladas y crecidas en cultivo realizando la transferencia génica in vitro. Se devolverán al paciente solo las poblaciones celulares seleccionadas del cultivo en las que se ha comprobado la integración y correcto funcionamiento del transgen. Ej. “Niños Burbuja”
  • 18. Qué metodología elegir  Rasgos fisiológicos del tejido diana  Naturaleza del tejido respecto de los genes a transferir  Facilidad de transferir los genes dentro de las células  La habilidad para llegar al tejido  La respuesta inmune frente al método de transfección
  • 20. Características de elección de un vector • Buena eficiencia en la transferencia génica. • La expresión del transgen sea duradera. Dependerá de el tipo de integración del material génico. • Tamaño del ADN capaz de transducir. Limita mucho el desarrollo de vacunas. • Baja inmunogeneicidad.
  • 21. Marcaje celular Permite identificar y seleccionar in vitro las células diana que hayan incorporado el transgen ó comprobar el grado de transferencia in vivo. Marcaje simple: con gen de resistencia a antibiótico (ej: neomicina) Marcaje doble: cuando se requiera suspender un tratamiento se añade al marcaje simple un gen de selección negativa in vivo. , Ej. enzima Timidina Quinasa del Herpes simple, capaz de fosforilar el Ganciclovir, activando y provocando la muerte de la célula transfectada.
  • 22. Clasificación de vectores Vectores No virales Vectores Virales  Métodos químicos: –fosfato cálcico Retrovirus –Liposomas – Mediados por receptores Adenovirus Métodos físicos –Biolística ó disparo de Herpes virus partículas –Microinyección –Electroporación Virus adenosasociados
  • 23. VECTORES NO VIRALES METODOS QUIMICOS METODOS FISICOS
  • 24.  Primeros vectores desarrollados  ADN exógeno integrado en un plásmido que se mantendrá de manera episómica, independiente del genoma de la célula diana.  Sencillos de producir y más económicos  No tienen limitaciones de tamaño del ADN vehiculizado  Poca toxicidad no inmunogénicos  Baja eficiencia de transducción Algunos solo validos in vitro
  • 25. Métodos Químicos 1.Fosfato cálcico: Los iones Ca 2+ precipitan el ADN provocando su entrada por endocitosis en el interior de la célula  No provoca toxicidad  Expresión transitoria del transgen  Eficacia de transfección del 10%  Utilización sólo en cultivo ex vivo
  • 26. Métodos Químicos 2.Liposomas catiónicos: Bolsas rodeadas de membrana lipídica capaces de interaccionar con los fosfatos del ADN, condensándolo y con las cargas negativas de la membrana celular mediante enlaces electroestáticos.  Libera el ADN en el citoplasma, evitando la degradación lisosomal.  El ADN compactado queda protegido de nucleasas  No tiene límite de tamaño de ADN a transducir  Baja inmunogenicidad In vivo eficacia de transfección disminuida.
  • 27. Métodos Químicos 3.Mediado por receptores : Se insertan partículas que serán reconocidas por receptores presentes en el tipo celular diana. Permite un interacción específica transportador/célula. Se les asocian moléculas “fusiógenas” que actúan al acidificarse el medio desestabilizando la membrana del endosoma evadiendo así la acción lisosomal. Endocitosis endosoma acidificación del interior lisosoma degradación.
  • 28. Métodos Físicos 1.BIOLISTICA ADN situado en gotas de 1-3 micras de oro o tungsteno y aceleradas por gas ó por descarga eléctrica. Fácil manejo. Varias integraciones en un disparo Muerte celular en la zona Capacidad penetración limitada Variable eficacia de la expresión Necesidad de muchas dosis.
  • 29. Métodos Físicos 2. MICROINYECCION ADN introducido en el núcleo de las células gracias a un micromanipulador. Se utiliza frecuentemente en estudios ex vivo  Evita la degradación lisosomal y citoplasmática Alta eficiencia en la expresión  laborioso, necesita células aisladas. Existen células que no sobreviven
  • 30. Técnica del ADN desnudo Inyección directa de la parte codificadora a un tejido. In vivo ADN introducido con una solución salina y administrado intramuscularmente. Se desconoce el mecanismo por el cual entra en la célula. Método directo, simple, económico Baja toxicidad Utilización en Vacunas al alcanzar respuesta inmunológica Baja eficacia transfección. No se integra en el genoma Expresión génica corta (días)
  • 31. Métodos Físicos 3.ELECTROPORACION Apertura de los poros de membrana mediante la aplicación de corriente eléctrica, permitiendo la entrada del gen.  Células pueden ser aisladas y sometidas a control. Selección de las mejores, cultivadas antes de implantarlas al paciente.  Muchas células no soportan el choque eléctrico. Indicado en células con alta tasa de proliferación
  • 32. V I R A L E •RETROVIRUS S •ADENOVIRUS •ADENOASOCIADOS •HERPEXVIRUS
  • 33. Formación de virus defectivos: Eliminación de 1 ó mas genes virales imprescindibles para la replicación y sustitución por el gen terapéutico. Mantendrá la capacidad de infectar pero no la replicación y virulencia. Las secuencias necesarias para la replicación se añaden en células ayudantes que soportan la producción del vector, funcionando en trans.  Vectores más utilizados actualmente.  Elevada eficacia de transfección ( incluso 100%)
  • 34. Limitaciones de su uso: Tamaño del gen terapéutico en función del tamaño del virus. Transferencia y expresión de genes virales Transferencia no deseada del virus nativo Activación de un virus patógeno Activación de un oncogen por recombinación génica con el genoma del huésped Reacción inmunitaria in vivo por muerte de las células modificadas.
  • 36. Características Genoma es ARNss y durante su ciclo vital utiliza la maquinaria replicativa de la célula huésped para lo cual se retrotranscribe a ADNds integrándose en el genoma. Organización del genoma: 10Kb que codifican 3 genes gag: antígenos, proteínas de cápsida y matriz pol: transcriptasa inversa, proteasa e integrasa env: proteínas de la envoltura del virus LTRs: Extremos del genoma (ADN ya) con actividades promotoras y secuencias para la integración.
  • 37. Vector retroviral Virus defectivo para genes de proteínas estructurales, gag, pol y env. Extremos LTRs Secuencia de empaquetamiento Unidad transcripcional con el gen de interés. Línea de células envase: contiene copias integradas de los genes virales pero no la señal de empaquetamiento, permite así el desarrollo del vector.
  • 38. Ventajas e inconvenientes  Estrategia pionera en técnicas ex vivo.  Eficaz transducción.Integra hasta 8 kb tamaño.  Integración y expresión persistente  La mayoría se integran en células que se replican (excepto el VIH), lo cual limita su uso como vector.  Derivación oncogénica por incorporación de protooncogenes ó por mutagénesis insercional activando un oncogen adyacente.  Precaución para asegurar la ausencia de virus de replicación competente.
  • 40. Características Genoma es ADNds lineal. Su ciclo vital requiere la división celular y provoca una infección productiva de células tolerantes durante la cual se acumulan en el núcleo grandes cantidades de virus. Están asociadas con enfermedades benignas en humanos Organización del genoma: 35 Kb con varias unidades de transcripción, proceso que se realiza de manera secuencial. Genes E1 activa otros genes tempranos Genes E2 proteínas involucradas en la replicación ADN Genes E3 funciones para detener mecanismos de defensa Genes E4 funciones regulan la transcripción entre las fases primaria y secundaria del ciclo viral
  • 41. Vector adenoviral Deficientes para replicarse por lo que necesitan un sistema celular de complementación que produzca los elementos E1 que han sido suprimidos. Línea celular humana 293 que aporta las proteínas.
  • 42. Ventajas e inconvenientes  Puede insertar 20Kb  Capaces de transferir el gen en amplia cantidad de células y tejidos  Fáciles de producir en grandes cantidades  Infecta células en reposo ó en división  Expresa varias proteínas virales inmunogénicas, separándose más rápido el vector de las células por la repuesta del hospedador. limitando la duración de la expresión y la capacidad de repetir la dosis
  • 44. Características Genoma ADNs lineal. Virus muy pequeño y simple.. Requiere la coinfección con adenovirus u otros para replicarse. Extendido en humanos pero no asociado a enfermedad conocida. Se integran de manera específica en el cromosoma 19 en ausencia de virus ayudante. Organización del genoma muy simple, solo 2 genes rep: proteinas involucradas en replicación e integración cap: 3 proteínas estructurales Extremos TR
  • 45. Vector AAV Vectores muy simples con solo las secuencias TR. Lleva consigo la introducción de un plásmido que codifica rep y cap para proveer de las funciones de virus ayudante.
  • 46. Ventajas e inconvenientes  Expresión a largo plazo en células que no se dividen.  Estructuralmente simples.  Provocan menor respuesta del hospedador  Tamaño solo de 4 Kb  Transducen células infectadas por Adenovirus  Difíciles de desarrollar en grandes cantidades Se están realizando nuevos VAA que combinen la habilidad de integrarse con mayores fragmentos ADN
  • 48. Características Genoma ADNds lineal. Virus de 100-250Kb.  Gamma: infección latente en células en división, replicándose con la célula y siendo heredado.  Alfa: no pueden mantener la infección latente en células en división. Puede mantenerse de manera episómica indefinidamente en células de larga duración (ej: neuronas sensoriales en HSV) Tropismo específico por el SNC  Beta: desconocimiento de la naturaleza de la infección latente Organización del genoma 2 trozos de ADNds unidos llamados molécula L y molécula S, las cuales se unen por sus secuencias terminales TRL y TRS. Pueden unirse de 4 formas diferentes “isómeros”
  • 49. Vector Herpesvirus Gran variedad en función del tipo de herpes virus. El más conocido es el del herpes simple HSV con los promotores LAT como elementos promesa para dar expresión suficiente en diferentes tipos de neuronas. Los genes virales eliminados se introducen en trans en la célula ayudante.
  • 50. Ventajase inconvenientes  Capaces de llevar grandes secuencias de ADN.  Pueden provocar infección latente de larga duración sin integrarse (episoma). Gran variación dentro de esta familia.  Baja eficiencia transducción  Expresión transitoria del gen.  Gamma: asociados a daños proliferativos, incluso malignidad. Identificar los genes responsables y eliminarlos
  • 51. Sumario CAPITULO III  Estrategias con Ácidos nucleicos Terapia antisentido Reparación génica Ribozimas  Aplicaciones de la terapia génica Enfermedades monogénicas Cáncer VIH  Jurisprudencia y ética en Terapia génica
  • 52. ESTRATEGIAS CON ACIDOS NUCLÉICOS  Terapia antisentido  Reparación génica  Ribozimas
  • 53. TERAPIA ANTISENTIDO Oligonucleótidos complementarios a secuencias específicas de un determinado ARNm (secuencia sentido) bloqueando su traducción mediante la formación de heteroduplex y estimulando la Ribonucleasa H. Se han desarrollado también secuencias antigen “tríplices” que interaccionan con ADN formando triples hélices que bloquean la transcripción..  Potencial terapéutico en enfermedades autoinmunes, el cáncer y el SIDA  Corta vida media en la circulación sistémica  Dificultad para acceder funcionalmente al citoplasma y al núcleo celular. Se cambian grupos fosfato para dejarlos sin carga y que penetren mejor.
  • 56. REPARACIÓN GÉNICA Objetivo: reparar genes alterados por mutación puntual conocida. Método: la activación de los mecanismos celulares de reparación del ADN. Técnica: diseño de oligos específicos para secuencias genómicas adyacentes a la mutación y que llevan un agente capaz de lesionar el ADN
  • 57. RIBOZIMAS ARN con actividad enzimática catalizan reacciones de rotura y ligamiento en lugares específicos de un ARN diana gracias a secuencias guía internas (IGS) que pueden ser variadas cambiando la especificidad del ribozima  Requieren de un metal con carga divalente para la reacción química (ej; Mg 2+ ).  Capaces de cortar las dianas y repetir el ciclo de unión, rotura y disociación.
  • 58. RIBOZIMAS Optimizar la función a nivel intracelular: • Reparto a las células apropiadas: lo más utilizados son los vectores retrovirales y los AAV • Expresión intracelular: elección del promotor • Co-localización con el ARN diana, aumentando la eficacia. •Reciclaje del substrato
  • 62. ENFERMEDADES CANDIDATAS • Amenazar gravemente la vida del paciente • Órganos tejidos y tipos celulares afectados deben estar bien caracterizados. • Versión normal del gen defectuoso ha de estar aislada y clonada. • Gen normal debe poderse introducir en una fracción significativa del tejido afectado ó bien en un tejido accesible que revierta indirectamente en el curso de la enfermedad • Gen debe poder expresarse de manera que genere suficiente proteína normal.
  • 63. Deficiencia de la Adenosin Desaminasa “Niños Burbuja” Disfunción de las células T y B provocando muerte por infección masiva generalizada. Niños con esperanza de vida limitada al carecer de respuesta inmunitaria. 25% de los casos de SCID. Tratamiento actual: transplante medula osea de donante HLA idéntico, lo cual reduce mucho las posibilidades y además la operación tiene una alta mortandad. También inyecciones con ADA sintética. Terapia Génica: introducción del gen ADA normal por transfección con vector retroviral en linfocitos T aislados del paciente Problemas: resultados variables y posible mutagénesis
  • 64. FIBROSIS QUISTICA Gen de la FQ es el CF ADNc del gen de la conductancia transmembrana CFTR construido y clonado en vector retroviral. Células CF- eran infectadas y seleccionadas posteriormente por un gen de resistencia. Las células transfectadas adicionando estimulador de la adenilato ciclasa expresaban el gen, detectándose funcionamiento de los canales de Cloro La terapia génica de la FQ es también realizada mediante métodos químicos con liposomas catiónicos que llevan el gen CFTR.
  • 65. DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHEME Mioblastos individuales “células satélite”capaces de fusionarse con otras para la regeneración muscular. Ideal como vector. Se logró un ADNc del gen de la distrofina y se clonó en un vector retroviral, con el cual se transfectaron las células. Comprobaron por anticuerpos que se producía la molécula correcta y se localizaba en la membrana celular. Queda mucho para que tenga aplicación clínica
  • 66. HEPATOCITOS Enfermedades metabólicas hereditarias como la Hipercolesterolemia familiar y Hemofilia afectan a este tejido por lo que se han desarrollado técnicas a partir de aislar y cultivar hepatocitos. Hipercolesterolemia provocada por la mutación en el receptor de la lipoproteína de baja densidad LDLR
  • 67. HEMOFILIA B Inyección de un AAV que contiene el gen que codifica para el factor IX. Se suspendió el tratamiento en mayo de 2004 por tener resultados aislados en pocos pacientes. PARKINSON Inyección de un AAV con el gen que codifica el enzima GAD en el cerebro de pacientes afectados. Produce estimulación del ácido GABA Primer experimento de la fase clínica en esta enfermedad, comenzó en agosto 2003. HEMOFILIA A Inyección con células del pacientes una vez transformadas in vitro con un plásmido que contiene el gen que codifica para el factor VIII plasmático. Los pacientes mostraron una modesta mejora.
  • 68. DIABETES AAV transformado con el un cDNA que codifica para insulina sintética. Se añade un promotor, activo únicamente en células del hígado, y que estimule por la presencia de glucosa. También se ha adicionó un “enhancer” aumentando la expresión y una señal que permita que la insulina sea secretada al medio. ESCLEROSIS LATERAL AMIOTROFICA Enfermedad con degeneración en las neuronas motoras. Experimentos en ratones portadores del gen humano mutado de la enzima superóxido dismutasa. Transfectados con AAV mostraron una menor destrucción de las neuronas.
  • 69. FIBROBLASTOS DE PIEL Vehículos para transferir genes. Se obtienen fácilmente, crecen in vitro y son infectados por vectores retrovirales. Mucopolisacaridosis (enfermedad hereditaria caracterizada por deficiencia de enzimas lisosomales). Enfermedad de Gaucher (deficiencia del enzima glucocerebrosidasa) Deficiencia de Adenosin desaminasa Hemofilia B: causada por déficit del factor IX plasmático.
  • 70. Células hematopoyéticas Células madre medulares que dan lugar a todas las células hematopoyéticas, utilizadas como vector para transportar genes al paciente. Fáciles de obtener Crecer bien in vitro Soportar la infección retroviral Fácil de devolver al paciente Continuar viva varios meses Dificultades: bajo nivel de expresión del gen introducido
  • 71. Clonación del producto terapéutico Proteínas Humanas clonadas en cultivos celulares de bacterias y levaduras y crecidas in vitro las seleccionadas con el transgen .  Insulina (para la diabetes)  Factor VIII (para hemofilia A)  Factor IX (Hemofilia B)  Hormona de crecimiento GH  Eritropoyetina ( para tratar la anemia)  Interferones e Interleukinas distintas  Adenosin desaminasa (tratar la inmunodeficiencia severa combinada)  Angiostatina y Endostatina (drogas contra el cáncer)……...
  • 73. Estrategias Sustitución de oncosupresores defectuosos Inhibición de la expresión de oncogenes por terapia antisentido Inserción de vectores suicidas. Adenovirus oncolíticos Inmunotoxinas Vacunas tumorales: Aumenta la immugenicidad del tumor introduciendo antígenos foráneos Aumentar la actividad antitumoral de células inmunes por medio de Citoquinas.
  • 74. SUSTITUCIÓN DE ONCOSUPRESORES Oncosupresor: Gen que actúa inhibiendo la proliferación celular y cuya pérdida puede implicar la génesis tumoral. Los más conocidos: rb, p53, dcc,fap,nf1,nf2,wt1 y p16 Terapia genética mediada por vector retroviral que lleve la copia intacta del oncosupresor. Eficacia mejorada al introducir en el tumor varios oncogenes y oncosupresores a la vez, que corrijan las alteraciones acumuladas
  • 75. INHIBICION DE ONCOGENES Oncogenes: genes capaces de producir transformación maligna al expresarse inadecuadamente por una mutación o ampliación Protooncogenes: genes normales con importante papel en la proliferación y diferenciación celular y susceptibles de mutación convirtiéndose en oncogenes. Más de 50 identificados actualmente. Terapia génica antisentido para regular su expresión bloqueando la formación de las proteínas. Éxito in vitro en varios oncogenes, comprobando en animales la desaparición de tumores sin recidivas ni secuelas.
  • 76. INSERCION DE VECTORES SUICIDAS Virus defectivos cuyos genes han sido sustituidos por un gen de selección (neomicina) y otro capaz de inducir su propia muerte (tk de herpes virus). En ratas se ha constatado la muerte de las células tumorales infectadas con retrovirus defectivos al administrar ganciclovir. Humanos: se encuentra en fase de ensayo clínico en tumores cerebrales produciendo, en algunos casos la disminución del tumor. Actualmente se trabajan con promotores específicos de tumor para evitar la muerte de células no tumorales.
  • 77. INMUNOTOXINAS “BOMBAS BIOLÓGICAS” ó balas mágicas: Acoplar anticuerpos tumorales específicos a toxinas mortales actuando como proyectiles dirigidos a células cancerosas. El anticuerpo monoclonal da especificidad al estar dirigidos contra un parte especifica de la proteína.  Requisitos de la inmunotoxina: Antígeno en la superficie celular; receptores y carbohidratos de membrana Penetración eficaz del complejo antígeno - anticuerpo en el citoplasma celular Que reconozcan las formas mutadas pero no las normales, o por lo menos se expresen menos en estas.
  • 78. INMUNOTOXINAS Las toxinas más utilizadas son: Ricina T. Diftérica y exotoxinas de Pseudomonas. Su modo de acción es inhibir la síntesis protéica a nivel ribosomal. Efecto antitumoral más rápido que el desarrollo de la respuesta inmunológica.  No llegan a todas las células cancerosas, sobre todo en tumores sólidos.  Pueden reaccionar con cualquier célula provocando toxicidad no específica.
  • 79. VACUNAS Moléculas con capacidad para provocar respuesta inmune frente a antígenos propios específicos de tejido. 2 tipos de antígenos reconocidos por células T citotóxicas:  Proteínas aberrantes de los oncogenes exclusivas de células tumorales y diferentes a las de protooncogenes.  Productos de genes embrionarios que no se expresan en células adultas. Primeros tratamientos con pequeña respuesta.
  • 80. LINFOCITOS MODIFICADOS Linfocitos infiltrantes en tejidos (TILs): se infiltran en tumores siendo capaces de matar células tumorales al administrarlos con el factor de crecimiento Interleukina 2. Estrategia terapéutica ex vivo, introducidos en células aisladas de tumor, transfectadas por vector retroviral y marcadas con resistencia a neomicina para comprobar el grado de eficiencia. El porcentaje de eficiencia en la transferencia y la pérdida posterior de los linfocitos modificados hacen necesarias más pruebas.
  • 83. OBJETIVOS  Protección de las células no infectadas  Destrucción de las células infectadas  Reducción de la infección en pacientes  Evitar la propagación
  • 84. ESTRATEGIAS I. Estimular sistema inmune al transferir un gen del virus. II. Introducir genes inhibidores de la replicación vírica (interferón). III. Transferir genes de proteínas víricas mutantes que compiten con las normales dificultando el ensamblaje ó la replicación. IV. Secuestro de proteínas víricas reguladoras por señuelos de ARN, evita que se unan a sus puntos de acción. V. Terapia antisentido: Ribozimas y Oligonucleótidos VI. Introducción de anticuerpos frente a proteínas del VIH, inmunización intracelular.
  • 85. Estimulación del sistema inmune Vacunas génicas mediante la expresión de proteína viral por inyección directa de ADN plasmídico que lleva genes virales. Problema: elevada tasa de mutación que le permite escapar de la respuesta inmune.
  • 86. Inhibición por Interferones ADNs copia de interferones insertados en vectores y transfectadas células diana. Provoca la inducción de algunas proteínas celulares que interactúan con estructuras virales inhibiendo la expresión de proteínas víricas necesarias para la replicación
  • 87. TERAPIA ANTISENTIDO Oligonucleótidos: ARN antisentido vehiculizado por un AAV produce reducción de más de un 90% de la replicación. Necesitan estar en un numero muy elevado. Ribozimas: ARN que cataliza ARN viral, son expresados establemente en células pudiendo inhibir la replicación. No necesitan tanta cantidad porque los ribozimas se regeneran.
  • 88. Interrumpir procesos virales  Modificación de la molécula CD4 no pudiendo infectar la célula.  Introducir proteínas mutantes  Secuestro de proteínas por señales de retención del retículo plasmático.
  • 89. JURISPRUDENCIA Y ETICA EN LA TERAPIA GÉNICA
  • 90. LEGISLACION • Ley de 28 de diciembre de 1988: prohibiciones y sanciones sobre clonación y utilización de embriones y fetos humanos. • Artículos 159 al 162 del código penal de 1995. El 159 protege la integridad de la especie su desarrollo. El 161 defiende la intangibilidad del patrimonio genético humano y la identidad genética de los ciudadanos. • Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida: admite la terapia génica en línea germinal (embriones y fetos en el útero) solo si cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de una enfermedad en los que la terapia sea posible científicamente y no se influya en los rasgos hereditarios no patológicos ni se busque selección de individuos.
  • 91. LEGISLACION • Ley sobre Técnicas de Reproducción Asistida: El gobierno del PP el año pasado delimitó el uso de embriones destinados a investigación a los congelados antes del 2003 y también el número de embriones susceptibles de implantación en el útero. Actualmente se está llevando a cabo por el gobierno socialista una nueva reforma que permitirá además de la investigación de los embriones sobrantes la selección preimplantaciónal de un determinado embrión frente a otro con el fin de obtener un fin terapéutico a un tercero (ej: un hermano con enfermedad hereditaria que podrá ser transplantado con medula ó cordón umbilical del futuro niño).
  • 92. LEGISLACION • Declaración de l a UNESCO sobre genoma Humano y derechos Humanos (199 art. 24 invita a identificar aquellas prácticas contrarias a la dignidad humana en clara alusión a la TG germinal. •Convenio Europeo de Bioética 1997. Art 13: únicamente podrá realizarse intervenciones que tengan como objeto modificar el genoma humano por razones preventivas, diagnósticas ó terapéuticas siempre que no tengan como finalidad la introducción de una modificación en el genoma de la descendencia. •Parlamento Europeo y del Consejo (1998) Art. 6.2b se considera no patentables los procedimientos de modificación de identidad genética germinal del ser humano.
  • 93. ETICA El fin ultimo de la terapia es obtener un beneficio para el paciente, intentando que lleve una vida normal. Hay peligros potenciales derivados de la técnica y peligros de índole menos noble y más humana. En cuanto a la técnica empleada: Posibilidad de despertar alelos defectivos y genes reprimidos que conlleven incluso mortalidad. Reacciones inmunológicas contra una proteína nueva provocando incluso la muerte. Seguridad de evitar que los vectores vuelvan a ser virus de replicación competente. ¿Están realmente bajo nuestro dominio seres con alta capacidad de mutación?
  • 94. ETICA Riesgo de la Terapia en línea germinal: cualquier modificación se transmite, nuestros descendientes serían genéticamente distintos. El desafío a la ley natural de selección cribando los más adaptados es una puerta al juego, cuanto menos peligroso, de provocar ventajas adaptativas que mejorasen la especie, bajo excusas nobles de salvar vidas. Hay que pensar siempre en las consecuencias posibles de todas las terapias que se administran, y en este caso especialmente porque pueden influir a toda una especie. Por otra parte el negocio de la salud y la búsqueda de los beneficios de todos estos avances hace al hombre más peligroso que muchos virus, olvidando que la salud es un derecho de todos.