Este documento presenta información sobre plantas transgénicas. Explica los métodos de transformación vegetal basados en vectores biológicos como Agrobacterium tumefaciens y métodos de transferencia directa de ADN como la biobalística. También describe el esquema general de producción de una planta transgénica y los sistemas de selección e identificación de plantas transformadas.

1. Bioquímica Aplicada
Junio 2010
Las plantas transgénicas
Juan Pablo Allocati
Cátedra de Bioquímica
Facultad de Agronomía
Universidad de Buenos Aires

2. Resumen
Manipulación genética de organismos
Esquema de Producción de una planta
transgénica
Sistemas de transferencia genética en plantas
Basados en vectores biológicos
Biología de Agrobacterium tumefaciens
Vectores basados en el plásmido Ti
Genes reporteros
Basados en la transferencia directa de ADN
Transformación por biobalística
Transformación con whiskers de carburo de silicio
Referencias bibliográficas
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

3. Manipulación El hombre a manipulado los organismos vivos desde hace
genética de mucho tiempo
organismos
Mejoramiento genético de plantas desde hace 10.000 años
Mejoramiento genético de animales hace 5.000 años.
Mejoramiento de caninos hace 4.000 años
La producción de organismos transgénicos para uso médico
es aceptada
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

4. Manipulación ¿Qué son los organismos Transgénicos o
genética de genéticamente manipulados?
organismos
Los organismos transgénicos son aquellos a los que se les ha
introducido material genético propio o extraño por métodos de
laboratorio que involucran el uso de técnicas de DNA
recombinante
La información hereditaria (genes)de todos los seres vivos es
químicamente idéntica (DNA) y funcionalmente muy parecida.
Muchos genes son compartidos entre bacterias, plantas y animales
incluyendo el ser humano.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

5. Esquema de Plantas
transgénicas
producción de fértiles
una planta
transgénica Plantas
Maduración Maduras
Polinización
Rustificación
Embriones
Semillas
inmaduros
Plántulas
Proliferación
Enraizamiento
de células
Brotes Callos
regenerados
Selección
Bioquímica Aplicada Regeneración
Introducción
Callos de ADN
Plantas transgénicas seleccionados
Transformación Vegetal

6. Esquema de Las semillas de una
producción de planta modificada
una planta heredan de manera
estable la nueva
transgénica característica de
sus padres
Los genes introducidos se transmiten a través de las semillas
Bioquímica Aplicada de generación en generación como cualquier otra
característica (gen) de la plantas
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

7. Sistemas de
transformación
Basados en vectores biológicos
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

8. Sistemas de ¿De dónde surge la tecnología para producir plantas
transformación transgénicas?
basados en Surge del estudio de una bacteria del suelo, llamada Agrobacterium
A. tumefaciens tumefaciens, que de manera natural y hace muchos millones de años
modifica genéticamente las células de las plantas.
(vector Esta bacteria existe en los suelos de todo el mundo y ha sido estudiada
biológico) desde finales del siglo XIX
El ADN bacteriano se integra al genoma
de la planta y se expresa
La bacteria se pone
en contacto con la
planta a través de
heridas y transfiere
ADN
Célula vegetal infectada
Agalla de la corona
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal Proliferación celular

9. Sistemas de Agrobacterium: Uno de los primeros ingenieros
transformación genéticos de la naturaleza
basados en
A. tumefaciens
Esta bacteria modifica el
genoma de las células
vegetales
transfiriéndoles genes
que las obliga a
reproducirse y proveerla
de alimento
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

10. Transformación
de cotiledones
de soja mediante
co-cultivo con
A. tumefaciens
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas .
Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003
Transformación Vegetal

11. Transformación
de Arabidopsis
thaliana por
infiltración floral
con
Agrobacterium
tumefaciens
Bioquímica Aplicada
Tomado de: Bent, Plant physiology, 2001.
Las plantas florecidas se sumergen en un cultivo
Plantas transgénicas
de Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas
Transformación Vegetal
y se germinan en un medio con agente selector.

12. Tiempos
estimados para
un protocolo de Co-cultivar discos de hojas con Agrobacterium
transformación
1-2 días
estándar
Lavar los discos de hojas
Tratar con antibiótico para eliminar al
Agrobacterium y seleccionar las células
vegetales transformadas
2-4 semanas
Transpasar los discos de hojas sobrevivientes
a medio fresco de selección / regeneración
6-10 semanas
Enraizar las plántulas en selección
Bioquímica Aplicada 4-6 semanas
Rusticar las plantas transgénicas
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal Tiempo total en cultivo: 12-20 semanas

13. Transformación
con A.
tumefaciens por
infiltración al
vacío
La técnica es:
Rápida: la proteína recombinante puede
obtenerse en aproximadamente una semana.
Eficiente: alta eficiencia de transformación;
acumulación de proteína comparable con la de
Bioquímica Aplicada plantas transgénicas (hasta 40 mg/kg de hoja).
Simple: sólo se requiere equipamiento básico.
Plantas transgénicas
Flexible: puede utilizarse para producir proteínas
Transformación Vegetal de membrana, enzimas o virus quiméricos, o para
ensayar promotores

14. Expresión del
gen uidA en
plantas de maíz
Control sin
transformar, c/Bi
c/Bi
Bioquímica Aplicada
Seguimiento de la transformación de embriones de maíz
Plantas transgénicas y regeneración de una planta transgénica mediante transformados en
la reacción histoquímica de la enzima β-glucuronidasa. medio selectivo
Transformación Vegetal

15. Sistemas de
transformación
Basados en la transferencia directa de ADN
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

16. Sistemas de • Ventajas
transferencia
directa de ADN - Son considerados sistemas universales porque, al no
depender de organismos vectores, pueden aplicarse
a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector
de los tejidos o plantas transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias
truncas del transgén y del vector en varios sitios del
Bioquímica Aplicada
genoma de las células transformadas
Plantas transgénicas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de
Transformación Vegetal re-arreglos en los transgenes

17. Las técnicas de
biobalistica Bombardeo de micropartículas
fueron
1984. Sandford et al., describen la técnica de
desarrolladas en bombardeo de micropartículas para la transferencia
los años 80. directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
M e ca n is m o d e disp a ro d e u n cañ ó n im p u ls a d o
Transformación Vegetal
p o r H e a a lta p re s ió n (P DS 1 00 0 /H e )

18. Las técnicas de
biobalistica
fueron
desarrolladas en
los años 80.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

19. La • Parámetros físicos y químicos que influyen
transformación en la transferencia del ADN
por biobalística - Método de aceleración de las micropartículas
depende de
diversos - Naturaleza química y física, densidad y volumen
parámetros. de las micropartículas
- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración
del ADN
- Vacío y distancias de bombardeo
- Diámetro de apertura de la placa de retención
- Número de bombardeos
• Parámetros relacionados con la construcción
Bioquímica Aplicada
genética utilizada
Plantas transgénicas - Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
Transformación Vegetal genes marcadores de selección

20. La • Parámetros relacionados con el tejido o células
transformación blanco
por biobalística
- Genotipo de la planta a utilizar
depende de
diversos - Tipo y capacidad de regeneración in vitro de los explantos
parámetros.
- Preparación y condiciones de cultivo de los explantos
pre- y post-bombardeo
- Requerimientos de temperatura, fotoperíodo y humedad
de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado
Respuesta de los genotipos a la transformación
Respuesta de los genotipos a la transformación
pAct1D+pAcH1 pDMC208+pAcH1
400
350
300
250
puntos azules
Bioquímica Aplicada por disparo
200
150
100
50
Plantas transgénicas 0
BLS14 HL22
Transformación Vegetal genotipos

21. Transformación A B C
con Whiskers de
carburo de
silicio.
Nanobiotecnología
D E F
Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant Cell
Reports, 2000.
A: suspensiones celulares de maíz penetradas por fibras de carburo de silicio (0,3-0,6 m por 10-
Bioquímica Aplicada 100 m) recubiertas de ADN (transformación)
B: expresión transitoria del gen uidA luego de la transformación
C: callos resistentes a fosfinotricina
Plantas transgénicas
D y E: inflorescencia y fruto de una planta transgénica R0
Transformación Vegetal F: ensayos de resistencia a fosfinotricina con plantas R1 dos semanas después del tratamiento

22. ¿Transferencia
directa de ADN
versus
Agrobacterium
tumefaciens?
Vs.
Bioquímica Aplicada
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal

23. Bibliografía
1. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformation of plants: biology
and biotechnology.Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154, 2006.
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in Biotechnology, 21:95-98, 2003.
3. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the
"Gene-Jockeying" tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:16-37,
2003.
4. Bent, A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects
for transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540-1547, 2000.
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6. Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon. United
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IL)
7. Estudio del comportamiento en cultivo in vitro de líneas de maíz flint: competencia
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Investigaciones Biotecnológicas – Universidad Nacional de General San Martín.
8. Transformation of Maize Using Silicon Carbide Whiskers. Jim M. Dunwell. Feb-15-
1999; DOI:10.1385/1-59259-583-9:375. Springer Protocols.
9. “Enhancing cytosolic ADP-glucose synthesizing sucrose synthase activity in
Bioquímica Aplicada transgenic potato tubers results in increased starch content.” Baroja-Fernandez,
Edurne , Muñoz, Francisco Jose , Moran-Zorzano, Maria Teresa, Allocati, Juan
Pablo, Etxeberria, Ed , Alonso-Casajus, Nora, Pozueta-Romero, Javier . Botany
and Plant Biology 2007. July 7-11, 2007 * Hilton Chicago * Chicago, Illinois.
Plantas transgénicas
Transformación Vegetal