REACCION EN CADENA POLIMERASA

1. [PCR]
PCR
DEFINICION
DEFINICION
CONT
REQUISITOS
DE PCR
ADN
MOLD
E
PRIMERS
TAQ
POLIMERASA
MG
d
N
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2. Biología Molecular
Bioq. Jans Velarde Negrete

3. Es una técnica desarrollada por el biólogo Kary Mullis, diseñada para
amplificar de forma directa una región específica de DNA o indirecta de un
ARN a través de su ADN complementario. Al producto final obtenido de la
amplificación se lo denomina Amplicón.
Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.

4. La PCR es una reacción en cadena porque el número de cadenas nuevas de
DNA se dobla a cada ciclo, y las nuevas cadenas, junto con las viejas, sirven
de molde para el siguiente ciclo.

5.  DNA molde.
 Primers o cebadores.
 Enzima DNA polimerasa.
 Mg ++
 Agua libre de nucleasas.
 Solución buffer.
 dNTPs (dATP; dCTP; dTTP; dGTP)
 Termociclador.

6.  El ADN molde puede ser de cadena sencilla o doble,
circular o lineal. En caso de desear amplificar una
secuencia de ARN se debe utilizar primeramente una
transcriptasa reversa.
 El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000
nucleótidos de longitud.
 No necesariamente puro, pero libre de altas
concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar
como quelantes.
 La cantidad de ADN molde a utilizar depende de la
muestra de partida. Demasiada cantidad de ADN puede
inhibir la reacción de PCR.

7.  Longitud de la región complementaria al ADN molde de entre 18-25pb.
 Deben ser específicos.
 No deben presentar auto-complementariedad.
 No deben ser complementarios entre ellos.
 El contenido de G+C debe estar entre el 40-60%.
5´
5´
3´
3´
Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as)

8.  Taq ADN polimerasa es aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas
termales).
 Incorporan dNTPs por complementariedad en una cadena que sirve de
molde.
 Necesitan la presencia de Mg para funcionar.

9.  Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas
 La concentración de MgCl influye directamente en la actividad de la
polimerasa, y es uno de los parámetros a ajustar:
 Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el
rendimiento de la reacción
 Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 %
complementarios, afectando la especificidad y el rendimiento de la
reacción

10.  Generalmente se utilizan concentraciones equimolares de los 4 dNTPs
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) en concentraciones que varían entre 200 –
250 μM de c/u.
 No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén formando
complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la
enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto
final

11.  El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl.
 pH 8.3 es el óptimo para Taq.
 El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual
es enzimáticamente activa.

12.  Un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de
los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.

13.  Desnaturalización.
 Hibridación.
 Elongación.

14.  Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra
sencilla.

15.  Los “primers”, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares específicos por complementariedad de bases.

16.  Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, y coloca nucleótidos de
5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde

18.  La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante
electroforesis.
 Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que
deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a
distintas concentraciones.
 La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio
(lámpara de luz UV).
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)

19.  PCR-semicuantitativa
 PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo real)
 RT-PCR
 PCR-multiplex.
 PCR-anidada.
 PCR-aleloespecífica.
 PCR-mutagénesis dirigida

20.  Rastreo de mutaciones.
 Diagnóstico de enfermedades.
 Detección de organismos infecciosos.
 Medicina forense y determinación de paternidad.
 Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en Tiempo Real)
 Polimorfismo de secuencia.

21.  La PCR es rápida, y puede realizarse en unas pocas horas, en vez de
días, en comparación con la clonación basada en células.
 El diseño de los primers para la PCR se hace automáticamente con un
programa de ordenado, y la síntesis comercial de oligonucleótidos
también es rápida y económica.
 Es muy sensible y, amplifica secuencias específicas de DNA a partir de
pequeñas muestras de DNA prácticamente indetectables.
 También se pueden usar muestras de DNA que están parcialmente
degradadas, que se encuentran mezcladas con otros materiales, o que
están incluida en un medio (como el ámbar), lo que sería díficil o
imposible con las técnicas de clonación convencional.

22.  Se debe disponer de alguna información sobre la secuencia de
nucleótidos del DNA diana, y cualquier contaminación de la muestra con
DNA de otras fuentes, por pequeña que sea, puede causar problemas.
 Por ejemplo, células desprendidas de la piel del investigador pueden
contaminar las muestras recogidas del escenario de un crimen o tomadas
de un fósil, lo que dificulta la obtención de resultados precisos.
 Las PCR siempre deben realizarse con controles adecuados
cuidadosamente diseñados.

23.  http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml
http://www.slideshare.net/rild27/reaccin-en-cadena-de-la-polimerasa
 http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/PCR.p
df
 http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
 http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%
B3n6.pdf