 MODULO    I°: MetODOs De                 estUDIOs           teCNICAs HIstOLOGICAs:   DEFINICION:       Es  el conjunto...
METODOS HISTOLOGICOS:1-Examen inmediato o in vivo: a) En fresco: animales unicelulares y células    libres. b) Coloración ...
PAsOs De LA teCNICA:1- Obtención del material:Pueden provenir de:  * biopsias quirúrgicas  * material obtenido de necropsi...
2- FIjACIóN:Es el proceso Físico (Histoquímico) que logra una situación estable de losconstituyentes tisulares, interrumpi...
Cualidades de un buen fijador:1) Actuar con rapidez y detener  los procesos autolíticos.3) Buen poder de penetración.4) Co...
CLAsIFICACIóN De LOs FIjADOres:1- Fijadores químicos: son los más empleados y pueden ser:   a) Simples: constituido por un...
Mecanismo de acción de los fijadores:• Por coagulación de las proteínas, sin   combinarse con ellas: alcohol, formol, ácid...
3- INCLUsIóN        Es impregnar la pieza con una sustancia que le confiere dureza y permiteobtener cortes uniformes y del...
c) Impregnación en parafina:    Es la inclusión propiamente dicha.d) Confección del taco:                      Es la inclu...
4- ObteNCIóN DeL COrte:Para obtener cortes finos se utilizan aparatosdenominados micrótomos, hay varios tipos.
Tipo Minot: (Mas Usados) dispone de 4 posiciones de  ajuste, según el corte sea de 1-10 µm, 11-20 µm, 21-30  µm o 31-40 µm...
Montaje del corte:Se colocan sobre una platina con agua caliente. Luego se levantan loscortes con un portaobjeto, se extie...
5 COLOrACION:Los colorantes se pueden clasificar de diferente manera:1-Colorantes naturales:  a) animales: carmín.  b) veg...
Técnica de la hematoxilina y eosina:Hematoxilina:Es un colorante nuclear, esta cargado positivamente por lo tanto esun col...
Los pasos de la coloración son:       a) Desparafinización:          b) Hidratación: c) Coloración propiamente dicha:
6) Montaje final          Las fases del montaje final son:d) Deshidratación: mediante la acción de alcoholes de   gradació...
TECNICAS HISTOQUIMICAS:Son técnicas utilizadas para determinar la presencia y localización de elementos   químicos en el t...
MICROSCOPIO Microscopio simple: o lupa, consta de una sola  lente y se utiliza en materiales vivos Microscopio compuesto...
Descripción del  microscopioConsta de dos partes  fundamentales:1- Parte óptica:• Ocular.• Objetivo.• Sist. De inluminacio...
OcularEs cilindro hueco metálico, provisto de una lente o un  sistema de lentes convergentes, cuya finalidad es  aumentar ...
ObjetivoEs la parte masimportante de unmicroscopio.Consta de varioslentes, que actúanen conjunto comosi fuera uno solo,tra...
Aparatos deiluminaciónSon:1- el espejo.2- elcondensador.3- el diafragma-iris.
Parte mecánica:Tambiéndenominadoestativo o monturadel microscopio.Se compone delas siguientespartes:1- Pie.2- Tubo..3- Col...
Mecanismo de movimiento:Para facilitar eldesplazamiento deltubo y lograr unenfoque correcto,estan provistos deun dispositi...
MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO1) Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platinacompletamente...
TECNICA DE MICROSCOPIA ELECTRONICA:1- Utilizar fragmentos de menos de 1mm.2- Proceder más rápidamente a la fijación, con t...
Diferentes tipos de Microscopios                1) Microscopio Electronico Es el instrumento que por su alto poder de res...
11) Los instrumentos modernos permiten    aumentos de más de 160.000 veces,    que     mediante       amplificaciones    f...
Microscopio de fluorescenciaCon este microscopio la observación se realiza conluz ultravioleta, y los componentes se recon...
OTROS TIPOS DE         MICROSCOPIOS Ultramicroscopio. Microscopio de contraste de fase. Microscopio de interferencia. ...
Unidades de medida en microscopiaDenominación:  Antigua            Actual                       Valormicrón o micra       ...
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  1. 1.  MODULO I°: MetODOs De estUDIOs  teCNICAs HIstOLOGICAs: DEFINICION: Es el conjunto de operaciones que se somete un material organizado para hacer posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observación de las estructuras no visibles al ojo humano.
  2. 2. METODOS HISTOLOGICOS:1-Examen inmediato o in vivo: a) En fresco: animales unicelulares y células libres. b) Coloración vital: usando soluciones de colorantes no tóxicos (colorantes vitales), coloración intravital o in vivo, y la coloración supravital, donde pueden colorearse células libres o porciones de órganos.2- Examen mediato o post-morten: Requiere de la muerte celular y supone seguir una serie de pasos, la Técnica histológica
  3. 3. PAsOs De LA teCNICA:1- Obtención del material:Pueden provenir de: * biopsias quirúrgicas * material obtenido de necropsias * utilizando animales de laboratorio * estudios experimentales en animales * material de cultivos de tejidos * frotis o extendidos
  4. 4. 2- FIjACIóN:Es el proceso Físico (Histoquímico) que logra una situación estable de losconstituyentes tisulares, interrumpiendo las reacciones enzimáticas de autólisis.
  5. 5. Cualidades de un buen fijador:1) Actuar con rapidez y detener los procesos autolíticos.3) Buen poder de penetración.4) Conservar lo mas fielmente la estructura del tejido.4) No interferir y facilitar los procesos posteriores.5) Endurecer el tejido y darle mayor consistencia.6) Insolubilizar los componentes de los tejidos.7) No producir estructuras artificiales.
  6. 6. CLAsIFICACIóN De LOs FIjADOres:1- Fijadores químicos: son los más empleados y pueden ser: a) Simples: constituido por una sola sustancia: Formol al 10%: Es muy usado. Aldehído glutárico o glutaraldehido Acetona en frío. b) Compuestos o mezclas fijadoras: constituidas por variassustancias. Liquido de Flemming: (mezcla cromo-osmio-acética) para estudioscitológicos. Liquido de Bouin: (mezcla picro-formol-acética). El mejor fijador para lostrabajos corrientes. Muy penetrante.2- Fijadores físicos: Desecación: Calor seco: Calor húmedo: Frío: Congelación y desecación: (Método de Altmann-Gersh)
  7. 7. Mecanismo de acción de los fijadores:• Por coagulación de las proteínas, sin combinarse con ellas: alcohol, formol, ácido Pícrico, etc.• Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas: ácido crómico, bicromato de potasio, de amoniaco, etc.c) Por reducción, al contacto con las sustancias orgánicas formando un precipitado fino: ácido ósmico, bicloruro de mercurio.d) Por oxidación: bicromato de potasio.
  8. 8. 3- INCLUsIóN Es impregnar la pieza con una sustancia que le confiere dureza y permiteobtener cortes uniformes y delgados. En la técnica corriente, se utiliza la parafina; que es insoluble en agua,está condicionada por la extracción de toda el agua del material a incluir. Lospasos de la inclusión son los siguientes:
  9. 9. c) Impregnación en parafina: Es la inclusión propiamente dicha.d) Confección del taco: Es la inclusióndefinitiva del trozo de tejido. Se utiliza un molde metálicoespecial denominado barras de Leuckart, donde se vierteparafina liquida (60°C).
  10. 10. 4- ObteNCIóN DeL COrte:Para obtener cortes finos se utilizan aparatosdenominados micrótomos, hay varios tipos.
  11. 11. Tipo Minot: (Mas Usados) dispone de 4 posiciones de ajuste, según el corte sea de 1-10 µm, 11-20 µm, 21-30 µm o 31-40 µm así como ajuste del ángulo de la cuchilla graduado, inmovilización de la rueda y mecanismo de avance de gran precisión
  12. 12. Montaje del corte:Se colocan sobre una platina con agua caliente. Luego se levantan loscortes con un portaobjeto, se extiende sobre una película deAlbúmina de Mayer, que es una mezcla de partes iguales dealbúmina de huevo, glicerina con un cristal de timol. Losportaobjetos con los cortes adheridos se llevan a la estufa.
  13. 13. 5 COLOrACION:Los colorantes se pueden clasificar de diferente manera:1-Colorantes naturales: a) animales: carmín. b) vegetales: hematoxilina, orceina.2-Colorantes artificiales o sintéticos: (colorantes deanilina). a) ácidos: Son colorantes citoplasmáticos. b) básicos: Son colorantes nucleares. c) neutros: Tiñen citoplasma y núcleo de diferente color3-Colorantes indiferentes: no forman sales. Sudan III, rojo escarlata, etc.Sustancias basofilas se tiñen con los colorantes básicosSustancias acidofilas se tiñen con los colorantes ácidosSustancias neutrofilas se tiñen con los colorantes neutros.
  14. 14. Técnica de la hematoxilina y eosina:Hematoxilina:Es un colorante nuclear, esta cargado positivamente por lo tanto esun colorante básico.De origen vegetal (hematoxilom compechianum).Es incoloro y tiene que ser trasformado por oxidación en hemateina,que es el auténtico colorante.Eosina:Es un colorante artificial, débilmente ácido, que pertenece al grupode las fluoresceínas, soluble en agua.Colorea el citoplasma, el tejido conjuntivo y las fibras colágenas deun rosado intenso.
  15. 15. Los pasos de la coloración son: a) Desparafinización: b) Hidratación: c) Coloración propiamente dicha:
  16. 16. 6) Montaje final Las fases del montaje final son:d) Deshidratación: mediante la acción de alcoholes de gradación creciente: 70°, 80°, 90° y 100°, sucesivamente.b) Homogenización o aclaración: se emplea el benzol o xilol a los que se le puede agregar ácido carbónico o fénico para aumentar su eficacia, estos son muy ávidos de agua.c) Colocación del cubreobjeto: con el objeto de proteger el preparado, se la recubre con una laminilla de vidrio de 0,2 mm de espesor, o cubreobjeto. Para adherir el cubreobjeto al portaobjeto, se emplea una resina, el Bálsamo de Canadá.
  17. 17. TECNICAS HISTOQUIMICAS:Son técnicas utilizadas para determinar la presencia y localización de elementos químicos en el tejido mediante ciertos colorantes afines.A-Ácidos nucleicos: Azul de Metileno o de Toluidina y la hematoxilina. La reacción de Feulgen, que es especifica para ADN.B-Hidratos de carbono: se utiliza la Reacción del PAS (ácido peryodico y reactivo de Schiff) y para polisacáridos ácidos el método del Azul de Alcian (Alcian Blue).C-Lípidos: colorantes del tipo Sudan III, el Escarlata R o Sudan IV, el Sudan negro B (Sudan black B).También se pueden determinar ciertas sustancias utilizando las Técnicas inmunohistoquimicas, usando anticuerpos específicos marcados para ciertos elementos puntuales.
  18. 18. MICROSCOPIO Microscopio simple: o lupa, consta de una sola lente y se utiliza en materiales vivos Microscopio compuesto: Llamado así por estar formado por tres tipos de lente: Ocular, Objetivos y el Condensador
  19. 19. Descripción del microscopioConsta de dos partes fundamentales:1- Parte óptica:• Ocular.• Objetivo.• Sist. De inluminacion.2- Parte mecánica:1- Pie.2- Columna.3- Tubo.4- Mecanismo de movimiento.5- Platina.
  20. 20. OcularEs cilindro hueco metálico, provisto de una lente o un sistema de lentes convergentes, cuya finalidad es aumentar la imagen real e invertida enviada por el objetivo. Actúa como una lupa y forma una imagen virtual, significa que se forma del lado del objeto.
  21. 21. ObjetivoEs la parte masimportante de unmicroscopio.Consta de varioslentes, que actúanen conjunto comosi fuera uno solo,tratando decorregir lasllamadasaberraciones deesfericidad ycromática.El objetivo manda al ocular una imagen magnificada, real, einvertida del objeto que observamos, el lado derecho de lapreparación, aparece a la izquierda de la imagen, el lado superiordel preparado, se ve en el lado inferior de la imagen.
  22. 22. Aparatos deiluminaciónSon:1- el espejo.2- elcondensador.3- el diafragma-iris.
  23. 23. Parte mecánica:Tambiéndenominadoestativo o monturadel microscopio.Se compone delas siguientespartes:1- Pie.2- Tubo..3- Columna4- Mecanismo de movimiento.5- Platina.
  24. 24. Mecanismo de movimiento:Para facilitar eldesplazamiento deltubo y lograr unenfoque correcto,estan provistos deun dispositivo detornillos,denominados,sistema demovimiento rápidoy sistema demovimiento lento.
  25. 25. MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO1) Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platinacompletamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, yadebería estar en esas condiciones.2) Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.3) Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.4) Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillomacrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.5) Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele sersuficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiarde objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con elobjetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muypoca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:Incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlocon aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivode inmersión.
  26. 26. TECNICA DE MICROSCOPIA ELECTRONICA:1- Utilizar fragmentos de menos de 1mm.2- Proceder más rápidamente a la fijación, con tetróxido de osmio, aldehído glutárico o glutaraldehido agregando o no ácido tánico.3- Deshidratación.4- Inclusión en resinas epoxi quedan la dureza necesaria para obtener los cortes finos que la observación exige (200 Å a 0,1 micrómetro).5- Cortar con ultramicrotomo de avance muy lento y cuchillas de vidrio o diamante.6- Recepción de los cortes en agua, luego en rejilla de cobre y recubierta por una delgada película plástica, la que será la que sostenga el corte.7- Pase por ácido osmico, acetato de uranilo, sales de plomo, etc.8- Observación en pantalla fluorescente.9- Toma de fotografías y ampliaciones a voluntad.
  27. 27. Diferentes tipos de Microscopios 1) Microscopio Electronico Es el instrumento que por su alto poder de resolución nos permitever y conocer la ultraestructura de la célula.Las lentes son remplazadas por bobinas electromagnéticas.La fuente de energía utilizada, es un haz de electrones. El que segenera calentando un filamento de tungsteno y son acelerados conalto voltaje.Los electrones son invisibles y la imagen que forman se observamediante una pantalla fluorescente o se registra fotográficamente. Serequiere el máximo de delgadez del espécimen para la mejorabsorción de los electrones y para que estos puedan atravesarlos.Los cortes son de 1/40 u (250 A) de espesor, que se logra con elultramicrotomo
  28. 28. 11) Los instrumentos modernos permiten aumentos de más de 160.000 veces, que mediante amplificaciones fotográficas pueden aumentarse más de 1.000.000 de veces.12) Este aparato es el denominado Microscopio Electrónico de Transmisión (MET). Existen microscopios electrónicas de alto voltaje que se usan en metalurgia y también en biología.13) También tenemos el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) o de Scanning, con el que se estudian imágenes tridimensionales ya que la observación se produce sobre la superficie del espécimen.
  29. 29. Microscopio de fluorescenciaCon este microscopio la observación se realiza conluz ultravioleta, y los componentes se reconocenpor la fluorescencia que emiten en el espectrovisible. En la práctica la luz ultravioleta se enfocasobre el espécimen, la luz es absorbida por ciertasestructuras, qua luego la emite dentro de la bandavisible. La radiación emitida por el compuesto,aparece brillante sobre fondo oscuro. Microscopio de luz ultravioletaEmplea luz ultrvioleta en lugar de luz visible. Laimagen se registra en películas fotográficas dadoque la luz ultravioleta es invisible. Posee unaresolución mayor que el microscopio óptico. Se loemplea para estudiar estructuras que posan ácidosnucleicos.
  30. 30. OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS Ultramicroscopio. Microscopio de contraste de fase. Microscopio de interferencia. Microscopio confocal. Microscopio de polarizacion. Microscopio de fuerza atomica.
  31. 31. Unidades de medida en microscopiaDenominación: Antigua Actual Valormicrón o micra micrómetro milésima de milímetro µ µmmilimicra manómetro millonésima de milímetro mµ nmángstrom décima de nanómetro diez millonésima de milímetro Å

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