1. INGENIERIA GENETICA

2. 1.-INTRODUCCIÓN
La utilización de organismos vivos o de sus componentes en la
obtención de productos útiles para las personas es la base de la
biotecnología .Tradicionalmente se utilizaba la fermentación de
microorganismos para obtener productos como el yogur, el pan o el
vino
El paso de la biología tradicional a la moderna surge con las
técnicas que derivan de la ingeniería genética como la tecnología
del ADN recombinante
La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de
técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular
el genoma de un ser vivo.
La ingeniería genética es una técnica que consiste en la
manipulación, modificación e introducción de genes en el genoma
de un individuo que carece de ellos.

3. Los organismos que han sido modificados por ingeniería genética se
denominan transgénicos
La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas,
entre las que destacan:
1.-la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar
y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo
en otro.
Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de
"cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN
recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN
extraño un un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN
vírico en un ADN celular.
2.- Clonación Permite la producción de múltiples copias de un gen
específico o de un fragmento de ADN

4. 3.-La secuenciación del ADN: Técnica que permite
saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman
parte de un gen.
4.- la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con
la que se consigue aumentar el número de copias de un
fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una
mínima cantidad de muestra de ADN, se puede
conseguir toda la que se necesite para un determinado
estudio.
.

5. El conocimiento del genoma de muchos organismos ha provocado la
aparición de nuevas disciplina científicas:
-genómica: rama de la genética que estudia el genoma completo de un
organismo
-Proteómica: Estudia, desde el punto de vista estructural y funcional,
todas las proteínas codificadas por un genoma concreto
-Farmacogenética: Persigue la fabricación de medicamentos
personalizados

6. 2.- TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINNANTE
Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en
cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se
desee :
.Este ADN puede incorporarse a las células de
otros organismos (vegetales, animales,
bacterias...) en los que se podrá "expresar" la
información de dichos genes. (De una manera
muy simple podemos decir que "cortamos"
un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de
una bacteria; si por ejemplo es el gen que
regula la fabricación de insulina, lo que
haríamos al ponérselo a una bacteria es
"obligar" a ésta a que fabrique la insulina).

7. Lo primero que hay que realizar es un corte específico del ADN
en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de
un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que
pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas
se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres,
siendo lo característico de ellas estos dos principios:

8. a) Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica
de nucleótidos(4-8 nucleótidos denominado sitio de restricción) y
corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN
b) Los extremos libres que quedan se
llaman extremos pegajosos, porque
pueden unirse a otros fragmentos de
ADN que hayan sido cortados por la
misma enzima de restricción

9. Estas uniones entre los bordes cohesivos son temporales , pero se
pueden hacer permanentes en presencia de la enzima ADN ligasa
La unión del ADN procedente de dos orígenes distintos produce
una molécula de ADN recombinante
Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas
enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir,
según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la
técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos.
Según donde se hallen las secuencias
de reconocimiento, un gen
determinado puede estar
fragmentado en varios trozos, o bien
un trozo puede contener varios
genes, posibilidades que hay que
confirmar.

10. El segundo paso es la inserción de los fragmentos de ADN. Esta
inserción se realiza en vectores de clonación, que son los agentes
transportadores capaces de introducirlos en las células
hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN
capaces de transportar ADN extraño , que tienen capacidad para
autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Además del origen de
replicación, los vectores de
clonación deben llevar otros
genes denominados marcadores,
que sirven para identificar las
células que contienen el vector
de clonación.

11. Se suelen utilizar como marcadores,
Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar
bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas
bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el
gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que
el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa
característica. Este sistema se emplea cuando la célula
hospedadora es una célula eucariota.

12. Los vectores de clonación más utilizados
a) Plásmidos. Son moléculas de ADN circular bacteriano, con
un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con
independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio
origen de replicación.
La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el
vector de clonación, se realiza por medio ADN-ligasas, que unen
ambos trozos de ADN

13. .b) Virus bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el
gen deseado en un fragmento de ADN vírico Posteriormente se
ensamblarán las distintas partes del virus Así quedará el virus
completo. En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso
de la TRANSDUCCION: proceso en el cual los bacteriófagos
transportan genes bacterianos desde una célula huésped a otra
Son capaces de llevar mayor cantidad de ADN que un plásmido

14. c) Cósmidos: son vectores
híbridos entre el fago λ y un
plásmido , de modo que su
ADN puede replicarse como
un plásmido o empaquetarse
como un fago
D) Otros vectores: Cromosomas artificiales de levaduras, genomas
modificados de adenovirus, retrovirus, cromosomas humanos
artificiales.

15. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que
contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora,
para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve
el gen concreto.
Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula
fundamentalmente.
En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:
a) Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de
bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula
bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio
externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

16. b) Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la
célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de
clonación el genoma del virus.
Para poder realizar la clonación génica, el huésped debe ser:
- De crecimiento rápido y en un medio de cultivo barato
- No ser dañino ni patógeno
- Ser capaz de aceptar ADN exógeno
- Tener las enzimas necesarias para la replicación del vector
Los huéspedes más utilizados son las bacterias Escherichia coli
(Bacillus subtilis y la levadura Saccharomyces cerevisae

17. . Una vez que se ha conseguido la población de bacterias
transformadas, el siguiente paso es poner a las bacterias en un
medio de cultivo apropiado para que se multipliquen. A la vez que
se reproducen las bacterias lo hace también el plásmido con el gen
que interesa, el resultado es que se obtiene un clon de células que
llevan todas ese gen de interés.
Se pueden formar por tanto diferentes clones con genes de interés
para el hombre. Este conjunto de clones se denomina biblioteca
genómica

18. 3.- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un
fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica
pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una
molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas.
La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy
pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una
fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan
como cebadores.
La reacción es un proceso cíclico:
a) La molécula de ADN que va a copiarse se calienta
para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.

19. Las cadenas recién
formadas son
separadas de nuevo
por el calor y
comienza otro nuevo
ciclo de copias. Estos
ciclos se repiten hasta
que se obtiene el
número de copias
deseado
b) Se enfría la mezcla para permitir que los cebadores se unan a cada uno
de los extremos de las hebras del ADN
c) Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza
la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales,
Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

20. APLICACIONES DE LA PCR
Secuenciación
Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la
formación de suficiente cantidad de ADN molde para su
secuenciación. Es mucho mas sencillo y rápido que la
clonación en células.
Estudios evolutivos
Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos
ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos.
Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de
organismos actuales y poder reconstruir árboles filogenéticos.
El PCR también se ha utilizado para conseguir el mapa del
genoma humano.

21. Huellas dactilares del ADN.
Mediante esta técnica es posible comparar muestras
diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo
individuo o no, o si existe parentesco entre ellas.
Esta técnica se aplica actualmente en Medicina forense e
investigaciones policiales, con el fin de identificar
individuos a partir de muestras biológicas, como sangre,
semen, piel o cabellos. También se utiliza en las pruebas de
paternidad.
Diagnósticos prenatales: Utilizando ADN de células
embrionarias

22. 4.- SECUENCIACION DEL ADN
Se realiza con el método didesoxi de Sanger o Método de
terminación de la cadena
Se denomina así porque es necesaria la utilización de los
didesoxirribonucleótidos que son nucleótidos modificados que
han perdido el grupo OH situado en el carbono 3’y que provocan
la parada de la copia del ADN por la ADN polimerasa
Para obtener la secuencia de
bases nitrogenadas de un
segmento de ADN por el
método enzimático de
terminación de cadena, se
necesitan los siguientes
compuestos:

23. El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN
Polimerasa I del bacteriofago T4.
Un cebador o "primer"
Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
A Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP,
ddCTP y ddGTP) marcados con una molécula fluorescente para
cada uno de ellos
El método básicamente consiste en:
1º Se desnaturaliza el ADN que se desea secuenciar
2º Se mezclan todos los componentes de la reacción y se forman
nuevas cadenas de ADN que utilizan como molde la secuencia del
ADN que se quiere secuenciar . La copia continua hasta que por
azar se encuentra con un didesoxi. Al final se obtiene una mezcla
de cadenas de ADN de longitudes variadas

24. 3.- Se separan las cadenas marcadas cuando la mezcla atraviesa un
gel de poliacrilamina, de tal manera que las más cortas se mueven
con mayor rapidez
4.- Se obtiene un espectrograma que nos dará la secuencia de bases
complementaria de la molde

25. 5.- APLICACIONES MEDICAS DE LA INGENIERIA
GENETICA
1.-OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS
Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del
crecimiento, factores de coagulación, etc ... tienen un interés
médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas
proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir
de tejidos o fluidos corporales.
En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN
recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas
humanas en microorganismos adecuados para su fabricación
comercial.
Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene
a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se
clona el gen de la insulina humana.

26. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES
El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de
microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo
potencial.
Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen
actualmente por ingeniería genética. Como la mayoría de los
factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen
de la proteína correspondiente.
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DE ORIGEN GENÉTICO:
Conociendo la secuencia de nucleótidos de un gen responsable de
una cierta anomalía, se puede diagnosticar si este gen anómalo está
presente en un determinado individuo.

27. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES.
(TERAPIA GÉNICA)
Este proceso abre las puertas para luchar contra
enfermedades como el cáncer y diagnosticarlo incluso antes
de que aparezcan los primeros síntomas
La terapia génica se define como técnica terapéutica mediante la
cual se inserta un gen funcional en las células de un paciente
humano para corregir un defecto genético o para dotar a las
células de una nueva función

28. 6.- APLICACIONES EN LA AGRICULTURA
Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las
características de gran cantidad de plantas para hacerlas más
útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las
primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un
tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas
semanas después de haber sido cosechados.
Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular,
lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los
protoplastos son células desprovistas de pared celular, que se
consigue empleando enzimas que destruyen la lámina media y
desorganizan la parte de celulosa).
PLANTAS TRANSGÉNICAS
Entre los principales caracteres que se han transferido a
vegetales, merecen destacarse:

29. •Resistencia a herbicidas, a insectos y a enfermedades
microbianas.
Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a
herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de
Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt)
dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no
pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este
gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas
transgénicas con el gen de la proteina de la cápsida de un virus,
son resistentes a la invasión de dicho virus.
•Incremento del rendimiento fotosintético
Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de
plantas C4 que es más eficiente.
•Mejora en la calidad de los productos agrícolas
Tal es el caso de la colza y la soja transgénicas que producen
aceites modificados, que no contienen los caracteres
indeseables de las plantas comunes.

30. •Síntesis de productos de interés comercial
Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos
animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado
a la fabricación de plásticos biodegradables
•Asimilación de nitrógeno atmosférico
Aunque no hay resultados, se ensaya la
transfección del gen nif responsable de la
nitrogenasa, existente en
microorganismos fijadores de nitrógeno, y
que permitiría a las plantas que
hospedasen dicho gen, crecer sin
necesidad de nitratos o abonos
nitrogenados, aumentando la síntesis de
proteinas de modo espectacular.

31. 7.-APLICACIONES EN ANIMALES
La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño
en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y
afecte a todas las células en los organismos multicelulares.
Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se
introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN
extraño en su genoma, previamente a la primera división , producirán
un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las
siguientes generaciones a través de la linea germinal (gametos).
Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar:
•La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo
embrionario y su regulación.
•Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.
•Estudiar la función de genes específicos.

32. •Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la
producción de proteinas humanas.
•La corrección de errores innatos de metabolismo mediante
terapia génica.
El principio de la clonación está en la obtención de organismos
idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente,
como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueño de muchos
ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades
de algún ejemplar especialmente bueno.
Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:
Por disgregación de células embrionarias .Se basa en el mismo
principio por el que nacen gemelos de forma natural.Se pueden separar
las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el
estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada
puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un
individuo completo.

33. Por TRANSFERENCIA
NUCLEAR. Se toman
células embrionarias en fase
de mórula o blástula,
obtenidas por disgregación,
se cultivan in vitro,y
después se transfieren a
ovocitos a los que se les ha
quitado el núcleo.
Se provoca la fusión de las
dos células animales de
modo que el núcleo de la
célula embrionaria quede en
el interior del ovocito,
pudiendo éste empezar a
funcionar como un zigoto.

34. 8.-APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN EL
MEDIO AMBIENTE
Microorganismos modificados genéticamente están siendo utilizados
para limpiar el medio ambiente de ciertos contaminantes , ya que
tienen la capacidad de transformarlos en sustancias no contaminantes
o de adsorberlos. Su acción se realiza de dos maneras
-Biorremediación : bacterias transgénicas que degradan la materia
orgánica como los hidrocarburos con un gran rendimiento y en
diversas condiciones
-Bioadsorción: Bacterias genéticamente modificadas son capaces de
adsorber ciertos metales pesados que contaminan el suelo

35. 8.-PROYECTO GENOMA HUMANO
El Proyecto Genoma Humano comenzó en 1990 en los Estados
Unidos con un presupuesto de 375.000 millones de pesetas y un plazo
de 15 años, con el objetivo de analizar molecularmente la herencia
genética humana.
Se trata de realizar mapas de cada uno de los cromosomas humanos.
Implica dividir los cromosomas en pequeños fragmentos que puedan
ser caracterizados y posteriormente ordenados en el cromosoma.
Este proyecto supone la realización de dos tipos de mapas:
•Mapas genéticos: Estos mapas simplemente indican la
posición relativa de los diferentes genes. Para esta
confección se están estudiando la transmisión de
caracteres hereditarios, capaces de ser objetivados de una
generación a otra en grandes familias.
En 1994 se terminó el primer mapa genético de todo el
genoma humano.

36. •Mapas físicos: De mayor resolución, pues muestra la secuencia de
nucleótidos en la molécula de ADN que constituye el cromosoma. Se
obtiene la secuencia de nucleótidos de un gen. Se realiza
fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos
fragmentos de ADN y la ayuda de ordenadores.
El completar este mapa se ha conseguido cinco años antes de lo que
se esperaba
CARACTERÍSTICAS PRINCIPALE DEL GENOMA HUMANO
-Sólo 20000 a 25000 genes codifican proteínas, mucho menos de lo
que se esperaba
-Los seres humanos son idénticos en un 99,9% y nos diferenciamos
en apenas unos tres millones de nucleótidos

37. -La mayor parte de estas diferencias se encuentran localizadas en
los llamados polimorfismos de un único nucleótido que son
variaciones que afectan a un solo par de bases
. La mayor parte del genoma no es codificante y se le denomina
ADN basura que parecía que no tenía ninguna función los
últimos estudios los relaciona con funciones de regulación de
la expresión de los genes
La genómica estudia ese genoma y sus objetivos principales son:
a) Identificar los genes codificadores de proteínas
b) Estudiar las interacciones de los genes entre sí