O documento descreve vários métodos imunológicos baseados na ligação de anticorpos com antígenos, incluindo reações de precipitação, imunodifusão dupla, imunodifusão radial e imunoeletroforese. Estes métodos permitem visualizar a formação de complexos antígeno-anticorpo através da observação de precipitados em gel ou curvas de precipitação. Eles são usados principalmente em pesquisa e para diagnóstico de doenças.

1. primária – Imunofluorescência, ELISA, Western Blotting, Fluorometria, Luminescência, Radioimunoensaio e Citometria de Fluxo. secundária – Precipitação e Aglutinação As próximas oito aulas tratam de métodos que se baseiam na ligação do anticorpo com o antí- geno. Tais ligações, como você já sabe, podem ser do tipo primária, secundária e terciária. Veja os métodos que serão apresentados, com base na ligação:

2. Reações de precipitação Aula 6 Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brods- Kyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em junho de 2003

4. Curva de precipitação É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: Veja os detalhes no próximo slide Zona de excesso de anticorpo Zona de equivalência Zona de excesso de antígeno + - - + - - Anticorpo livre Antígeno livre 100% -- Percentual de complexo imune precipitado Quantidade de antígeno adicionado

5. À medida que concentrações crescentes de Ag são adicionados a uma quantidade constante de Ac, a quantidade de complexos imunes preci- pitados inicialmente aumenta, caindo a seguir. De modo sequenciado, observa-se a: * zona de excesso de Ac: quantidade de Ag é insuficiente para reagir com e precipitar todo o Ac presente. O Ac livre pode ser detectado no sobrena- dante. * zona de equivalência: o Ag adicionado é suficiente para se combinar com e precipitar todo o Ac presente. Nem Ag nem Ac livre podem ser detectados no sobrenadante. * zona de excesso do Ag: a quantidade de Ag excede aquela necessária para ligar todo o Ac, havendo redução da quantidade de Ac precipitado. Esta diminuição é resultante da solubilização dos complexos Ag-Ac pelo excesso de Ag . A seguir, as principais técnicas de precipitação em gel:

7. * Pode ser visualizada após lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante. Lavagem + coloração Observe a seguir os principais padrões de reação que podem ser gerados: * As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Ac Ag Ag Ac Ag Ag Ac Ag Ag

8. * São três os padrões possíveis: 1) Os arcos de precipitação formados entre o Ac e os dois antígenos se fundem, indicando que o Ac está precipitando epítopos idênticos. 2) O Ac preparado distingue os três Ag diferentes que formam arcos independentes de precipitação. 3) Os antígenos compartilham o epítopo 1, mas um deles também possui um epítopo 3. A linha de precipitação in- dica, então, uma identidade parcial e não total, entre as preparações de Ag. Utilização: muito usada em pesquisa. Na rotina: diagnóstico de algumas doenças, como a cistecercose 1 1 Ac Anti -1 A: identidade Ag B: não identidade 1 2,4 Ac C: identidade parcial Anti –1, 2 e 4 1 1/3 Anti –1 e 3 esporão Ac

9. IMUNODIFUSÃO RADIAL Imunodifusão radial simples Gráfico padrão Concentrações conhecidas Ag * Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. *O Ac é adicionado a uma solução de agarose (~1%), que em seguida é dispensada em lâmi- nas e deixada gelificar. *Orifícios são feitos no gel para adição do Ag teste. *Incubação por 24h. Durante este período o Ag adicionado difunde-se no gel de agarose, formando complexos solúveis com o Ac. *O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitan- do-se em um anel (halo) em torno do orifício. *Colocando-se pelo menos em tres dos orifíci- os concentrações conhecidas do Ag, é possível construir uma curva com os diâmetros dos ha- los obtidos. Assim, medindo-se o halo gerado por uma concentração desconhecida do Ag e lançando-se o valor na curva, a concentra- ção é determinada. 2 Diâmetro do anel 0 25 10 50 100 Concentração do antígeno Gel contendo Ac Ag Ag colocado no orifício Anel de precipitação Teste

10. Utilização da técnica: dosagem de imunoglobulinas (A,G,M) e outras proteínas séricas

11. Imunodifusão radial Um exemplo de sua utilização: dosagem de imunoglobulinas numa placa disponível no mercado. Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA Halo de precipitação IgG – anti-IgG

12. IMUNOELETROFORESE Veja a explicação no próximo slide + - Ag Ag 1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna canaleta 2- Anti-soro na canaleta canaleta 3- Difusão e precipitação

13. NA IMUNOELETROFORESE: * Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag. * Os Ag são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica . * O pH do gel é escolhido de modo que as moléculas carregadas positivamente migrem para o eletrodo negativo. Um fluxo de água gerado por ação das cargas residuais (negativas) da agarose (eletroendosmose), empurra tais moléculas para o pólo negativo. Assim, após um tempo determinado, essas moléculas apresentam-se distribuídas no gel, de acordo com os seus PM e cargas elétricas. * Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. * O Ag e Ac formam arcos de precipitação. Utilização: avaliação de atipias das imunoglobulinas G, M e A

14. FIM