kjeldahl

2.513 visualizaciones

Publicado el

0 comentarios
2 recomendaciones
Estadísticas
Notas
  • Sé el primero en comentar

Sin descargas
Visualizaciones
Visualizaciones totales
2.513
En SlideShare
0
De insertados
0
Número de insertados
3
Acciones
Compartido
0
Descargas
0
Comentarios
0
Recomendaciones
2
Insertados 0
No insertados

No hay notas en la diapositiva.

kjeldahl

  1. 1. 1/7 ANÁLISIS DE ALIMENTOS PRÁCTICA # 3 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO BÁSICO ANÁLISIS DE PROTEÍNAS DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO EN PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE KJELDAHL INTRODUCCIÓN El problema que representa proporcionar proteínas adecuadas a lapoblación del mundo es un tanto secundario en el problema general dealimentación mundial. Además de su significado nutritivo las proteínas jueganun papel importante en las propiedades organolépticas de los alimentos. Lasproteínas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentosprovenientes de fuentes animales. El contenido protéico del trigo y su harinaes considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de lapanificación. El análisis para la determinación de proteínas, a pesar de noestar incluido generalmente como factor de clasificación en los estándares degranos se acepta como un factor comercial. Las proteínas existen en los alimentos en combinación física o químicacon carbohidratos o lípidos. Las glucoproteínas y las lipoproteínas afectan laspropiedades reológicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicacionestécnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne estárelacionado con cambios químicos en las proteínas. Las proteínas naturalespuras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullición,panificación, asado) las cadenas laterales de aminoácidos se degradan ointeractúan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con losazúcares reductores) para conferir sabores típicos. El calentamiento excesivopuede, por otro lado, reducir el valor nutritivo. El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido protéicototal de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezclacompleja de proteínas. Actualmente todos los métodos para determinar elcontenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Elaislamiento y pesado directo de la proteína proporcionaría un método absoluto,sin embargo, dicho método es llevado a cabo sólo a veces en investigaciones
  2. 2. bioquímicas pero es completamente impráctico para el análisis de alimentos. En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el procesobásico del conocido método actual de análisis de proteínas por el métodoKjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico. En esta técnicase digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos enuna mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógenoorgánico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida seneutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácidobórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, locual se convierte en el nitrógeno de la muestra. El resultado del análisisrepresenta el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógenotambién proviene de componentes no protéicos. Este método ha sufrido variasmodificaciones. Así, Kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio parallevar a cabo el proceso de oxidación, sin embargo, los resultados no fueronsatisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforthencontró que se podía acelerar la digestión con ácido sulfúrico añadiendoalgunos catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasiopara elevar el punto de ebullición de la mezcla de la digestión para acortar lareacción. Por lo tanto, el procedimiento de esta técnica es más correctamenteconocido como Método Kjeldahl-Wilforth-Gunning. FUENTES DE ERROR Constituyen fuentes de error en este método son: la inclusión denitrógeno no protéico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógenodurante la digestión, la digestión incompleta de la muestra. Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que seañaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en unadescomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco.Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C. También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiadoselenio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente; lascondiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando seusan como catalizadores.
  3. 3. 3/7 ESTRATEGIA En la práctica comercial se tienen que analizar un gran número demuestras diariamente, así que se utilizan estrategias que ahorran tiempo deanálisis. En el análisis del harina de trigo se digiere 1 gramo de muestrausando una cantidad conocida de ácido sulfúrico 0.1253N, y titulando(mediante una bureta de lectura invertida) con hidróxido de sodio 0.1253N, asíse hace posible reportar el porcentaje de proteína directamente de la lectura dela bureta. REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHLDIGESTIÓN(1) n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 proteína calorNEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) NH4 + H2BO3- (ión borato)TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado conHCl estandarizado:(4) H2BO3- + H+ H3BO3
  4. 4. OBJETIVOS El estudiante conocerá el fundamento del análisis de proteínas por elmétodo de Kjeldahl. El estudiante se familiarizará con los equipos y el procedimiento delanálisis de proteínas por el método de Kjeldahl y la recuperación de amoníaco. El estudiante aprenderá a realizar los cálculos pertinentes para ladeterminación de nitrógeno en proteínas. MATERIAL1 matraz de digestión Kjeldahl con capacidad de 125 ml.1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml.1 matraz volumétrico de 100 ml.1 mechero de Bunsen.2 pinzas (nueces).1 soporte universal1 pipeta de 5 ml.1 pipeta de 10 ml.1 frasco gotero de 25 ml.1 frasco lámbar con capacidad de 1 litro.1 piseta grande con agua destilada.1 microbureta.3 cuerpos de ebullición.1 par de guantes de asbesto.1 pinzas largas.1 embudo de cristal chico o mediano. EQUIPOAparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo). REACTIVOSVerde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%.Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.Ácido bórico al 2%.Ácido clorhídrico 0.01N (solución valorada).Hidróxido de sodio al 30%.Ácido sulfúrico concentrado.Mezcla catalizadora para la digestión: 2.5 g de dióxido de selenio + 100 g desulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada porla coordinación de laboratorios).
  5. 5. 5/7 MÉTODO ELABORACION DE REACTIVOS1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde debromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%.Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solución de rojo demetilo en un frasco gotero.2.- Ácido Bórico al 2%.- Disuelva 10 g de ácido bórico (en cristales) en 500 ml.de agua destilada hirviendo. Después de que se enfríe transfiera la solución aun frasco tapado. Se conserva indefinidamente.3.- Ácido Clorhídrico 0.01N.- Prepare un litro y valórela con una solución deNaOH de la misma normalidad.4.- Hidróxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidróxido de sodioen 350 ml. de agua destilada. Almacene la solución en un frasco ámbar contapón de vidrio.5.- H2SO4 concentrado.6.- Catalizadores para la Digestión.- Mezcle 2.5g de dióxido de selenio (SeO2),100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado(CuSO4 . 5H2O). PROCEDIMIENTO DIGESTIÓN1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de micro-Kjeldahlcuidando que la muestra no se adhiera a las parédes o al cuello del matraz.2.- Añada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullición y aproximadamente 1.0 gde mezcla catalizadora.3.- Someta a digestión la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo unacampana de extracción, con el matraz ligeramente inclinado usando bajatemperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestión,rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera todala muestra. La digestión terminará cuando el color de la muestra sea azúl-verde claro. El proceso tomará aproximadamente 90 minutos.4.- Enfríe el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca alsolidificarse la muestra.5.- Añada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida.Mezcle y permítale enfriarse.
  6. 6. DESTILACIÓN6.- Encienda la unidad destiladora.7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilación a aproximadamente 5 ml.por minuto8.- Abra la llave del agua para tener H2O circulando por el refrigerante todo eltiempo.9.- Añada la muestra a la cámara de ebullición por medio de un embudo (pararecuperar las perlas de ebullición) y enjuague el matraz con aproximadamente5ml. de H2O destilada.10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de ácido bórico y 2 gotas deindicador bajo la salida de destilación.11.- Añada aproximadamente 10 ml. de la solución de NaOH a la cámara deebullición LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornará oscura (azúl-gris ocafé oscuro). Si no cambia de color añada más NaOH.12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destiladoestará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor.14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagandola cámara de ebullición varias veces con agua destilada. Cada vez que seañada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladorapara el enjuague deje que ésta hierva primero. Luego abra la llave de la parteque permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vezvacía la parte en donde se procesa la muestra asegúrese de que esté bienvacía. Si queda todavía un poco de agua en el fondo permita que hierva paraque se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. El matrazestará listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar launidad destiladora. Esta operación se repite al menos unas 4 veces.NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conducela muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posiciónhorizontal) durante el procesamiento de la muestra. Sólo se abre cuando seenjuaga el destilador.TITULACIÓN15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final dela titulación. Compárese este color con el del blanco. Cada equivalente delHCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en lamuestra original. El peso del N en mg está dado por miliequivalentes del ácidoX 14 (el peso equivalente del N).RECUPERACIÓN DEL AMONÍACO Una posible fuente de variación en este método es la pérdida del gasamoníaco o una falla en atrapar el amoníaco en el ácido bórico. Esto puedeocurrir en diferentes pasos del proceso. Una técnica para buscar larecuperación del amoníaco consiste en destilar cantidades conocidas deamoníaco líquido y titularlo con HCl. Se obtendrá otra vez el color púrpura en
  7. 7. 7/7el ácido bórico. Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solución desulfato de amonio. Añada 5, 10 ó 15 ml (mediante una pipeta) de solución desulfato de amonio a la cámara de ebullición de la unidad destiladora.Enjuáguela después con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloqueinmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de ácido bórico +indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado. Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HClempleados y calcule el peso del nitrógeno en el (NH4)2SO4.CálculosMoles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra% N = NHCl x Volumen de ácido corregido x 14 g N x 100 g de muestra molen donde: NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml. Volumen del ácido corregido = (ml. del ácido estandarizado para lamuestra) - (ml. de ácido estandarizado para el blanco). 14 = Peso atómico del nitrógeno. Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento deproteína cruda. El porcentaje de N en proteína para el harina de trigo es de18% y su factor de conversión es de 5.70. BIBLIOGRAFÍA A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. OfficialMethods of Analysis. Washington, D.C. Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed.Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212. Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products.Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
  8. 8. Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice.2ª. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.

×