Biologia molecular

1. Fundamentos de
Engenharia Genética
Prof. Dr. Eduardo Honda
Porto Velho
2008

2. Dogma Central da Biologia Molecular

3. O que é Engenharia Genética?
É um conjunto de tecnologias que permitem
a manipulação (modificação) de material
genético in vitro
Também conhecida como Tecnologia do DNA
Recombinante
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de
genes, recombinação de genes, ou DNA de
diferentes espécies, e transferência de
genes de uma espécie para outra,
contornando o processo reprodutivo

4. Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que
codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-
lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA → isolar um fragmento
específico de DNA do cromossomo, introduzi-
lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer
milhões de cópias idênticas

5. Clonagem Molecular
Isolamento de Novos organismos que produzem
enzimas de interesse Biotecnológico.

6. Clonagem Molecular- Isolamento
Gênico
Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.

7. Isolamento do DNA- PCR
Desnaturação do DNA Fita-Dupla

8. Isolamento do DNA- PCR
Após vários ciclos...
Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!

9. Isolamento de DNA e Biblioteca
de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente,
todo o material genético de um organismo clonado
em um vetor
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.
B) cDNA:- feita a partir de mRNA .

11. Isolamento de DNA- Biblioteca
genômica
Extração do DNA Genômico;
Clivagem com enzimas de restrição;
Ligação dos Fragmentos nos vetores;
Transformação Celular;
Replicação do vetor.

12. Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo
celular específico;
- “primer” de oligo dT e
transcriptase reversa;
- DNA Polimerase I e
dNTPs;
- Clonagem em um vetor
de escolha

13. Clonagem Molecular- Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo;
2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!
3) Célula hospedeira;
4) Método para introduzir moléculas de DNA para
dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
5) Método para selecionar moléculas de DNA
quimérico ou recombinantes;
6) Métodos para o screening da característica
procurada .

14. Geração de moléculas
recombinantes
- Clonagem Molecular -

15. CLONAGEM

16. Ligação de extremidades compatíveis

17. Sítio
Múltiplo
de
Clonagem
(Polylinker)

18. As
endonucleases
de Restrição
Clonagem
Orientada

19. As “Ferramentas”
1) Enzimas
2) Vetores
3) Células hospedeiras

20. ENZIMAS

21. Enzimas de Restrição
São endonucleases que clivam o DNA
em seqüências específicas chamadas
sítio de restrição.
Quebram a ligação fosfodiéster
Os sítios de restrição são, geralmente,
seqüências palindrômicas (mesma
seqüência nos dois sentidos)

22. Enzymes for DNA manipulation –
restriction enzymes
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html

23. Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type I
cleavage occurs 400-7000 bp
from recognition site
Type II
cleavage occurs adjacent or
within recognition site
Type III
cleavage occurs 25-27 bp
from recognition site
• Endonucleases sítio-específicas
isoladas de procariotos
• Protegem a bactéria do ataque de
vírus (fagos)
• Protegem seu próprio DNA
metilando-o no sítio de restrição
• Enzimas do tipo II são as mais
utilizadas em Biologia Molecular
EcoRI metilase

24. DNA Ligase
Promover a união de moléculas de DNA
pela formação de uma ligação
fosfodiéster entre uma extremidade 3’-
OH e outra 5’-PO4.

26. DNA Polimerases
Polimerizam a molécula de DNA a
partir de uma extremidade 3´-OH e
usando uma das fitas do DNA como
molde.
Exe: Taq polimerase

27. Transcriptase reversa
Polimeriza uma fita de DNA a partir
de um molde de RNA
Isolada dos retrovírus
Aplicação: síntese de cDNA

28. VETORES

29. Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o
DNA clonado.
Características desejadas:Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula contendo oMarca genética para selecionar a célula contendo o
vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);
•Sítios de clonagem únicos.Sítios de clonagem únicos.

30. Tipos de vetoresPlasmídios
Bacteriófagos (fagos)
Cosmídios
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
Vetores especiais para plantas, células de
insetos e mamíferos

31. Plasmídios
Moléculas de DNA fita dupla circulares e de
replicação autônoma (ORI);
Têm marcas de seleção para resistência a
antibióticos ou complementação auxotrófica.

34. Sequências
de DNA de
um vetor
de
expressão
de E. coli

35. Vetores de expressão

36. Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico.
Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

37. O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado.
O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima
está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA
recombinante no plasmidio.

39. Bacteriófagos
Infectam células de E. coli e o DNA
se duplica na célula hospedeira.
Ex: Fago λ

40. Vetores baseados no fago λ
Foram retirados 20 Kb do genoma do fago
necessários para integração/excisão para
serem substituídos por DNA exógeno e
formar um genoma de 50 Kb que é
empacotado in vitro.
Genomas maiores ou menores não são
empacotados.
Ciclo lítico compulsório

41. Clonando no
Fago λ

42. Cosmídios
• São plasmídios contendo as extremidas “cos” do
fago λ
• Capacidade de clonagem: 40 Kb

45. Cromossomos artificiais

46. CÉLULAS HOSPEDEIRAS

47. Células hospedeirasCaracterísticas:
Permitir a duplicação do vetor;
Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou
auxotrofia);
Não pode representar perigo ao meio ambiente;
Não deve modificar o DNA exógeno;
Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras,
células vegetais, cultura de células de insetos e
mamíferos).

48. Métodos de introdução do DNA na
célula hospedeira
Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);
Transdução (fagos empacotados in vitro);
Transfecção (células de mamíferos);
Eletroporação (leveduras e bactérias);
Biolística ou “bombardeamento” (plantas);
Microinjeção (ovos e oócitos).

49. O canhão gênico é uma
nova forma de
transformação celular.
Esta arma usa uma
particula de
bombardeamento -
Biolística
Inserindo genes nas células

50. Adapted from Human
Genetics, Ricki Lewis
Microinjeção

51. Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico.
Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.

52. Clonando no
Fago λ

53. Seleção de clones recombinantes
resistência e sensibilidade a
antibióticos;
requerimentos nutricionais
(auxotrofia);
formação de placas de lise

54. Identificação de um
clone de interesse
- hibridação com sonda radioativa
- anticorpo específico
Screening

55. Aplicações da
Engenharia Genética

56.  Análise da estrutura/função de genes
 Produção de proteínas de interesse
industrial e terapêutico
 Engenharia proteica
 Criação de organismos transgênicos
 Terapia gênica
 Diagnóstico molecular (doenças
parasitárias e genéticas)
 Teste de paternidade / medicina
forense
 Arqueologia molecular / evolução

57. Plantas Transgênicas

59. Animais Transgênicos

61. Microinjeção de DNA no núcleo de ovoMicroinjeção de DNA no núcleo de ovo
fertilizado de camundongo - gene dofertilizado de camundongo - gene do
fator de crescimento humanofator de crescimento humano

62. Biofármacos Recombinantes

65. Terapia Gênica

66. Adição do gene
terapêutico
Substituição do gene
terapêutico

67. Uso de vírus