Este estudio evaluó la expresión del gen cry11Bb y la respuesta inmune en ratones inmunizados con el plásmido pSO2C1. Se detectó la presencia del plásmido hasta 2 años después en el músculo mediante PCR e hibridación in situ. La proteína Cry11Bb fue expresada en el músculo y se indujo una fuerte y duradera respuesta de anticuerpos. Asimismo, el plásmido pBMC2, que codifica para Bm86, indujo la expresión de esta proteína en el músc

1. Estudio de la expresión de plásmidos de ADN y
su respuesta inmune en un modelo murino
Trabajo de Grado presentado para optar al título de Magíster en
Biología
Por:
Lina María Ruiz Hincapié
Asesores:
Sergio Orduz Peralta1 Biólogo, PhD
Gemma Armengol Rosell1 Bióloga, PhD
Unidad de Biotecnología y Control Biológico
Corporación para Investigaciones Biológicas1
Instituto de Biología - Posgrado
Universidad de Antioquia2
Medellín, Noviembre de 2003

2. Unidad de Biotecnología y
Control Biológico
• Desarrollo de tecnología para el control de plagas
de la agricultura por medio de la bacteria Bacillus
thuringiensis y del hongo Trichoderma.
• Además trabaja en la búsqueda de estrategias
para el control biológico de mosquitos
transmisores de enfermedades como el dengue y
el paludismo con el uso de Bacillus thuringiensis y
de insectos de la familia Notonectidae.
• Con el objeto de ampliar el enfoque
biotecnológico la Unidad se interesa en el control
de garrapatas mediante vacunación genética.

3. Justificación
Producción
Pérdidas económicas
Enfermedades
hemoparasitarias
Resistencia químicos
Contaminación
-carne y leche
-fuentes de agua

4. Boophilus microplus
• Intestino  glicoproteína Bm86
• Bm86  confiere una inmunidad diferente a
la adquirida en forma natural.
• Anticuerpos anti-Bm86  actúan
directamente sobre la garrapata afectando
principalmente el intestino en las formas
adultas, su peso, número de huevos puestos,
así como la supervivencia de los huevos,
larvas y adultos.

5. Inmunización Bm86 recombinante
• Altamente eficaz en el control de la
infestación por B. microplus.
• Reducción del uso de acaricidas y la
transmisión de babebiosis.
• Estos beneficios podrían aumentarse al
disminuir los costos de producción y
distribución, con una vacuna estable a
temperatura ambiente.
• Es de gran interés para la UBCB, estudiar
nuevas alternativas de inmunización
contra B. microplus.

6. Vacunación Genética
-Ventajas-
• Control de numerosas enfermedades
infecciosas, alergias y cáncer, entre
otras.
• Inducción de respuesta inmune humoral
y celular.
• Eliminación de los riesgos asociados a
la generación de epidemias.
• Fácil produción y gran estabilidad a
temperatura ambiente, lo que facilita su
distribución y disminuye los costos.

7. Plásmidos como VECTORES para
vacunas: Nueva era en la vaccinología.
2475
Pst1
Sal1
Pml1
Bcl1
EcoRV
Not1
Xba1
BstN1
Nar1
BamH1
Bgl2
CMV IE 5´ UT
MCS
pUC18
VR1012
4915 bp
CMV Promotor/
potenciador250
TXT Sitio de
inicio 919
2475
Pst1
Sal1
Pml1
Bcl1
EcoRV
Not1
Xba1
BstN1
Nar1
BamH1
Bgl2
CMV IE 5´ UT
MCS
Term BGHpUC18
VR1012
4915 bp
Resistencia
Kanamicina

8. Plásmido ADN
núcleo
Tejido muscular
Inoculado
péptidos
proteína
ARNm
Ag.
LB
Citoquinas Th2
TCRCMH II
CPA
local
LTA
R. I. Humoral
LBLB
Anticuerpos
LB activado
Citoquinas Th1
LTA
CMH I
R. I. Celular
Memoria
LTC
LTC
LTC
LTC
LTC
Receptor citoquinas
LTC activadas

9. Aún se requieren estudios que
permitan aclarar: ¿...?
• Cómo es el transporte del plásmido?
• Persistencia del plásmido en los
tejidos?
• Distribución del plásmido en los tejidos?
• Por cuánto tiempo se mantienen los
altos títulos de anticuerpos?

10. Primera Parte
Objetivos
• Evaluar la presencia y el tiempo de vida media del
plásmido pSO2C1, que codifica para el gen cry11Bb,
en tejido muscular de ratones inmunizados con
pSO2C1, mediante hibridización in situ y PCR.
• Analizar la expresión del gen cry11Bb y la respuesta
inmune humoral en los ratones inmunizados con
pSO2C1, por medio de inmunohistoquímica y ELISA,
respectivamente.

11. ELISA
Ratón BALB/c entre 6
y 10 semanas.
Inyectados en los
quadríceps (i.m.) con
10 g de pSO2C1, a
las 0, 2 y 4 semanas.
Metodología
E. coli +
pSO2C1
Sangrado de la
cola. Sacrificados, disección de
quadríceps, mantenidos a -70oC
hasta su uso.
Hibridación in situ
Inmunohistoquímica
Aislación DNA
PCR
Secciones de 5 m en criostato
kan
CMV
promotor
EcoRV
cry11Bb
BamHI
BGHpA
pSO2C1
pUC18

12. Detección de pSO2C1 en músculo de
ratón por hibridación in situ
*Sonda “pSO2C1” biotinilado por Nick translation
*Detección fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina
*Sustrato alcalino NBT/BCIP.
Ctr + Ctr -
Células HeLa infectadas
con el adenovirus tipo 2,
aprox. 10% son positivas
(azul-purpura).
Placas de tejido muscular
sin pSO2C1.

13. Distribución del plásmido pSO2C1
inyectado en el tejido muscular de ratón
70%

14. Distribución del plásmido pSO2C1
inyectado en el tejido muscular de ratón
20%
30%

15. Persistencia de pSO2C1 en el tejido muscular
después de 2 años de inoculación
PCR
Primers
específicos
cry11A y cry11B
Perfil térmico
94o, 5 min./ 94o,
45 seg
45o, 45 seg/ 72o,
1 min.
34 ciclos
72o, 6 min/ 4o,
16h
305
1500
1000
900
800
700
600
500
400
300
ADN músculo
ratón inoculado
con pSO2C1
1 ratón por fechaExtracción del ADN
muscular por la técnica
del fenol-cloroformo

16. pSO2C1 i.m. expresa la proteína Cry11Bb
Inmunohistoquímica: Anticuerpo policlonal anti Cry11Bb (Ac. 1rio.),
anti IgG conjugado con peroxidasa (Ac. 2rio.). Revelado DAB.
40%

0% 4-40%

17. pSO2C1 i.m. expresa la proteína Cry11Bb
6%
6%

18. Respuesta inmune humoral de larga duración contra
la Cry11Bb expresada por pSO2C1 (n=7)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 3 5 7 14 22 30 38 47 56 65 73 81 90 104 119
Tiempo después de la primera inmunización (semanas)
Títuloanti-Cry11Bb
Grupo B Grupo C
103
102
ANOVA (F=90.06, p<0.05)
Duncan p<0.05
Grupo A

19. Conclusiones
• Mediante hibridación in situ y PCR se detectó
la presencia del plásmido pSO2C1 hasta dos
años después de la inoculación.
• La persistencia de la expresión del gen
cry11Bb en músculo es debida a la
estabilidad del plásmido pSO2C1.
• La ruta de inoculación intramuscular es
eficiente para obtener una fuerte respuesta
inmune humoral.

20. Hilleman: DNA Vectors. 1995. ANNALS of the NEW YORK ACADEMY of SCIENCE
CONTROVERSIAS GENERADAS
ENTORNO A LAS VACUNAS DE ADN

21. Segunda Parte
Objetivo
• Evaluar el nivel de anticuerpos, la clase de
inmunoglobulinas y el patrón de citoquinas
que predominan en la respuesta inmune de
ratones inmunizados con el plásmido pBMC2
que codifica para Bm86 mediante ensayos
inmunoenzimáticos.

22. Introducción
Boophilus microplus
línea colombiana
Hace parte del proyecto
“Desarrollo de dos estrategias
para el control de la garrapata
Boophilus microplus”, financiado
por COLCIENCIAS.

23. ARNm ADNc
bm86
10000
6000
4000
3000
2000
1000
MWM pVAX1 pBMC2 pSO2C1
pBMC2
XbaI
BGHpA
Kan
pMB1 ori
CMV
promotor
bm86
E. coli +
pBMC2
pT7Blue
Cuantificaión
DNA
Fluorometría

24. Esquema de inmunización de ratones BALB/c,
hembras entre 6 y 8 semanas
Grupo Tratamiento
# 1 (n=9) PBS
# 2 (n=9) 10 µg pBMC2 i.m
# 3 (n=9) 10 µg pBMC2 i.d.
# 4 (n=9) 50 µg pBMC2 i.m
# 5 (n=9) 50 µg pBMC2 i.d
# 6 (n=6) GAVAC
# 7 (n=3) 100 µg pBMC2 i.m.
3 dosis  0, 2 y 4 semanas.

25. BALB/c
ELISAS: sueros, sobrenadante esplenocitos
Sangre
Bazo
esplenocitos
Quadriceps
Expresión
Bm86
SDS-PAGE
Western-
blot
BD Pharmingen OptEIA
Nunc C8 StarWell Maxisorp
Bm86
HRP
OPD
suero
IgG anti
raton HRP
anti-
isotipos
suero
detección
anti-
IL
suero
detección
20000 eventos por tratamiento
excitación
488 nm (FITC) a 514 nm
(IP) a 600 nm
Citometría de flujo
Proliferación celular
Incorporación BrdU
Anti-Bm86
Isotipos Ig
Interleuquinas

26. 29
45
66
205
116
97
El análisis de los músculos de los ratones inmunizados con
pBMC2 permitió observar la expresión in vivo de Bm86
SDS-PAGE Solubilizado quadriceps Western Blot Inmunodetección de
Bm86 mediante antipéptidos de Bm86
Solubilizado quadriceps
kDa
kDa
205
116
97
66
45
Bm86
(89 kDa)

27. Detección de anticuerpos anti-Bm86 inducidos por
pBMC2 (ELISA)
2 meses post-inóculo
Antígeno de captura larvas de B. microplus homogenizadas  Bm86
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
PBS 10 ug
pBMC2 id
50 ug
pBMC2 id
10 ug
pBMC2
im
50 ug
pBMC2
im
Tratamiento
Absorbancia(490nm)
*
*
ANOVA (F=8.75, *p=0.0001)
Dilución
Suero 1:10

28. Detección de anticuerpos anti-Bm86 inducidos
por pBMC2 (ELISA)
2 meses post-inóculo
Antígeno de captura Bm86  acetona de GAVAC
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
PBS im 10 ug pBMC2
i.d.
50 ug pBMC2
i.d.
10 ug pBMC2
i.m.
50 ug pBMC2
i.m.
GAVAC
Tratamiento
Absorbancia(490nm)
Dilución 1:50
*

29. Tipificación de los isotipos totales de inmunoglobulinas en
suero (1:5000) de raton (n6) inmunizado con pBMC2 (2
meses post-inmunización).
2 meses post-inóculo
Absorbancia (490 nm) isotipos inmunoglobulinas
a
Tratamiento IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA Ig Ig
PBS i.m.
1,599 
0,889
a
1,599 
0,555
a1
1,405 
0,564
a1
2,136 
0,336
a
1,143 
0,421
a
0,819 
0,398
a
1,206 
0,569
a1
0,399 
0,253
a
10 ug pBMC2 i.d.
2,273 
0,046
a
2,297 
0,089
b1
1,988 
0,255
a2b
2,394 
0,013
a
1,279 
0,193
a
0,729 
0,088
a
1,783 
0,268
a2b
0,395 
0,089
a
50 ug pBMC2 i.d.
2,015 
0,280
a
1,801 
0,046
a2b
1,806 
0,092
a3b
2,265 
0,123
a
1,057 
0,132
a
0,646 
0,199
a
1,292 
0,150
a3b
0,298 
0,102
a
10 ug pBMC2 i.m.
2,079 
0,301
a
1,768 
0,367
a3b
1,691 
0,244
a4b
2,196 
0,158
a
1,338 
0,357
a
0,700 
0,226
a
1,401 
0,322
a4b
0,273 
0,123
a
50 ug pBMC2 i.m.
2,255 
0,034
a
2,311 
0,100
b2
2,302 
0,046
b
2,130 
0,357
a
1,642 
0,373
a
0,884 
0,203
a
1,890 
0,264
b
0,648 
0,260
a
id, vía intradermica; im, vía intramuscular.
a
Valores medios dentro de cada columna con diferentes letras son significativamente
diferentes Duncan ( 0.05).

30. Cuantificación de citoquinas en sueros de ratones
sin diluir inmunizados con pBMC2
3 meses post-inóculo
0
100
200
300
400
500
600
700
IL-4 IL-5 IL-12 (p40) IFN-gamma
Concentración(pg/mL)
10 ug pBMC2 id
50 ug pBMC2 id
10 ug pBMC2 im
50 ug pBMC2 im
PBS
*
*
*

31. Cuantificación de citoquinas a partir de
sobrenandantes de cultivos de esplenocitos
3 meses post-inóculo
0
100
200
300
400
500
600
10 ug
pBMC2
id
10 ug
pBMC2
id +
Bm86
50 ug
pBMC2
id
50 ug
pBMC2
id +
Bm86
10 ug
pBMC2
im
10 ug
pBMC2
im +
Bm86
50 ug
pBMC2
im
50 ug
pBMC2
im +
Bm86
Concentración(pg/mL)
IL-4
IL-5
IL-12 (p40)
IFN-gamma
*

32. Análisis de proliferación celular de esplenocitos
de ratones inmunizados con pBMC2
3 meses post-inóculo
Tratamiento Porcentaje de
incorporación de
BrdU ***
10 g de pBMC2 i.d. 1.1
10 g de pBMC2 i.d. + Bm86 4.1
50 g de pBMC2 i.d. 8.4
50 g de pBMC2 i.d. +Bm86 39.7
10 g de pBMC2 i.m. 20.6
10 g de pBMC2 i.m. + Bm86 22.4
50 g de pBMC2 i.m. 9.9
50 g de pBMC2 i.m. + Bm86 63.9
*** Citometría de flujo

33. Conclusiones
• Los sueros de los ratones inoculados con el
plásmido pBMC2 a una concentración de 50
g por vía i.m. presentaron una densidad
óptica significativamente mayor a los sueros
de los ratones inoculados con PBS.
• En los ratones inoculados con el plásmido
pBMC2 no se encontró una respuesta inmune
polarizada, ya que presentó algunos rasgos de
Th1 y otros de Th2.

34. Conclusiones
• Estos resultados sugieren el potencial de la
inmunización genética para inducir una
respuesta inmune contra la garrapata bovina,
B. microplus.
• Los niveles de anticuerpos anti-Bm86 fueron
significativamente menores en los sueros de
ratones inmunizados con pBMC2 que los
inmunizados con GAVAC

35. • Experimentos en el modelo murino
pueden proveer información valiosa; sin
embargo, es muy importante utilizar un
modelo animal mas relevante.
Conclusiones

36. Tercera Parte
• Adaptación de codones para optimizar
una vacuna de ADN contra garrapatas

37. Introducción
• Las vacunas de ADN utilizan la maquinaria
del hospedero para la transcripción de genes
y la traducción de proteínas.
• La diferencia interespecífica del uso de
codones es uno de los principales obstáculos
en la inducción de una respuesta inmune
efectiva en la inmunización genética.

38. Objetivo
• Analizar la relación entre el uso de
codones en el gen bm86 de la
garrapata Boophilus microplus y su
expresión potencial en células de
bovinos.

39. Análisis estadístico



ni
1j
Xij
ni
1
Xij
RSCUij
Uso relativo de codones sinónimos
Gen bm86  649 codones
Frecuencia (Xij)= Nro. de codones aaij
total 649
ni  codones alternativos 1 a 6
Por ejemplo, ni Phe = 2
Xij TTT  Phe = 6 / 649 = 0.0092
Xij TTC  Phe = 8 / 649 = 0.0122
RSCUTTT = 0.0092 = 0.859
(0.0092 + 0.0122)/2
RSCUTTC = 0.0122 = 1.140
(0.0122 + 0.0122)/2

40. Análisis estadístico
El índice de adaptación de codones (CAI) para un
gen es calculado como la media geométrica de los
valores del RSCU correspondiente a cada codon
usado en el gen.
CAI=CAIobs/CAImax donde
  L
1
IIRSCUCAI k
L
1k
obs


  L
1
IIRSCUCAI maxk
L
1k
max



41. Por ejemplo, los valores RSCU para el gen LLO91A en Listeria
RSCU1 -GGU (Gly)- =1.473 RSCU1max -GGU (Gly)- =1.473
RSCU2 -UAC (Tyr)- =0.596 RSCU2max -UAC (Tyr)- =1.404
RSCU3 -AAA (Gly)- =1.707 RSCU3max -AAA (Gly)- =1.707
RSCU4 -GAU (Gly)- =1.488 RSCU4max -GAU (Gly)- =1.488
RSCU5 -GGA (Gly)- =1.264 RSCU5max -GGA (Gly)- =1.473
RSCU6 -AAU (Gly)- =1.369 RSCU6max -AAU (Gly)- =1.369
RSCU7 -GAA (Gly)- =1.648 RSCU7max -GAA (Gly)- =1.648
RSCU8 -UAU (Gly)- =1.404 RSCU8max -UAU (Gly)- =1.404
RSCU9 -AUU (Gly)- =1.737 RSCU9max -AUU (Gly)- =1.737
CAIobs=raiz 9(1.473 x 0.596 x 1.707 x 1.488 x 1.264 x 1.369 x
1.648 x 1.404 x 1.737)
CAIobs=raiz 9 de 15.508 = 1.356
CAImax=raiz 9(1.473 x 1.404 x 1.707 x 1.488 x 1.473 x 1.369 x
1.648 x 1.404 x 1.737)
CAImax=raiz 9 de 42.573 = 1.517
CAI= CAIobs/ CAImax=1.356/1.517=0.894

42. Análisis estadístico
La adaptabilidad relativa de un codon, Wij, es la frecuencia del
uso de ese codon comparada a la frecuencia del codon óptimo
para ese aminoácido.
Wij = RSCUij/RSCUmax
WTTT = RSCUTTT/RSCUmax= 0.859/1.140=0.753
WTTC= RSCUTTC/RSCUmax = 1.140 /1.140=1.000
  L
1
IIWCAI k
L
1k
 

L
1k
kWln
L
1
expCAI





 
a
WW
e
)2ln()1ln(
*
2
1

43. RESULTADOS
Valores del uso relativo de codones
sinónimos (RSCU) y la adaptabilidad
relativa de un codon (W) para los
codones de los genes bm86 de Boophilus
microplus y bsa de Bos taurus
RSCU > 1  el codon es usado mas
frecuentemente de lo esperado en un
organismo dado, y viceversa.

44. COD AA RSCU
bm86
W
bm86
RSCU
bsa
W
bsa
COD AA RSCU
bm86
W
bm86
RSCU
bsa
W
bsa
TTT Phe 0,856 0,753 1,467 1,000 GTG Val 1,095 0,821 1,587 1,000
TTC Phe 1,140 1,000 0,532 0,362 TCT Ser 1,403 1,000 0,942 0,499
TTA Leu 0,174 0,122 0,463 0,333 TCC Ser 0,422 0,300 1,126 0,597
TTG Leu 1,418 1,000 1,203 0,866 TCA Ser 1,266 0,902 1,885 1,000
CTT Leu 0,709 0,500 1,299 0,935 TCG Ser 0,697 0,496 0,183 0,097
CTC Leu 1,244 0,877 0,926 0,666 CCT Pro 1,289 0,902 1,008 0,638
CTA Leu 1,069 0,753 0,740 0,532 CCC Pro 0,280 0,195 1,298 0,822
CTG Leu 1,418 1,000 1,389 1,000 CCA Pro 1,429 1,000 1,578 1,000
ATT Ile 1,131 1,000 1,419 1,000 CCG Pro 1,000 0,699 0,140 0,088
ATC Ile 0,754 0,666 0,802 0,565 ACT Thr 0,784 0,693 1,532 0,866
ATA Ile 1,131 1,000 0,802 0,565 ACC Thr 1,130 1,000 0,705 0,398
ATG Met 1,000 1,000 1,000 1,000 ACA Thr 1,130 1,000 1,769 1,000
GTT Val 1,095 0,821 1,058 0,666 ACG Thr 0,954 0,844 0,000 0,000
GTC Val 1,333 1,000 0,419 0,264 GCT Ala 1,721 1,000 1,591 1,000
GTA Val 0,484 0,363 0,954 0,601 GCC Ala 0,406 0,235 1,255 0,788

45. COD AA RSCU
bm86
W
bm86
RSCU
bsa
W
bsa
COD AA RSCU
bm86
W
bm86
RSCU
bsa
W
bsa
GCA Ala 1,395 0,810 1,086 0,682 GAG Glu 0,888 0,799 0,916 0,550
GCG Ala 0,491 0,285 0,081 0,051 TGT Cys 0,615 0,444 0,842 0,842
TAT Tyr 0,841 0,726 1,430 1,000 TGC Cys 1,384 1,000 1,087 1,000
TAC Tyr 1,158 1,000 0,569 0,397 TGG Trp 1,000 1,000 0,004 1,000
CAT His 1,000 1,000 1,294 1,000 CGT Arg 1,718 1,000 0,462 0,248
CAC His 1,000 1,000 0,705 0,912 CGC Arg 1,295 0,753 0,150 0,080
CAA Gln 1,243 1,000 1,298 1,000 CGA Arg 1,070 0,622 0,150 0,080
CAG Gln 0,762 0,613 1,149 0,540 CGG Arg 0,422 0,245 0,462 0,248
AAT Asn 0,727 0,571 0,859 1,000 AGT Ser 1,266 0,902 0,747 0,396
AAC Asn 1,272 1,000 1,200 0,747 AGC Ser 0,981 0,699 1,126 0,597
AAA Lys 1,185 1,000 0,799 1,000 AGA Arg 0,211 0,122 1,858 1,000
AAG Lys 0,686 0,686 1,402 0,665 AGG Arg 1,295 0,753 0,924 0,497
GAT Asp 0,850 0,739 0,600 1,000 GGT Gly 0,818 0,662 1,420 0,748
GAC Asp 1,149 1,000 1,291 0,427 GGC Gly 1,234 1,000 0,710 0,374
GAA Glu 1,111 1,000 0,711 1,000 GGA Gly 0,926 0,750 1,898 1,000

46. RESULTADOS
• Los valores RSCU entre bm86 y bsa no
son significativamente diferentes.
• Algunos codones presentan valores
altos en bm86 y bajos en bsa, indicando
que codones frecuentemente usados en
bm86 son inusualmente usados en bsa,
y viceversa.

47. bm86 bsa bm86 en
bovino
CAIobs 1.045 1.034 1.045
CAImax 1.290 1.343 1.343
CAI 0.810 0.770 0.778
Valores del índice de adaptación de codones (CAI)
para los genes bm86 de Boophilus microplus y bsa
de Bos taurus
El CAI de bm86 en bovino fue menor, sugiriendo
de nuevo que algunos codones usados en bm86
son menos usados en bsa.

48. TTT Phe 16.5
TTC Phe 23.9
TTA Leu 5.8
TTG Leu I 11.6
TCT Ser 13.3
TCC Ser 17.0
TCA Ser 10.0
TCG Ser 4.5
TAT Tyr 12.1
TAC Tyr 18.9
TAA Ter 0.8
TAG Ter 0.6
TGT Cys 9.9
TGC Cys 13.9
TGA Ter 1.3
TGG Trp 14.2
CTT Leu 11.7
CTC Leu 20.8
CTA Leu 5.9
CTG Leu i 41.9
CCT Pro 15.3
CCC Pro 19.8
CCA Pro 14.3
CCG Pro 7.3
CAT His 8.5
CAC His 14.7
CAA Gln 10.4
CAG Gln 32.6
CGT Arg 4.4
CGC Arg 10.4
CGA Arg 5.9
CGG Arg 10.8
ATT Ile 15.8
ATC Ile 25.2
ATA Ile 6.9
ATG Met I 22.6
ACT Thr 12.0
ACC Thr 21.3
ACA Thr 13.9
ACG Thr 7.3
AAT Asn 16.0
AAC Asn 23.2
AAA Lys 22.0
AAG Lys 34.5
AGT Ser 10.5
AGC Ser 18.5
AGA Arg 10.8
AGG Arg 11.2
GTT Val 10.5
GTC Val 16.5
GTA Val 6.3
GTG Val 31.0
GCT Ala 18.0
GCC Ala 29.7
GCA Ala 13.8
GCG Ala 7.9
GAT Asp 21.2
GAC Asp 29.0
GAA Glu 26.9
GAG Glu 40.7
GGT Gly 11.0
GGC Gly 23.9
GGA Gly 16.6
GGG Gly 16.6
Frecuencia del uso de codones en Bos taurus
Se seleccionarón los codones con mayor frecuencia
para remplazar en la secuencia proteica de Bm86

49. ccgcgacagctgcggtggttcgacgcagtgagatgcgtggcatcgctttgttcgtcgccg 60*
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ccgcgacagctgcggtggttcgacgcagtgagatgaggggcatcgccctcttcgtggccg 60
M R G I A L F V A A
ctgtttcactgattgtagagggcacagcagaatcatccatttgctctgacttcgggaacg 120*
| || || || || |||||||| || || ||| ||| |||||||| ||||
ccgtgagcctcatcgtggagggcaccgccgagagcagcatctgcagcgacttcggcaacg 120
V S L I V E G T A E S S I C S D F G N E
agttctgtcgcaacgctgaatgtgaagtggtgcctggtgcagaggatgatttcgtgtgca 180*
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F C R N A E C E V V P G A E D D F V C K
aatgtccgcgagataatatgtacttcaatgctgctgaaaagcaatgcgaatataaagaca 240*
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agtgccccagggacaacatgtacttcaacgccgccgagaagcagtgcgagtacaaggaca 240
C P R D N M Y F N A A E K Q C E Y K D T
cgtgcaagacaagggagtgcagctatggacgttgcgttgaaagtaacccgagcaaggcta 300*
| |||||||| |||||||||||||| || | ||||| || || ||||| |||||||| |
cctgcaagaccagggagtgcagctacggcaggtgcgtggagagcaaccccagcaaggcca 300
C K T R E C S Y G R C V E S N P S K A S
gctgcgtctgcgaagcatcggacgatctaacgctacaatgcaaaattaaaaatgactacg 360*
||||||| ||||| || ||||| || || || || ||||| || || || |||||||
gctgcgtgtgcgaggccagcgacgacctcaccctccagtgcaagatcaagaacgactacg 360
C V C E A S D D L T L Q C K I K N D Y A
caactgactgccgaaatcgaggtggcactgctaagttgcgcacggatgggtttattggcg 420*
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ccaccgactgcaggaacaggggcggcaccgccaagctcaggaccgacggcttcatcggcg 420
T D C R N R G G T A K L R T D G F I G A
caacgtgtgactgtggtgaatggggtgcgatgaacatgaccacccggaactgtgtcccta 480*
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ccacctgcgactgcggcgagtggggcgccatgaacatgaccaccaggaactgcgtgccca 480
T C D C G E W G A M N M T T R N C V P T
ccacgtgtcttcgtcccgacttgacctgcaaagacctctgcgagaaaaacctgcttcaaa 540*
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ccacctgcctcaggcccgacctcacctgcaaggacctctgcgagaagaacctcctccaga 540
T C L R P D L T C K D L C E K N L L Q R
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D S R C C Q G W N T A N C S A A P P A D
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|| ||| ||| || || |||||||| || || ||||| ||||| || || || ||||
acagctactgcagccccggcagccccaagggccccgacggccagtgcatcaacgcctgca 660
S Y C S P G S P K G P D G Q C I N A C K
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|||| || || || || || || |||||||| || |||||| ||||||||||| ||||
agaccaaggaggccggcttcgtgtgcaagcacggctgcaggagcaccggcaaggcctacg 720
T K E A G F V C K H G C R S T G K A Y E
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C T C P S G S T V A E D G I T C K S I S
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H T V S C T A E Q K Q T C R P T E D C R
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V H K G T V L C E C P W N Q H L V G D T
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C I S D C V D K K C H E E F M D C G V Y
atatgaatcgacaaagctgctattgtccatggaaatcaaggaagccgggcccaaatgtca 1020*
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M N R Q S C Y C P W K S R K P G P N V N
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I N E C L L N E Y Y Y T V S F T P N I S
cttttgattctgaccattgcaaatggtatgaggatcgtgttttggaagcgatacggacca 1140*
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gcttcgacagcgaccactgcaagtggtacgaggacagggtgctcgaggccatcaggacca 1140
F D S D H C K W Y E D R V L E A I R T S
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I G K E V F K V E I L N C T Q D I K A R
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L I A E K P L S K H V L R K L Q A C E H
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P I G E W C M M Y P K L L I K K N S A T
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E I E E E N L C D S L L K D Q E A A Y K
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| || || ||||| ||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||| || || |
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G Q N K C V K V D N L F W F Q C A D G Y
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T T T Y E M T R G R L R R S V C K A G V
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S C N E N E Q S E C A D K G Q I F V Y E
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N G K A N C Q C P P D T K P G E I G C I
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tcgagaggaccacctgcaaccccaaggagatccaggagtgccaggacaagaagctcgagt 1680
E R T T C N P K E I Q E C Q D K K L E C
gcgtttacaaaaaccataaagcagaatgcgagtgtcctgatgatcacgagtgttacaggg 1740*
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gcgtgtacaagaaccacaaggccgagtgcgagtgccccgacgaccacgagtgctacaggg 1740
V Y K N H K A E C E C P D D H E C Y R E
agcctgccaaagactcttgcagtgaagaggataatggtaaatgtcaaagcagtgggcagc 1800*
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P A K D S C S E E D N G K C Q S S G Q R
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ggtgcgtgatcgagaacggcaaggccgtgtgcaaggagaagagcgaggccaccaccgccg 1860
C V I E N G K A V C K E K S E A T T A A
cgactacaacaacgaaagcgaaagacaaggatccagatcctggaaagtcaagtgctgcag 1920*
| || || || || || || || |||||||| || || || || ||||||||||||||||
ccaccaccaccaccaaggccaaggacaaggaccccgaccccggcaagtcaagtgctgcag 1920
T T T T K A K D K D P D P G K S S A A A
cagtatcagctactgggctcttgttactgctcgcagctacttcagtcaccgcagcatcgt 1980*
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
cagtatcagctactgggctcttgttactgctcgcagctacttcagtcaccgcagcatcgt 1980
V S A T G L L L L L A A T S V T A A S L
tgtaaggaagatgtccaacttgaatacggaacagcttgaatatgtatatatacatcacgc 2040*
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tgtaaggaagatgtccaacttgaatacggaacagcttgaatatgtatatatacatcacgc 2040
Ter
Alineamiento de las secuencia silvestre
y optimizada del gen bm86 con la
secuencia proteica de Bm86, líneas
indican nucleótidos homólogos.
14% contenido de G+C en secuencia
optimizada
Homología con los genes silvestres
bm86 y bm95

50. Conclusiones
• El plásmido pSO2C1 indujo la expresión de
la proteína Cry11Bb durante un largo periodo
de tiempo y así la respuesta inmune humoral
inducida contra dicha proteína, esto también
estuvo correlacionado con la persistencia del
plásmido.
• Estos eventos pueden depender del gen que
se esta expresando y del destino de la
proteína, además del hospedero del
plásmido.

51. Conclusiones
• La respuesta inmune inducida depende
de la concentración del plásmido y la
ruta de inoculación, esto se pudo
observar en los ratones inmunizados
con pBMC2 que en general presentaron
una mayor respuesta con la
concentración mas alta por la vía
intramuscular.

52. Conclusiones
• A pesar del potencial de la inmunización
genética contra la proteína Bm86 de B.
microplus, se evidencia la necesidad de
modular la respuesta inmune inducida por
pBMC2 mediante el uso de adyuvantes
genéticos.
• La vacuna de ADN contra garrapatas se
podría optimizar a nivel de la expresión del
gen bm86, esto mediante la construcción de
un gen con los codones optimizados para
una mejor expresión de la proteína en el
hospedero.

53. AGRADECIMIENTOS
• COLCIENCIAS y CIB por la financiación de las
investigaciones aquí presentadas.
• Comité Científico de la CIB.
• Dirección Administrativa de la CIB.
• Personal de la Unidad de Biotecnología y Control
Biológico de la CIB, de la Unidad de Micología Médica y
Experimental de la CIB y el Grupo de Inmunodeficiencias
Primarias de la Universidad de Antioquia por el soporte
técnico y académico.
• Postgrado de Biología de la Universidad de Antioquia por
el soporte académico.
• Evaluadores del trabajo de grado.

54. Publicaciones
• 1: Ruiz LM, Orduz S, López ED, Guzmán F, Patarroyo ME, Armengol G.
Immune response in mice and cattle after immunization with a Boophilus
microplus DNA vaccine containing bm86 gene. Vet Parasitol. 2007 Mar
15;144(1-2):138-45. Epub 2006 Oct 20. PubMed PMID: 17055651.
• 2: Ruiz LM, Armengol G, Habeych E, Orduz S. A theoretical analysis of
codon adaptation index of the Boophilus microplus bm86 gene directed to the
optimization of a DNA vaccine. J Theor Biol. 2006 Apr 21;239(4):445-9.
Epub 2005 Sep 19. PubMed PMID: 16171828.
• 3: Armengol G, Ruiz LM, Orduz S. The injection of plasmid DNA in mouse
muscle results in lifelong persistence of DNA, gene expression, and humoral
response. Mol Biotechnol. 2004 Jun;27(2):109-18. PubMed PMID: 15208453.

55. GRACIAS