O documento descreve o histórico da clonagem molecular das interleucinas IL-4, IL-5 e IL-6 em 1986 e conceitos sobre clonagem molecular como a construção de DNA recombinante e sua propagação em células hospedeiras. O artigo também apresenta um método semi-quantitativo para medir a carga viral do citomegalovírus utilizando plasmídeos clonados com parte do gene gB do vírus.

1. CLONAGEM
M
OLECULAR
M
ESTRADO
EM
CIÊNCIAS
DA
SAÚDE-UNIFOR
DISCIPLINA: BIOLOGIA
M
OLECULAR
PROFESSORA: DANIELLE
M
ALTA
ALUNA: LUCIANNA
AUXI COSTA

2. HISTÓRICO DA CLONAGEM: 1986- IL4, IL5 E IL6
Revisiting the 1986 molecular cloning of interleukin 6
Toshio Hirano*
Osaka University, Suita, Osaka, Japan
*Correspondence: hirano@molonc.med.osaka-u.ac.jp
Edited by:
Kendall A. Smith,Weill Medical College of Cornell
University, USA
Artigo original na NATURE-1986

3. CONCEITOS TEÓRICOS
• Clonagem molecular: Construção de uma molécula de
DNA recombinante e sua propagação em hospedeiro
apropriado que possibilite a seleção deste DNA.
Introdução de um gene dentro de um vetor, através
das enzimas de restrição ( enzimas modificadoras do
DNA- reconhecem determinados pares de base e
clivam) e o propaga dentro de um organismo (célula)
hospedeiro (a) para estudá-lo.

4. CONCEITOS TEÓRICOS
• Inserto: Fragmento de DNA que se tem interesse em
estudar ( expressar ou reproduzir). A união de um
inserto e um vetor dará origem a uma molécula
chamada QUIMÉRICA (DNA recombinante).
• DNA Recombinante será trasnfectado para dentro de
uma célula onde se reproduzirá independente ou não
da reprodução do próprio material genético. Essa
célula será dita CÉLULA TRANSFORMADA.

5. CLONAGEM

6. CLONAGEM

7. ARTIGO
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA SEMI-
QUANTITATIVA UTILIZANDO PLASMÍDIO CLONADO COM
PARTE DO GENE Gb DE CITOMEGALOVÍRUS
Descrição de métodos, técnicas e instrumentais
Medicina, Ribeirão Preto-2002
Lauro J Marin, Aldo A Cunha, Victor H Aquino e Luiz TM
Figueredo.

8. INTRODUÇÃO
Importância do diagnóstico do CMV- Grande incidência –
100%
• Grande variedade de Síndromes Clínicas- Doenças
agudas, transmissões verticais e sangue,
imunodeficiência. Pneumonias e
pneumonites,retinites,meningoencefalites,mielites,
polirradiculopatia, úlceras gastrointestinais etc...
• Atualmente: RN/Transplantados e HIV/AIDS

9. CITOMEGALOVIRUS
Genoma: 240kb,envelope de
bicamada proteica- 8 proteínas –
glicoproteínas gB e gH- Sítios
antigênicos para Ac
neutralizantes.

10. LACUNAS
1. Prevalência alta- Presença do vírus ocasionando a
doença?
2. Latente- PMN OU replicação viral ativa?
3.Detecção de doença: PCR-Tempo Real- Oneroso.
4. Assintomatologia ou baixa clínica- 90% dos
casos!!!!!!!!!!!!

11. MATERIAIS E MÉTODOS
• Explicação do método Semi-
quantitativo-PCR: É uma medida
indireta por comparação pareada da
medida dos plasmídeos clonados com
os teores virais da amostra obtida dos
pacientes.

12. CLONAGEM PLASMIDIAL
1. Plasmídio bacteriano pCRII (Invitrogen-USA)
Gene gB com 296 pb- 81874-82176, cepa 169
Dois primers- gB 1 e gB2
PCR convencional: 35 ciclos (Tecne-England)
Eletroforese em gel de Agarose 2%, azul de bromofenol
0,25% em sacarose 40%. Brometo de etídio
Bandas com tamanho de 100pb de peso molecular

13. CLONAGEM
DOS
PLASM
ÍDIOS
Gens
que
conferia
resistência
à
Kanam
icina
e
Am
picilina.
Após
clonagem
e
escolha
dos
plasm
ídios-lise
das
colônias
e
com
paração
do
tem
anho
do
genom
a
por Eletroforese.

14. CLONAGEM

15. MATERIAIS E MÉTODOS
• Sequenciamento- Comparando o genoma do CMV ao
plasmidio-inserto - PCR de sequenciamneto –Thermo
sequenase (Amersham Pharmacia- USA). Armazenada
em computador utilizando o programa SEQ 4x4
Basecaller (Amersham Pharmacia-Canadá) e
WinDNAsis (Hitachi-Japan)- gene gB CMV 169.
• Quantificação dos plasmídios- Espectofotômetro-
absorbância de 290nm.
Diluições decimais variadas.

16. RESULTADOS

17. RESULTADOS-

18. SEQUENCIAMENTO

19. CÁLCULO DO NÚMERO DE PLASMÍDIOS
• Após purificado o plasmídio: 200 mcl-176 mcg
DNA/ml
• Verificação do número de plasmídios no lote: PM
médio de um par de bases nitrogenadas 660 e
multiplicou-se esse valor por n. de pares de bases do
mesmo: 1400190.
• PM do plasmídio: 1400190 g- 6,02 x 10 23 mol
plasmidiais ( N. de Avogadro)
• Número de plasmídio da amostra de DNA 176
mcg/ml-3,83 x 1018.
• Amostras aliquotadas em 50mcl.

20. SENSIBILIDADE DA PCR DAS ALÍQUOTAS

21. CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
• Cálculo para determinar a CV das amostras feito a
partir das densidades das bandas das soluções
decimais.
Ex. Material clínico com banda de 50991 que fica entre
30307 (8670) – 61177 (86700): 30870
• Intervalo entre banda amostral (50991) e banda
plasmidial mais diluída (30307): 20684
• Regra de 3: Intervalo da banda amostral 3870-100%
e 20640 x: 67%

22. CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS

24. DISCUSSÃO
1. Plasmídio clonado mostrou alta homologia com a cepa
de CMV (98%).
2. Leitura das bandas ponto-chave e manter as
concentrações das soluções.
3. Sequenciamneto e diluições lógicas.
Diliução até 867 plasmídios por mcg de DNA mostrou-se
adequada aos graus de infecções agudas..
Baixo custo e rápida.

25. OBRIGADA!