1. Mutagenèse et Mécanismes de
réparation de l’ADN
Michel De Méo
Janvier 2014
UE S6-2
Initiation à la Recherche en Toxicologie
Génétique
IMBE - UMR CNRS 7263 / IRD 237, Faculté de Pharmacie, AixMarseille Université,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05 France

2. Plan du cours
1 – Lésions et Mutations de l’ADN
2 – Systèmes de réparation de l’ADN
3 - Conséquences

3. 1. Lésions de l’ADN : caractéristiques Biochimiques De L’ADN
Double-Brins
ADN: 2 brins antiparallèles liés par des liaisons H (bases)

4. 1. Les lésions de l’ADN
Les lésions de l’ADN sont causées principalement par trois types d’agents:
1.1. Instabilité chimique intrinsèque de l’ADN (lésions spontanées)
1.1.1. Hydrolyse spontanée des nucléotides  sites abasiques
1.1.2. Désamination de C, A, G et 5-méthyl C  formation de U,
1.1.3. Tautomérisation des bases
1.2. Les sous-produits du métabolisme cellulaire (lésions endogènes)
Espèces radicalaires (ROS, O2•, OH•, H2O2)
Lésions variées: bases oxydées et hydroxylées, cassures de brin
1.3. Les agents environnementaux (lésions exogènes)
Soleil (UVA et UVB), Radiations ionisantes, Produits génotoxiques
1.3.1: alkylations des bases
1.3.2. insertion de bases erronées
1.3.3. Intercalations
1.3.4. Pontages (inter- et intra-brins)
1.3.5. Cassures de brins (simples et doubles)
1.3.6. Adduits (petits et volumineux)

5. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN
1.1.1. Hydrolyse spontanée des bases
Hydrolyse de la liaison N-glycosylique
- carbone C1 du sucre et azote N9 de purine (A, G)
- carbone C1 du sucre et azote N1 de pyrimidine (T, C)
-élimination
Sites abasiques
Cassures de brin
2000 – 10 000 adénines/cellule/jour

6. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN
1.1.1. Hydrolyse spontanée des bases
O
N
O
désoxypyrimidine
C1 du sucre et N1 de pyrimidine
(T et C)
N
N
N
N
O
O
O
O
O
N
N
N
désoxypurine
C1 du sucre et N9 de purine
(A et G)

7. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN
1.1.2. Désamination des bases
H2 O
NH2
O
H
N
N
N
O
N
O
NH3
Cytosine
Uracile

8. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN
1.1.2. Désamination des bases
Désamination
Adénine →
Changement
d'appariement
Hypoxanthine
A-T
↓
H-C
Uracile
C-G
↓
U-A
Xanthine
G-C
↓
X-C
Cytosine →
Guanine →
1 - U s’apparie à A
2 - Transition d’une paire G-C en une paire A-T

9. 1.1. Les lésions spontanées de l’ADN
1.1.3. Tautomérisation des bases
1 – Les bases peuvent se présenter sous deux formes tautomères
- Cétone (la plus fréquente)
- Imino (pour A et C) ou Enol (pour T et G, les plus rares)
Déplacement d’un proton et d’une double liaison
2 – tautomérisation spontanée des bases : appariements illicites
- Forme imino de C
appariée avec A (à la place de G)
- Forme énol de T
appariée avec G (à la place de A)
- Forme imino de A
appariée avec C (à la place de T)
- Forme énol de G
appariée avec T (à la place de C)

10. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN
METABOLISME ENDOGENE
PRODUCTION DE ERO (espèces radicalaires de l’oxygène)
Cancer
Vieillissement
Maladies neurodégénératives
(Parkinson; Alzheimer)

11. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN
ERO : hydroxyle OH•; oxyle RO•; péroxyle ROO•; superoxyde
O2•-;péroxyde d’hydrogène H2O2; monoxyde d’azote NO•
Lésions variées :
bases oxydées ou hydroxylées
(8-OH G; Foraminopyrimidines; Glycol de thymine)
Cassures de brin d’ADN (simples et doubles)

12. 1.2. Les lésions endogènes de l’ADN
O2
O
O
H
N
O
Thymine
N
H
O
N
N
CH 3
OH
OH
CH 3
Glycol de thymine

13. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
Lésions qui résultent de l’exposition à des agents génotoxiques
qui sont dans notre environnement :
- Atmosphère (UVs, HAPs)
- Alimentation (nitrosamines, amines aromatiques, mycotoxines)
- Médicaments (agents anticancéreux)
- Produits cosmétiques (nanoparticules, filtres photosensibles)
- Etc…
Xénobiotiques et agents physiques

14. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.1 alkylation des bases
Source: endogène ou exogène
Mécanisme : L’alkylation peut être facilement réalisée sur les bases de l’ADN par
addition de groupes méthyles (-CH3), éthyles (-C2H5) ou alkyles (-CnH2n+1)
DMS; DES; MMS; EMS (exogènes)
S-adénosylméthionine (endogène)
Bases alkylées

15. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.1 alkylation des bases
Principaux sites de liaison des agents alkylants sur la guanine
Pour les quatre bases : 17 sites d’attaque possibles

16. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.2 Insertion de bases erronées
Mécanisme :
une molécule ayant une structure similaire à une base est
incorporée durant la réplication
Exp: 5-bromouracile incorporée à la place d’une T
Mésappariements des bases durant la réplication
exp : A-G

17. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.3 Intercalations
Mécanisme :
incorporation non covalente de molécules planes entre les
plateaux de paires de bases : perte ou addition de bases durant la
réplication
Exp : acridine orange et bromure d’éthidium
BET

18. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.4. Pontages
Mécanisme :
Fixation covalente d’un agent génotoxique comportant
deux sites réactifs
Pontages intrabrins : T-T (UVB); G-G (cis-platine)
Pontages interbrins : G-G (mitomycine C; chlorambucil)
MitC

19. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.5. Cassures de brin (simple et double)
Plusieurs origines :
1. Interaction directe avec un agent génotoxique
exp :
- ERO et CSB
- Radiations ionisantes, radiomimétiques et CDB
2. Processus de réparation et réplication (bases, nucléotides, AF et topoisomérases)
3. Sites abasiques et CSB
CSB
AF : anémie de Fanconi

20. 1.3. Les lésions induites de l’ADN
1.3.6. Adduits
Mécanisme :
fixation covalente d’une entité chimique
électrophile sur un site nucléophile (ADN)
Les bases sont les cibles privilégiées (17 sites potentiels)
Les agents alkylants : adduits peu volumineux
Les amines aromatiques, mycotoxines, HAP : adduits volumineux

21. 1.4. Les conséquences et les effets des lésions
Il existe deux types de conséquences :
2.1. Les lésions qui bloquent la transcription
2.2. Les lésions qui bloquent la fourche de réplication
Il existe deux types d’effets des lésions :
2.3. Les effets immédiats : arrêt du cycle cellulaire
mort cellulaire, apoptose
2.4. Les effets à long terme : mutations et cancers

22. 1.5. MUTATIONS
Une mutation est une modification (lésion) stable et irréversible de l’ADN
Une mutation est transmissible à la descendance
Une mutation est une conséquence de l’incapacité des systèmes de réparation à
restaurer l’ADN
Mutation spontanée pendant la réplication de l’ADN et Mutation induite par
un agent génotoxique
Deux types de mutations : les mutations géniques et les mutations
chromosomiques

23. 1.5. MUTATIONS
1.5.1. Les mutations géniques (ponctuelles)
Substitutions de paires de bases (base pair)
Remplacement d’une paire de bases par une autre
- Transition (Pu par Pu ou Py par Py)
- Transversion (Pu par Py)
Décalage du cadre de lecture (frameshift) des ADN Pol
Addition ou délétion d’un petit nombre de paires de bases ( 2)
entraînant un glissement du cadre de lecture des ADN Polymérases
Mutations non-sens : arrêt prématuré de la synthèse protéique
Mutation mis-sens : changement dans la structure de la Pr
Mutations silencieuses et mutations neutres

24. 1.5. MUTATIONS
1.5.2. Les mutations chromosomiques
Elles concernent de grands fragments d’ADN qui sont visibles en
microscopie optique
Anomalies numériques (aneuploïdie et polyploïdie)
Anomalies structurales
brèches, échanges, délétions, aberrations (cassures, anneaux, échanges)

25. 1.5. MUTATIONS
1.5.3. Les conséquences
1. Cellules germinales
- Avortements spontanés
- Maladies héréditaires autosomales ou liées au sexe
Xeroderma pigmentosum (enfants de la lune)
Maladie de Huntington (Chorée)
Syndrome de Down (mongolisme)
2. Cellules somatiques
- Vieillissement accéléré
- Neurodégénération
- Cancers

26. Mutagenèse et Mécanismes de
réparation de l’ADN
Michel De Méo
Janvier 2014
UE S6-2
Initiation à la Recherche en Toxicologie
Génétique
IMBE - UMR CNRS 7263 / IRD 237, Faculté de Pharmacie, AixMarseille Université,
27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 05 France

27. 2. Lésions de l’ADN, réparations et conséquences
Il existe deux types de conséquences des lésions de l’ADN:
1. Les lésions qui bloquent la transcription sont éliminées par un système spécifique:
La réparation couplée à la transcription (TCR) qui enlève l’ARN Pol bloquée et
assure une réparation prioritaire
2. Les lésions qui bloquent la réplication peuvent être « shunter » par
deux voies:
2.1. Permutation des polymérases
2.2. Permutation des brins (recombinaison homologue)

28. 2.1. Les mécanismes de shunt de la réplication
Brin avancé
Lésions bloquant la réplication
ADN pol delta-epsilon
ADN pol alpha
Brin retardé
Permutation des polymérases
Synthèse effectuée par une
polymérase spécifique (-)
ADN pol dzéta-kappa
Système
Fautif
(cellules somatiques)
Permutation de la matrice
Recombinaison
homologue
Système
Fidèle
(réplication)

29. 2.1. ADN POLYMERASES
Famille Exemples
3’-exonu Taux d’erreurs
(lyase)
A
Pol I, T7, Taq
Oui
B
Fonction
10-5 à 10-6
Réplication
Pol II, RB69, PolB Oui
Pol α, δ, ε
sauf α
10-5 à 10-6
Réplication
C
Pol III (ss unité α) Oui
10-5 à 10-6
Réplication
D
PolD
10-5 à 10-6 ?
Réplication ?
X
Pol β, λ, μ, ζ, TdT Non
10-4 à 10-5
Réparation, Ig, TCR
Y
DinB, UmuCD’,
Dpo4, Dbh,
Pol ζ, η, ι, κ
10-2 à 10-4
Mutagénique, ,TLS
?
Non
procaryotes; archéobactéries; eucaryotes ; TdT : Terminal déoxynucleotidyl transférase
Ig: immunoglobuline; TCR: réparation couplée à la transcription: TLS : synthèse trans-lésion

30. 2.1. Les mécanismes de shunt de la réplication :
Permutation des polymérases (eucaryotes)
1: blocage de la fourche active par le dimère Rad6-Rad18 qui mono-ubiquitine
PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen ou sliding clamp).
2: Ceci augmente l’affinité de PCNA pour Pol η (Pol êta).
3: Pol η est alors activée et opère la synthèse TLS pour shunter la lésion.
4: Après le shunt de la lésion, la réplication par Polδ peut reprendre

31. 3. Les systèmes de réparation de l’ADN
3.1. Systèmes spécifiques
3.1. 1. enzyme répare un seul type de lésion
(alkyltransférases; photolyase)
3.2. Système non spécifiques
3.2.1. BER répare les petites lésions sur les bases; efficace pour éviter
la mutagenèse; adapter pour les lésions endogènes
- altèrent la structure de l’ADN
- interférent avec l’appariement des bases
- bloquent la réplication et la transcription
3.2.3. Réparation des CDB: - Recombinaison homologue (phases S et G2)
- Raboutage (phase G1)
3.2.2. NER répare les lésions qui :
(efficace pour les lésions exogènes)
3.2.4. Réparation des mésappariements
3.2.5. Réparation des pontages interbrins (AF/BCRA)

32. 3.1.1. Alkyltransférases
O6-alkylguanine transférase (AGT)
L’enzyme transfère le groupement alkyl de la guanine méthylée sur une cystéine
localisée dans le centre actif de l’enzyme
Inactivation de AGT et cible pour l’ubiquitination et dégradation par le protéasome
1-méthyladénine et 3-méthylcytosine et 1-éthyladénine
ABH1, ABH2 et ABH3
Déméthylation oxydative

33. 3.1.2. Photolyases
Chez les Bactéries et levures:
Contiennent deux chromophores: Flavine (FADH) et Folate (MTHF) ou
deazaflavine (8-HDH)
Réparent les dimères de pyrimidines et les 6-4 photoproduits
T T
Visible light
T T
Chez l’homme: 6 cryptochromes utilisées comme photorécepteurs circadiens

34. 3.2.1. Réparation par excision des bases (BER)
1. C’est le système de réparation pour les lésions endogènes
(bases modifiées, méthylation, désamination, hydroxylation)
2. C’est le système de réparation le plus important
3. Deux voies distinctes : BER short patch et BER long patch
4. Pas de maladie génétique connue
* Souris « knock out » sur les glycosylases montrent des activité
redondantes sur ces enzymes
* Souris « knock out » sur les enzymes du tronc commun : MORT
FETALE

35. 3.2.1. Réparation par excision des bases (BER)
Mécanisme
A. ERO, méthylation, désamination
ERO, Méthylation,
Désamination
Radiations ionisantes, ERO
(CSB)
B. Sites abasiques
C. CSB, ERO
Hydrolyse spontanée
(sites abasiques)
I. Formation d’un site abasique
II. Formation d’une CSB par APE1 (endoN)
III. Implications de PARP et PNK (CSB)
Short patch
IV. Synthèse par pol ß
V. Elimination du sucre
VI. Synthèse et ligature
(1 base)
Long patch
FRC
VII. synthèse (2-10 bases)
VIII. Suppression
du segment d’origine
IX. ligature
BER short patch
BER long patch
VOIE PRINCIPALE
VOIE MINEURE

36. Animations (Youtube) BER
http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=72oT6N90iWc
Short patch
http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=g4khROaOO6c
Long patch

37. Figure 2 Typical damaged DNA bases and DNA glycosylases acting upon them (Biochemical Journal (1997) 325, 1-16)

38. 3.2.2. Réparation par excision des nucléotides (NER)
1. La NER est le système de réparation qui reconnaît le plus grand nombre
de lésions
2. La NER est adaptée à réparer les lésions d’origine exogène
3. Deux sous-voies principales :
3.1. La réparation globale du génome: le « gardien du génome »
(lente)
3.2. La NER couplée à la transcription (rapide)
4. Maladies génétiques possibles :
Xeroderma pigmentosum
Syndrome de Cockayne
Trichiodystrophie
Xp
CS
TTD

39. 3.2.2. Réparation par excision
des nucléotides (NER)
Mécanisme
I - Reconnaissance de la lésion (bases non appareillées)
II - Formation de simple brin (30 paires de bases) par
hélicases XPB et XPD de TFIIH
III - Stabilisation de l’ADN simple brin par RPA
IV - Élimination du segment lésé (24-32 bases) par endonucléases
ERCC1/XPF (5’) et XPG (3’)
V - Synthèse et ligature

40. Animations NER
http://www.youtube.com/watch?v=bgUH9NfO2QM
Global genome
http://www.youtube.com/watch?v=XjNqqsvUXTw
Transcription coupled repair

41. 3.2.3. Réparation des cassures double brin
CDB dans
réplication
Mécanisme
Recombinaison
Homologue (S, G2)
I. Présentation des extrémités
3’ par le complexe
Radiations
génotoxiques
Raboutage
Raboutage (G1)
Reconnaissance des
extrémités et ligature
(étape V-VII)
II. Assemblée de filaments
III. Homologie, positionnement
et synthèse d’ADN
IV. Ligature
Raboutage
(avec perte ou gain de Nuc,
parfois)
Recombinaison
(sans erreur)

42. Animations
http://www.youtube.com/watch?v=xS6bJMcOrAk
Raboutage
http://www.youtube.com/watch?NR=1&v=jRGPxuo0H30
Recombinaison homologue

43. 3.2.4. Réparation des mésappariements
1. Ce système enlève les mésappariements provoqués par:
- Les ADN polymérases durant la synthèse
- Les boucle d’insertion/délétions (1-10 bases) résultant d’un
glissement durant la réplication de séquences répétitives ou
durant la recombinaison
2. Une seule maladie génétique connue :
Syndrome de Lynch (syndrome de prédisposition héréditaire au
cancer du côlon non polyposique) : HNPCC

44. 3.2.4. Réparation des mésappariements
Mécanisme
1. Reconnaissance des mésappariements
hMSH2/6 reconnaît mésappariements et boucles d’une
seule paire de bases
hMSH2/3 reconnaît les boucles insertion/délétion de
plusieurs bases
2. Recrutement des facteurs spécifiques de la MMR
3. Recherche d’un signal qui identifie le brin fautif
néosynthétisé suivie par sa dégradation après le
mésappariement
4. Resynthèse du brin excisé

45. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins
(de Winter and Joenje, Mutat. Res., 668:11-19, 2009)
Anémie de Fanconi (FA)
Autosomal récessif.
Clinique: nanisme harmonieux
Anomalies cutanées : hyperpigmentation, taches café au lait ..:
Malformations squelettiques dont hypoplasie de l'axe radial
insuffisance médullaire progressive --> aplasie médullaire terminale
Risque néoplasique: LAM et myélodysplasies: 10%, soit risque X 15000; autres cancers
(5%).
Cytogénétique: Cassures chromatiniennes spontanées.
fréquence des cassures augmentée après traitement par agents de pontage interbrins de
l'ADN.
Autres: ralentissement du cycle cellulaire: retard du passage G2-->M.
LAM : leucémies aiguës myéloïdes

46. Les 13 gènes identifiés dans AF
Subtype
Gene
Location
Protein
(amino acids)
Cloning method
Features
A
FANCA
16q24.3
1455
Complementation cloning, positional
cloning
B
FANCB
Xp22.2
859
Protein association
C
FANCC
9q22.3
558
Complementation cloning
D1
FANCD1/BRCA2
13q12.3
3418
Candidate-gene approach
D2
FANCD2
3p26
1451
Positional cloning
Partner of FANCG, contains nuclear
localization signal
Partner of FANCL, contains nuclear
localization signal
Partner of FANCE
Supports RAD51 filament formation, contains
BRC repeats and OB-fold
Monoubiquitinated and phosphorylated
following DNA damage
E
FANCE
6p21.3
536
Complementation cloning
F
FANCF
11p15
374
Complementation cloning
G
FANCG
9p13
622
Complementation cloning
Adaptor protein stabilizing A/G and E/C
interaction
Partner of FANCA, contains TPR motifs
I
FANCI
15q26.1
1328
Positional cloning; candidate-gene
approach
Partner of FANCD2, monoubiquitinated and
phosphorylated following DNA damage
J
FANCJ/BRIP1
17q22-24
1249
Positional cloning
L
FANCL
2p16.1
375
Protein association
M
FANCM
14q21.3
2048
Protein association
Translocase, contains DEAH helicase and
ERCC4/XPF like nuclease domain
N
FANCN/PALB2
16p12.1
1186
Protein association
Partner of BRCA2, essential for stability and
localization of BRCA2
Partner of FANCC and FANCD2, Chk1 target,
contains nuclear localization signal
5′-to-3′ DEAH helicase, unwinds G-quadruplex
DNA structures
E3 ubiquitin ligase, contains RING-finger and
WD40 domains

47. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins
Proteins participating in the FA/BRCA pathway. The FA core complex, which represent the upstream part of the pathway, consists of FANCA, -B,
-C, -E, -F, -G, -L, -M, and two FA-associated proteins FAAP24 and FAAP100. This complex is essential for the monoubiquitination of the FA
proteins FANCD2 and FANCI. In this reaction, FANCL is the E3 ubiquitin ligase and UBE2T is the E2-conjugating enzyme. Monoubiquitinated
FANCD2 and FANCI co-localize in damage-induced nuclear foci with BRCA2, which, together with its binding partner PALB2 and BRIP1
belong to the downstream branch of the pathway. Ubiquitin is removed from FANCD2 and FANCI by the deubiquitinating enzyme USP1.

48. 3.2.5. Réparation des pontages interbrins
Model for the FA/BRCA pathway. (A) The DNA interstrand cross-link prevents further DNA replication and this recruits FANCM and the
FANCD2/FANCI complex independently. (B) The FA core complex associates with FANCM and together with UBE2T monoubiquitinates
FANCD2/FANCI. (C) FANCM translocates along the DNA and processes the stalled replication fork. This creates ssDNA to which more
monoubiquitinated FANCD2 is loaded and generates space for MUS81/EME1 and XPF/ERCC1 to unhook the cross-linked DNA. By cutting 3′ of
the lesion MUS81/EME1 generates a one-ended double strand break. (D) Translesion synthesis (TLS) fills the gap formed by the unhooking step,
while FANCD2 recruits BRCA2 and Rad51 to the one-ended double strand break. Homologous recombination repair (HR) is finally used to
restore the DNA break, which may be stimulated by USP1 mediated deubiquitination of FANCD2. The cross-link adduct is removed by nucleotide
excision repair or by other mechanisms.

49. 4. Déficit des systèmes de réparation
Syndrome
Réparation
type de mutation
Prédisposition au cancer
Xeroderma pigmentosum
NER (±TCR)
mutations ponctuelles
cancer de la peau induit par UV
Syndrome de Cockayne
TCR
mutations ponctuelles
non
Trichthiodystrophie
NER / TCR
mutations ponctuelles
non
Ataxia telangiectasia
réparation DSB
Aberrations chromosomiques
lymphomes
AT-like
réparation DSB
Aberrations chromosomiques
lymphomes
Syndrome de Nijmegen
réparation DSB
Aberrations chromosomiques
lymphomes
BRCA1/BRCA2
HR
Aberrations chromosomiques
cancer du sein
Syndrome de Werner
HR? / TLS?
Aberrations chromosomiques
cancers variés
Syndrome de Bloom
HR?
Aberrations chromosomiques
(SCE)
Leucémies, lymphomes, autres
Syndrome de Rothmund-Thomson
HR?
Aberrations chromosomiques
Ostéosarcomes
Ligase IV
Ligation
Fidélité de recombinaison
Leucémies (?)
HNPCC
MMR
mutations ponctuelles
Cancer colorectal
XP variant
DNA POL H
mutations ponctuelles
cancer de la peau induit par UV
Anémie de Fanconi
FA/BRCA
Aberrations chromosomiques
Leucémies, carcinomes

50. 5. La réponse SOS chez les bactéries
Réparation fautive

51. 5. Lésions de l’ADN, réparations et conséquences
Agent génotoxique
Radiations ionisantes
ROS
Agents alkylants
Lésions spontanées
UV
HAP
Radiations ionisantes
Anticancéreux
(cis-Pt, MitC)
Conséquences
Erreurs de
réplication
Arrêt du
cycle cellulaire
(temporaire)
Inhibition de:
* transcription
* réplication
* ségrégation
des chromosomes
Uracile
Site abasique
Bases altérées
CSB
Excision des bases
(BER)
(6-4) PP
Adduits
Dimères
Pontage
CDB
Excision des nucléotides
(NER)
Réparation
Recombinaison homologue
Raboutage, FA/BRCA
Apoptose
(suicide)
Mésappariements
(A-G; T-C)
Insertion
Délétion
Réparation
des
Mésappariements
Mutations
Aberrations
chromosomiques
Cancer
Vieillissement
Maladies
génétiques