EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS STEM MESENQUIMALES DE PULPA DENTAL RESULTADOS DESCRIPTIVOS
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- 1. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA POSTGRADO DE ENDODONCIA EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS STEM MESENQUIMALES DE PULPA DENTAL RESULTADOS DESCRIPTIVOS Juan Carlos Munévar, Martha Tamayo, Jorge Forero, Astrid Gómez, Diana Dorta, Liliana Rodríguez , Carolina Velandia. GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
- 2. INTRODUCCIÓN Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas de células stem adultas en el ser humano debido a: de células stem adultas en el ser humano debido a: Para la utilización de critoterapia Para la utilización de critoterapia en procesos regenerativos debe en procesos regenerativos debe incrementarse la seguridad y el incrementarse la seguridad y el control de calidad de los métodos control de calidad de los métodos empleados con las células stem. empleados con las células stem. Peter E Murray BSc(Hons), PhD,* Franklin Garcia-Godoy, Regenerative Endodontics: A Review of Current Status and a Call for Action, Regenerative Endodontics, JOE — Volume 33, Number 4, April 2007
- 3. INTRODUCCIÓN Es posible desarrollar cultivos de células embrionarias humanas a partir de óvulos humanos fertilizados no usados en las clínicas de fertilidad. Thomson 1998 Estos cultivos pueden mantenerse por semanas, meses conservando su totipotencialidad Bancos de células para trasplante Thirumala S, Goebel WS, Woods EJ. Clinical grade adult stem cell banking. Organogenesis 2009; 5(3): 143-154. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from human Blastocysts. Science 1998; 282: 1145.
- 4. INTRODUCCIÓN Gronthos S. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 y Iohara K J Dent Res. 2004; 83(8):590-5. Evaluar métodos de criopreservación de células stem de pulpa dental para que puedan ser congeladas durante largos períodos de tiempo y posteriormente ser utilizadas en REPARACIÓN y REGENERACIÓN TISULAR. Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Booyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 Iohara K. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.
- 5. INTRODUCCIÓN Freshney R., 2000 Freshney R.Ian. Culture of animal cell a manual of basic technique. 4ta edición. Canada. Jhon Wiley & Sons, INC,. Publication. 2000: 297-308. Woods EJ, Benson JD, Agca Y, Critser JK. Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology. 2004; 48(2):146-56.
- 6. INTRODUCCIÓN Se ha demostrado que DPSCs conservan su viabilidad y su capacidad para diferenciarse después de la criopreservación lo cual significa que es posible congelar las células stem de pulpa dental para futuras aplicaciones terapéuticas. Zhang et al/2006 Zhang et al/2006 Zhang X, Mitsuru A, Igura K, Takahashi K, Ichinose S, Yamaguchi S, et al. Mesenchymal progenitor cells derived from chorionic villi of human placenta for cartilage tissue engineering. Biochem Biophys Res Commun. 2006; 340(3): 944-52.
- 7. INTRODUCCIÓN Perry BC et al/2008 Se relaciona con variables como especie, tipo y estadio de diferenciación de la célula a congelar El éxito de la criopreservación es (MSC) menor inversamente correlacionado con la cantidad de complejidad de los sistemas biológicos congelados nutrientes Perry BC, Zhou D, Wu X, Yang FC, Byers MA, Chu TM, et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Eng Part C Methods. 2008; 14(2):149-56.
- 8. OBJETIVO GENERAL El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de dos métodos de criopreservación a tres tiempos diferentes y determinar el porcentaje de viabilidad y preservación del fenotipo de células STEM mesenquimales de origen pulpar
- 10. MATERIALES Y METODOS TIPO DE ESTUDIO Estudio Experimental in vitro exploratorio
- 11. MATERIALES Y METODOS Criterios de inclusión Criterios de inclusión Consentimiento informado
- 12. MATERIALES Y METODOS UNIVERSIDAD DEL BOSQUE UNIVERSIDAD DEL BOSQUE FACULTAD DE ODONTOLOGIA FACULTAD DE ODONTOLOGIA POSTGRADO DE ENDODONCIA POSTGRADO DE ENDODONCIA FORMATO PARA CONSENTIMIENTO INFORMADO FORMATO PARA CONSENTIMIENTO INFORMADO Esta es una forma de aceptación para participar en una investigación, que yo firmo libremente estando de Esta es una forma de aceptación para participar en una investigación, que yo firmo libremente estando de acuerdo con los siguientes aspectos: acuerdo con los siguientes aspectos: ••Hesido informado yyentendido que el objetivo de esta investigación en la que se solicita mi participación He sido informado entendido que el objetivo de esta investigación en la que se solicita mi participación consiste en aislar yy caracterizar las células “Stem” de la pulpa dental. Por lo tanto se requiere dientes consiste en aislar caracterizar las células “Stem” de la pulpa dental. Por lo tanto se requiere dientes naturales que serán extraídos por indicaciones de mi odontólogo tratante (con fines Ortodónticos o naturales que serán extraídos por indicaciones de mi odontólogo tratante (con fines Ortodónticos o terceros molares incluidos). terceros molares incluidos). ••Loscostos del procedimiento clínico de extracción indicada corren aami cargo. Los costos del procedimiento clínico de extracción indicada corren mi cargo. ••En caso que me retire de la investigación, tengo derecho aacontinuar con mi tratamiento yyaaser tratado En caso que me retire de la investigación, tengo derecho continuar con mi tratamiento ser tratado en la misma forma que si continuara haciendo parte de la investigación. en la misma forma que si continuara haciendo parte de la investigación. ••Estoy consiente que estos dientes que me serán extraídos, van aa ser desechados en caso de no ser Estoy consiente que estos dientes que me serán extraídos, van ser desechados en caso de no ser utilizados en esta investigación, por tanto estoy de acuerdo en donarlos para la realización de este utilizados en esta investigación, por tanto estoy de acuerdo en donarlos para la realización de este estudio. estudio. ••Aceptovoluntariamente participar yysin mas beneficios que los pactados previamente. Acepto voluntariamente participar sin mas beneficios que los pactados previamente. Para constancia firmo el presente consentimiento informado, en la ciudad de_______________, aa los Para constancia firmo el presente consentimiento informado, en la ciudad de_______________, los ______ días del mes de ______________ de___________. ______ días del mes de ______________ de___________. Firma yyC.C. Firma C.C. _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ Paciente Paciente Testigo Testigo ________________________________ ________________________________ _____________________________ _____________________________ Firma del investigador responsable: Firma del investigador responsable: _____________________________ _____________________________
- 13. MATERIALES Y METODOS Criterios de Criterios de exclusión exclusión
- 14. MATERIALES Y METODOS OBTENCIÓN DE LA MUESTRA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Procedimientos realizados en la Clínica el Bosque Luego de la exodoncia se sumergió el diente en NaOCl 5% y solución salina
- 15. MATERIALES Y METODOS Pulpa sin fragmentar en el vial Cabina de flujo laminar Pulpa dental sin fragmentar
- 16. MATERIALES Y METODOS DISGREGACIÓN MECÁNICA VIABILIDAD CELULAR CÁMARA DE NEUBAUER CONTEO CELULAR
- 17. MATERIALES Y METODOS Disgregación enzimática Disgregación enzimática y selección magnética y selección magnética en MACS en MACS
- 18. MATERIALES Y METODOS Las células stem de pulpa dental CD105+ fueron cultivadas en un total de 90 pozos Cada experimento se distribuyo en 18 pozos por 5 experimentos Incubación 37ªC, Atmósfera húmeda 5% de CO², 70% confluencia celular
- 20. MATERIALES Y METODOS CRIOPRESERVACIÓN Método de Kamath, A. SC Protocol Sheet: 00007 Método de Papaccio y col. 2006 Part of Thermo Fisher Scientific. Cellular engineering technologies, Inc.) Se desprende las células de la monocapa con Retiro de monocapa se lava con PBS EDTA 0.02% en PBS 10ml/75cm2 Se realiza conteo celular en hemocitometro Se agrega 5ml de solución de tripsina Se coloco la suspensión celular en solución de Incubación enzimática a 37ºC por 5 minutos criopreservacion DMSO 10% en SFB Se deposita la suspensión celular en un criovial Se agrega 5ml NH CFU-F y se centrifuga a 4ºC por 2hrs, luego pasa de -70ºC por 16hrs, 200rpm por 10 minutos Finalmente -180ºC en nitrógeno liquido hasta el Conteo celular en hemocitometro proceso de descongelación Se sumerge las células en solución de criopreservaiciónDMSO 10%, SFB 70% y 20% NH CFU-F nitrógeno liquido
- 21. MATERIALES Y METODOS PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino yy 20% de NH Expansion Medium. Se La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino 20% de NH Expansion Medium. Se centrifugó aa200 ggdurante 10 minutos la suspensión celular obtenida. centrifugó 200 durante 10 minutos la suspensión celular obtenida. Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en 55ml de medio de cultivo NH Expansion Medium yyasí realizar Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en ml de medio de cultivo NH Expansion Medium así realizar la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad yyfenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo. la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad fenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo.
- 22. MATERIALES Y METODOS EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN Evaluación de la viabilidad mediante exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D) Fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la suspensión de células DPSCs sometidas a 2 procesos distintos de criopreservación en 3 tiempos diferentes. (FACS CANTO II Becton & Dickinson) Marcaje fue leído en citómetro de flujo en U.I.B.O. en la Universidad El Marcaje fue leído en citómetro de flujo en U.I.B.O. en la Universidad El Bosque, reportando cada dato como porcentaje para cada marcador en Bosque, reportando cada dato como porcentaje para cada marcador en cada condición. cada condición.
- 24. RESULTADOS
- 25. RESULTADOS Morfología in vitro de fibroblastos Morfología in vitro de células de la pulpa dental humana. Stem de pulpa dental Microscopia De Contraste De Fase
- 26. RESULTADOS Morfología in vitro de células Unidad formadora de Stem de pulpa dental . colonias DPSCs MICROSCOPIO INVERTIDO
- 27. RESULTADOS Tabla 3 .Datos descriptivos de recuentos celulares de DPSCs* y viabilidad Pre y post descongelación . 24 HORAS 7 DIAS 1MES Métodos Experimento Pre Pos Pre Pos Pre Pos Método 1 207500 DPSCs 145250DPSCs 330000 DPSCs 231000 DPSCs 387000 DPSCs 1352 DPSCs 1 430000 DPSCs 301000 DPSCs 447500 DPSCs 313250 DPSCs 585000 DPSCs 4414 DPSCs 2 162000DPSCs 50000 DPSCs 140000 DPSCs 120000 DPSCs 162000 DPSCs 3666 DPSCs 3 Promedio 266500 165417 305833 221417 378000 3144 +143411 DPSCs +126709 DPSCs +155168 DPSCs +96981 DPSCs +211644 DPSCs +1596 DPSCs DS Método 2 235000 DPSCs 80000 DPSCs 150000 DPSCs 100000 DPSCs 77500 DPSCs 762 DPSCs 1 2 180000DPSCs 80000 DPSCs 180000 DPSCs 50000 DPSCs 1850000 DPSCs 0 DPSCs Promedio 207500 80000 165000 75000 963750 381 + 38891DPSCs + 0 DPSCs +21213 DPSCs +35355 DPSCs +1253347 DPSCs +539DPSCs DS *Células Stem de Pulpa Dental
- 28. RESULTADOS 99.9% 96.6% 95.4% 98.1% 98.8% 100% Evaluación Viabilidad Y Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo de Método de Papaccio 2006
- 29. RESULTADOS 94.9% 99.3% 93.0% 97.3% 98.9% 98.9% Evaluación Viabilidad Y Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo de Método de Kamath 2007
- 30. RESULTADOS Resultados Porcentaje De Viabilidad De Células DPSCs Posterior Al Análisis Por Citometría De Flujo Del Método De Criopreservación De Papaccio Et Al, 2006 Y Kamath 2007
- 31. RESULTADOS Promedio De La Expresión De Marcadores Que Evalúan El Fenotipo En Células DPSCs Por Citometría De Flujo Del Método De Criopreservación De Papaccio Y Col/2006
- 32. RESULTADOS Promedio De La Expresión De Marcadores Que Evalúan El Fenotipo En Células DPSCs Por Citometría De Flujo Del Método De Criopreservación De Papaccio Y Col/2006 Y Kamath A.
- 34. DISCUSIÓN TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN Woods y col/2009 Nuestro estudio 1 semana, 1 mes, 1 día, 1 semana, 6 meses 1 mes Woods EJ, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157.
- 35. DISCUSIÓN METODOLOGÍA METODOLOGÍA Seo BM., Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S, et al. Recovery of Stem Cells from Cryopreserved Periodontal Ligament. J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912.
- 36. DISCUSIÓN Woods EJ, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157.
- 37. DISCUSIÓN CULTIVO CELULAR CULTIVO CELULAR En nuestro estudio DPSCs presentaron morfología estrellada, diámetro mayor al de los fibroblastos, núcleo esférico definido y no se observaron refringentes. Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis. 2008; 14: 431-442.
- 38. DISCUSIÓN VARIABLES: Viabilidad y Fenotipo VARIABLES: Viabilidad y Fenotipo
- 40. CONCLUSIONES
- 41. CONCLUSIONES
- 42. RECOMENDACIONES
- 43. RECOMENDACIONES
- 44. AGRADECIMIENTOS
- 45. AGRADECIMIENTOS
- 46. AGRADECIMIENTOS
- 47. “Aunque hoy es un día de mucha alegría también sentimos tristeza porque nos separamos de estas grandes personas, de nuestros compañeros graduandos, porque así lo indica el transcurrir de la vida, pero tengan la seguridad que jamás faltaran los recuerdos de los momentos vividos y compartidos y que los tendremos en nuestros corazones con el mayor sentimiento de gratitud”
Notas del editor
- FOTO 1: (MAS OSCURA) OBTURACION POR STEM CELLS DEL CANAL RADICULAR LUEGO DE LA IRRIGACION CON HIPOCLORITO DE SODIO AL 6% Y 17%EDTA. 2FOTO (MAS CLARA): TEJIDO PULPAR EN CRECIEMIENTO EN LABORATORIO EL CUAL PUEDE SER IMPLANTADO QUIRUGICAMENTE PARA CORREGIR CIERTO TIPO DE PATOLOGIAS PULPARES. Obturación de células madre de los conductos radiculares después de la irrigación de raíz la dentina con un 6% NaOCl y el 17% EDTA. Periodontal células madre se sembraron en la dentina de la matriz de una semana en un incubador de cultivo de tejidos en ausencia de un andamio. Este tratamiento imita el uso de células de la mucosa oral para el reemplazo tejido pulpar después de la limpieza y conformación (sin publicar).
- Thmson en 1998 en su estudio resalto las caracteristicas de la stem cells : Es posible desarrollar cultivos de células embrionarias humanas a partir de óvulos humanos fertilizados no usados en las clínicas de fertilidad, Estos cultivos pueden mantenerse por semanas, mese conservando su totipotencialidad, Bancos de células para trasplante Se ha encontrado que poseen capacidad de proliferacion prolongada en condicion de indiferenciacion, presentan celulas con nucleolo prominente, son estables para formar celulas de capas germinales y se presentan como celulas con alta relacion nucleo citoplasma
- Gronthos en el 2002 y iohara en el 2004 refieren que el fenotipo de las DPSCs esta siendo caracterizado por medio de la evaluacion de la expresion de marcadores especificos como son CD105+, CD34-, CD45- y CD73 con el fin de desarrollar optimos metodos de cultivo celular y expanscion celular y de esta fomra evaluar metodos de criopreservacion de celulas stem de pulpa dental para que puedan preservadas durante mucho mas tiempo y posteriormente ser utlizadas en reparacion y regeneracion tisular “ Evaluar 2 métodos de criopreservacion de células stem de pulpa dental para que puedan ser congeladas durante largos períodos de tiempo (>1 año) manteniéndolas viables y con sus propiedades biológicas intactas para ser utilizadas en terapias de regeneración tisular”
- La criopreservación consiste en el proceso para el congelamiento de células stem con el fin de reducir su actividad metabólica y mantenerlas a temperaturas reducidas durante tiempos prolongados, preservando al mismo tiempo su viabilidad, fenotipo y potencial de diferenciación. Por esta razón, la criopreservación desempeña un papel esencial porque permite conservar durante mucho más tiempo y utilizando una menor cantidad de reactivos una elevada cantidad de células. Además las células stem mesenquimales luego de descongeladas pueden ser subcultivadas durante varios pasajes sin evidenciar pérdida de viabilidad o alteración del potencial de diferenciación
- Se ha demostrado que DPSCs conservan su viabilidad y su capacidad para diferenciarse después de la criopreservación lo cual significa que es posible congelar las células stem de pulpa dental para futuras aplicaciones terapéuticas. En un estudio de Zhang et al en el 2006 no se reporto la perdida en la capacidad de diferenciacion de las celulas stem de pulpa dental de tercero molares congelados comparados con controles no congelados , luego de 2 años estas celulas matuvieron su potencial de proliferacion y diferenciacion en linajes de celulas especificos.
- La obtención de un protocolo ideal para criopreservar depende del conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la célula y/o el tejido puesto que este proceso se relaciona con diferentes variables como especie, tipo y estadio de diferenciación de la célula a congelar. Las células tienen diferente tamaño y manejan diferente composición de solutos y en general el éxito de la criopreservación es inversamente correlacionado con la complejidad de los sistemas biológicos congelados, en el caso de las células stem mesenquimales que poseen una complejidad en su estructura, morfología tipo fibroblastoide y gran tamaño, requieren una menor cantidad de nutrientes (aportados en este caso por el suero fetal bovino) para su mantenimiento durante el estado de criogenia. 14
- El propósito de este estudio es evaluar el efecto de dos métodos de criopreservación a tres tiempos diferentes y determinar el porcentaje de viabilidad y fenotipo de células STEM mesenquimales de origen pulpar
- Este estudio es de tipo experimental in vitro exploratorio
- En los criterios de inclusion se tomaron pacientes entre los 14 y 30 años con previa firma del consentimiento informado, pacientes con exodoncias indicadas por ortodoncia,dientes premolares y 3 molares sanos, pacientes sistemicamente sanos. Entre los criterios de inclusion para los cultivos se tomaron celulas de stem cells de pulpa dental que presentaran una viabilidad mayor a 1x10 a la 7. los pacientes menores de edad fimraron sus acudientes el consentimiento informado
- En los criterios de exclusion: pacientes q tuvieron complicaciones quirurgicas como odontoseccion, o que no firmaron el consentimieno informado ya que no querian participar en el estudio, en el cultivo se descartaron las muestras que se contaminaron por diversas razones,
- Todos los procedimientos fueron realizados en la clinica el bosque por un cirujano o residente de postgrado de cirugia o estudiantes de pregrado, posteriormente luego de la exodoncia diente se sumergió en hipoclorito de sodio al 5% durante 5 segundos en series de tres repeticiones, se lavó con solución salina. Los dientes fueron tomados por la corona y seccionados (con una fresa Zecrya en una pieza de alta velocidad sin refrigeración, bajo irrigación manual constante con solución salina) transversalmente a nivel de la unión amelocementaria, dando como resultado una porción coronal y otra radicular
- Luego se saca la pulpa de los fragmentos coronal y radicular con cucharillas y pinzas para depositarlos en un criovial suplementado con DMEM Penicilina 100U/ml /estreptomicina 100 µg /ml y anfotericina 2,5 µg/ml. estas muestras se llevaron al laboratorio de la Unidad de Investigación Básica Oral (UIBO) donde se trabajó en la cabina de de flujo laminar bajo el protocolo de esterilidad estipulado por el laboratorio de cultivo,
- La pulpa dental sin fragmentar, fue depositada al interior de los Medicon en donde se agrego 1 ml de DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% y antibióticos. Luego de realizar la disgregación mecánica, se realizo el conteo celular y se determino la viabilidad celular en cámara de Neubauer.
- Después de obtener un promedio de 1x10 7 células del tejido disgregado de pulpa dental humana, fueron resuspendidas en 80 µ l de buffer MACS (Miltenyi Biotec) (Solución stock MACS BSA + solución de lavado Auto MACS, dilución 1:20). Se le agregaron 20 µ l de anticuerpo conjugado a microperlas magnéticas se incubo a 4° C durante 15 minutos, se centrifugó a 200 gravedades durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en 500 µ l de buffer MACS se dejó pasar a través de la columna magnética, la fracción que paso a través de la columna se recolectó (Fracción negativa), esta suspensión se cultivó para ser utilizada como control negativo en las pruebas de citometría de flujo. La fracción eluida recolectada correspondió a la fracción enriquecida de células stem mesenquimales de pulpa dental CD 105+. Las células stem mesenquimales DPSCs, en cultivo fueron disociadas enzimáticamente, con tripsina al 0.25 mg/ml, EDTA 0.3mM. Se obtuvo una población celular heterogénea a partir de fragmentos de pulpa dental humana que se sometieron a disgregación mecánica con Medimachine o disociación enzimática La suspensión celular heterogénea se sometió a separación magnética por medio de la tecnología Miltenyi MINIMACS para aislar únicamente las células DPSCs CD105+, pero se presentaron varios inconvenientes que arrojaron resultados negativos para este procedimiento. - La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos.
- Las células stem de pulpa dental CD105+, fueron cultivadas en un total de 90 pozos, cada experimento se distribuyó en 18 pozos por 5 experimentos. Luego de 1 hora de adhesión en la incubadora se agregaron 500µl de medio NONHEMATOPOIETIC (NH) STEM CELL MEDIA (NH CFU-F Médium Miltenyi Biotec) y se dejaron en incubación a 37 °C, atmósfera húmeda y 5% de CO², hasta obtener un 70% de confluencia celular. Se revisó y se cambió el medio (NH STEM CELL EXPANSION MEDIA) cada cuatro días para observar proliferación, confluencia celular y descartar contaminación, observando al microscopio de contraste de fase a 20X y 40X.
- Tabla de distribucion de los 2 metodos de criopreservacion a 3 tiempo distintos
- - Criopreservación Protocolo de criopreservación N° 1 (Adaptado de Papaccio y col. 2006) Las células se desprendieron de la monocapa usando una solución de EDTA al 0.02% en PBS (solución salina tamponada de fosfato, pH 7.4). Se realizó el conteo celular en hemocitómetro. Se preparó la solución de criopreservación (10% Dimetilsulfóxido (DMSO) en Suero fetal bovino (SFB). La suspensión celular (250.000 células stem/ml de solución de criopreservación) se depositó en un criovial que se mantuvo a 4 °C durante 2 horas, luego se transportó a -70 ºC durante 16 horas, para posteriormente llevarlo a –180ºC en nitrógeno liquido hasta que se efectúe la descongelación. Después de cada uno de los tiempos de criopreservación estipulados (1 día, 1 semana y 1 mes), las células fueron descongeladas rápidamente agregando 1 ml de medio de cultivo a 37 °C, luego la suspensión celular se completa con 10 ml del medio suplementado. Se centrifuga a 1200 rpm durante 10 minutos. Se retira el sobrenadante y el sedimento se resuspende suavemente en 1 ml de medio de cultivo NH STEM CELL EXPANSION MEDIA se toman 100 µl para efectuar la inmunofenotipificación por citometría de flujo. Y el restante de la suspensión celular fue llevado en una caja de cultivo a 37°C en atmósfera 5% de CO2. Protocolo de criopreservación N° 2 (Adaptado de Kamath, A. SC Protocol Sheet: 00007 Part of Thermo Fisher Scientific. Cellular engineering technologies, Inc.) Se retiró el medio de cultivo de la monocapa y se lavó con PBS agregando 10 ml / 75 cm 2 , siendo cuidadoso para no desprender las células. Se retira y descarta el PBS. Luego se agregaron 5 ml de solución de tripsina (0.25%) (Termo Scientific HyClone, SH30042.01). Se incubó el cultivo con la solución enzimática a 37°C durante 5 min. Posteriormente, se agregaron 5 ml de NH CFU-F Médium. Se mezclaron suavemente hasta que se desprendieron las posibles uniones célula-célula o célula-plástico de la caja de cultivo para obtener una solución celular homogénea. Para eliminar el efecto la tripsina se centrifuga a 200g durante 10 minutos. Se descarta el sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en medio NH STEM CELL EXPANSION MEDIA, precalentado a 37° (5 ml por cada caja de cultivo de 75 cm 2 ). Se realizo el conteo celular a partir de 30 µL de suspensión celular y 30 µL de Azul Tripán, en cámara de Neubauer. Se preparó en 1 criovial por cada 100.000 células/1 ml de solución de criopreservación (DMSO 10%, 70% SFB y 20% NH CFU-F Médium) Trasladar a -80 °C los viales recién preparados durante 24 horas y por ultimo llevarlos a nitrógeno líquido, por el tiempo establecido. Para comprobar la eficiencia del protocolo de criopreservación después de los tres periodos establecidos (1 día, 1 semana y 1 mes), las células se descongelaron a 37ºC en baño serológico, después se incorporaron con 3 ml de NHEM con el fin de retirar la solución de congelamiento, se centrifugan a 1200 RPM 7 minutos, se retira el sobrenadante, se resuspende el sedimento en 3 ml de NHEM. Para un mejor lavado se repite el último procedimiento. Se realizó el conteo celular y se determinó la viabilidad celular en cámara de Neubauer con Azul Tripan. Se toman 100 µL para realizar la caracterización en citometría de flujo y el restante de la suspensión celular se sembró en caja de cultivo y se deja en adhesión con medio de cultivo NHEM 1 hora en incubadora a 37 ºC, atmósfera húmeda y 5% CO2 y finalmente se agregaron 500 µl de NHEM.
- Se retiraron los crioviales de DPSCs que se encontraban a -196 o C de los tanques de nitrógeno líquido. Inmediatamente se depositaron los crioviales en baño María bajo agitación moderada y constante hasta que se observó una suspensión celular sin restos de hielo. Cada vial se desinfectó con alcohol al 100%. Bajo la cabina de flujo laminar se abrió cada criovial para transferir el contenido en tubos Falcon de 15 ml. Se agregó muy lentamente 10 ml de solución de descongelamiento precalentada a la suspensión celular obtenida. La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino y 20% de NH Expansion Medium. Se centrifugó a 200 g durante 10 minutos la suspensión celular obtenida. Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo NH Expansion Medium y así realizar la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad y fenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo.
- Se efectuó por citometría de flujo (FACS CANTO II Becton & Dickinson) la evaluación de la viabilidad mediante exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D) y el fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la suspensión de células DPSCs sometidas a 2 procesos distintos de criopreservación en 3 tiempos. Posteriormente el marcaje fue leído en el citómetro de flujo de los laboratorios de investigación de la Universidad El Bosque a 480-620 nm, reportando cada dato como porcentaje para cada marcador en cada condición.
- LA TABLA MUESTRA EL REGISTRO DE LAS VARIABLES REGISTRADAS EN EL MOMENTO DE OBTENCION DE LA MUESTRA ENTRE LAS CUALES ESTA edad del paciente, tipo de diente, tiempo de obtención de la muestra y tiempo de procesamiento REPRESENTADAS EN PROMEDIO Y DS.
- Posterior al cultivo celular las células provenientes de pulpa dental humana en microscopia de contraste de fase se observaron birrefringentes, presentaron una morfología fibroblast-like(foto 2), aspecto fusiforme con evidentes prolongaciones citoplasmáticas, la relación núcleo/citoplasma de 1/3
- Al microscopio invertido las células DPSCs presentaron una morfología estrellada, un diámetro mayor al de los fibroblastos,(foto1) con un núcleo esférico definido y no se observaron refringentes. Además en algunos pozos de las cajas de cultivo se observo la formación de Unidades Formadoras de Colonias (CFU-F). (foto 2)
- y se observo en los resultados que para los tres experimentos del primer método de criopreservación se identifica mayor número de células en el experimento 2 en los tres tiempos de criopreservación antes y después de la congelación, para el segundo método de criopreservación donde se observa mayor cantidad de células antes de la congelación tanto para los dos experimentos comparado con el número de células después de la congelación
- Citometria de flujo donde a la derecha (del espèctador) se observa la evaluacion de la viabilidad a las 24 horas (donde se ve rojo y azul) y al lado izquierdo vemos en este mismo tiempo la conservacion del fenotipo de las celulas viables .. Abajo derecha de igual forma se observa la evaluacion citometrica dela viabilidad a los 7 dias de este metodo, y ala izquierda el fenotipo (que se ven los diferentes marcadores)
- Citometria de flujo donde a la derecha (del espèctador) se observa la evaluacion de la viabilidad a las 24 horas (donde se ve rojo y azul) y al lado izquierdo vemos en este mismo tiempo la conservacion del fenotipo de las celulas viables .. Abajo derecha de igual forma se observa la evaluacion citometrica dela viabilidad a los 7 dias de este metodo, y ala izquierda el fenotipo (que se ven los diferentes marcadores)
- Graficas miuestran en porcentaje la viabilidad celular post congelacion de los dos metodos donde se usasron los reactivos 7AAD+ y 7AAD- que fueron adicionados a cada uno de los tubos (representados en las columnas con color naranja para el 7AAD+ y morado para 7AAD-) y se consideró que había viabilidad cuando el reactivo 7AAD- (morado) no se incorporó en la membrana. Y se observa que el método de Papaccio et al, 2006(grafica de la izquierda) obtuvo los mayores promedios de viabilidad al mes cuando se compara con el método de Kamath 2007(grafica derecha) , no obstante este último mostró mejores resultados para las 24 horas y 7 días, con un promedio de 65,5% y 56% respectivamente
- El estudio de Woods y col/2009 también evaluó 3 tiempos de criopreservación (1 semana, 1 mes y 6 meses) estableciendo que las DPSC, pueden ser almacenadas a -85°C y -196°C durante por lo menos 6 meses manteniendo sus propiedades biológicas. Se requieren más estudios con ensayos cuantitativos para determinar si la temperatura de almacenamiento tiene más efecto en la biología y fisiología celular.
- En nuestro estudio, previa criopreservación de las muestras se realizó el procedimiento de disgregación de tejido, bajo el método de disociación Mecánica (Medimachin) y/o enzimática, semejante a la realizada por Woods et al/2009. Sin embargo, estudios previos como el realizado por M. Seo et al/2005 difieren en esta metodología ya que la criopreservación es realizada directamente sin antes disgregar el tejido.
- En cultivo celular las DPSCs se caracterizan por su capacidad de adhesión y elevada proliferación. En nuestro estudio las células DPSCs presentaron una morfología estrellada, un diámetro mayor al de los fibroblastos, con un núcleo esférico definido y no se observaron refringentes. Además en algunos pozos de las cajas de cultivo se observó la formación de Unidades Formadoras de Colonias (CFU-F), al igual que se corroboran en el estudio de Polisetty et al/2008 donde las células cultivadas tienen la capacidad para la formación de CFU que puede aumentar o disminuir con los números de pasajes.
- Para evaluar la viabilidad y fenotipo celular se efectuó por citometría de flujo (FACS CANTO II Becton & Dickinson) la evaluación de la viabilidad mediante exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D) y el fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la suspensión de células DPSCs sometidas a 2 procesos distintos de criopreservación en 3 tiempos. Se marcaron las DPSCs con los anticuerpos 7-AAD, anti CD 105, anti CD 73, anti CD 45 y anti CD 34. Estos datos difieren con la metodología del estudio de Temmerman et al/2009, puesto que evalúan la viabilidad con valores de acuerdo al porcentaje de confluencia alcanzado en el primer pasaje y no evalúan el fenotipo celular con sus respectivos marcadores.