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ABSTRACT
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biofarmacé...
Posterior a esto se procede con los protocolos de
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Hoy en día, las proteínas en la mayoría de los casos
se identifican con base en datos de espectrometría de
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Los requisitos para tal método de tinción serían:
 la rapidez
 la visibilidad de las proteínas teñidas a la luz
natural
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RESULTADOS
 595 nm
 Es necesario remover
el colorante de las
proteínas después de
la tinción
 Tres horas son
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PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN
COVALENTE Y LAS PROPIEDADES
ELECTROFORÉTICAS DE PROTEÍNAS
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VENTAJAS DEL UNIBLUE A
 La movilidad electroforética de las proteínas no se
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  1. 1. ACCELERATED IDENTIFICATION OF PROTEINS BY MASS SPECTROMETRY BY EMPLOYING COVALENT PRE-GEL STAINING WITH UNIBLUE A Marco A. Mata-Gómez,Matthew T. Yasui,Armando Guerrero-Rangel,Silvia Valdés-Rodríguez, Robert Winkler
  2. 2. ABSTRACT La identificación de proteínas por espectrometría de masas es un método estándar de control de calidad biofarmacéutica y la investigación bioquímica. Antes de la identificación por espectrometría de masas, las proteínas por lo general se pre-separaron por electroforesis.
  3. 3. Posterior a esto se procede con los protocolos de tinción de proteínas y debido a que estos consumen mucho tiempo se debe prolongar el tiempo de preparación de muestras para espectrometría de masas. Se investigaron las propiedades electroforéticas de proteínas y péptidos derivatizados y se estudio su comportamiento en la espectrometría de masas.
  4. 4. INTRODUCCIÓN los medicamentos falsos amenazan la salud de los pacientes, Esto hace que se genere una necesidad sobre la confirmación de la identidad de las moléculas. Especialmente para los laboratorios que trabajan con las proteínas, ya que éstas están generalmente purificadas a partir de mezclas complejas y difíciles de distinguir por sus propiedades bioquímicas.
  5. 5. Hoy en día, las proteínas en la mayoría de los casos se identifican con base en datos de espectrometría de masas (MS), ya que los métodos actuales de la EM ofrecen alta sensibilidad, velocidad y precisión y por lo tanto permiten conclusiones fiables sobre la naturaleza de una proteína en un plazo razonable.
  6. 6. Por lo general, las proteínas tienen que ser separadas previamente, antes de que puedan ser sometidos a análisis de MS. Esto se hace de manera eficiente por electroforesis en gel, que tiene la ventaja adicional para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular tales como sales.
  7. 7. la tinción con Coomassie coloidal es actualmente el método de elección , si las muestras están destinados para su posterior análisis mediante espectrometría de masas . Sin embargo , teniendo en cuenta los protocolos más rápidos , a tres horas son necesarias para la tinción de Coomassie coloidal, y otras cuatro horas para la preparación de piezas de gel seleccionados para MS
  8. 8. Los requisitos para tal método de tinción serían:  la rapidez  la visibilidad de las proteínas teñidas a la luz natural  la compatibilidad con la electroforesis en gel  la compatibilidad con la espectrometría de masas y de procesamiento de datos de los flujos de trabajo actuales  adopción simple de los procedimientos de laboratorio existentes.
  9. 9. RESULTADOS  595 nm  Es necesario remover el colorante de las proteínas después de la tinción  Tres horas son necesarias para la tinción de Coomassie coloidal  593.5 nm  No es necesario remover el colorante de las proteínas después de la tinción  El tiempo requerido para el análisis de proteínas puede ser reducido sustancialmente Coomassie Uniblue A
  10. 10. PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN COVALENTE Y LAS PROPIEDADES ELECTROFORÉTICAS DE PROTEÍNAS DERIVATIZADAS Uniblue A  solubilidad en agua  disponibilidad comercial con la pureza adecuada  bajo precio
  11. 11. SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) Permite separar proteínas haciéndolas pasar por un gel o resina: poliacrilamida de sodio Dodecil Sulfato, la cual es un agente entrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las proteínas.
  12. 12.  sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE Al aplicar un campo eléctrico a la muestra inmersa en el tampón de carga, el complejo proteína-SDS migrará hacia el polo positivo y se separará según su tamaño. Los polipéptidos de menor peso molecular migrarán más rápido. Los de alto peso lo harán más lentamente.
  13. 13. RITUXIMAB Es un quimérico anticuerpo monoclonal contra la proteínaCD20 , que se encuentra principalmente en la superficie del sistema inmune células B . son proteínas creadas a través de la unión de dos o más genes que originalmente codificaban proteínas diferentes.
  14. 14. LA SEPARACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)  Figura A. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con Uniblue A. Muestra de Rituximab, un anticuerpo recombinante.  Figura B. Visualización de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Muestra Rituximab, un anticuerpo recombinante.
  15. 15. VENTAJAS DEL UNIBLUE A  La movilidad electroforética de las proteínas no se cambia de manera significativa por su tinción covalente  Por SDS-PAGE la intensidad de la tinción y la resolución son perfectamente adecuadas.  La carga negativa de Uniblue A no influye fuertemente en el punto isoeléctrico de las proteínas derivatizados.  requieren unos pocos minutos para la preparación de la muestra.

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