Este documento describe diferentes técnicas de cromatografía instrumental como la cromatografía de gases, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de capa delgada. Explica los principios, materiales, ventajas y aplicaciones de cada una de estas técnicas cromatográficas.

1. ANALISIS INSTRUMENTAL
Cromatografía de Gases

2. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSIÓN DE
TAMAÑO
 Llamada también cromatografía molecular o en
gel
 Método en el que Fase estacionaria = malla o
criba molecular por el cual las moléculas se
separan según su tamaño, forma y peso.
 Son hidrofílicas = son capaces de absorber agua e
incharse

3.  Los de mayor tamaño no caben en el poro y
pasan por entre las esferas y llegan primero, una
vez introducidas en el gel, las moléculas mas
pequeñas tardaran mas en salir de la red porosa;
quedaran retenidas (+) tiempo. Las de mayor
tamaño, al no caber en el poro, pasan entre las
esferas y eluyen las primeras;
 a (+) tamaño (+) velocidad
 a (-) tamaño (-) velocidad
 Permite separar, proteínas, enzimas, péptidos,
ácidos nucleicos. Hormonas, etc.

4. MATERIALES MAS USADOS PARA LA
CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION DE
TAMAÑO

5. Cromatografía de
intercambio iónico
•Se usan principalmente para separar
sustancias inorgánicas.
•Intercambio de iones en la fase estacionaria.
•Fase estacionaria= formada por perlas de
poliestireno con divinilbenceno

6. Resinas intercambiadoras de
cationes
 Contienen grupos funcionales ácidos unidos al anillo
aromático de la resina
Tipo de Grupo funcional Nombre comercial
intercambiador intercambiador
Catiónico Acido sulfónico Dowex a 50; Amberliteh IR120;
Ácido fuerte IonacC CGC-240;
Rexynd 101; Permutite Q
Ácido débil Ácido carboxílico Amberlite IRC 50; Ionac
CGC-270; Rexyn 102;
Permutit H-70
Aniónico Ion amonio cuaternario Dowex 1; Amberlite IRA 400;
Base fuerte Ionac AGA-542: Rexyn 201;
Permutit S-1
Base débil Grupo amino Dowex 3; Amberlite IR 45;
Ionac AGA-316; Rexyn 203;
Permutit W

7. Resinas intercambiadoras de
cationes
 Capacidad de intercambio de una resina es la
cantidad total de H sustituible por unidad de peso o
de volumen.
 Capacidad de intercambio iónico afecta la retención
del soluto, mayor retención mejor resolución.
 Intercambiadoras de cationes se suministran en
forma de H, y se convierten al ion sodio.
 Las resinas ácidos fuertes se usan en la mayor
parte de las separaciones. Las ácidas débiles se
prefieren para proteínas y péptidos
nRzSO₃ ¯H⁺ +Mⁿ⁺¹ (RzSO₃)η M+ nH⁺
nRzCO₂ ¯ H⁺ +Mⁿ⁺¹ (RzCO₂)η M+ nH⁺

8. Resinas intercambiadoras de
aniones
 Contiene anión hidroxilo.
 Reacciones de intercambio:
nRzNR₃⁺OH¯ +Aⁿ¯ (RzNR₃)η A+ nOH¯
nRzNH₃⁺OH¯ +Aⁿ¯ (RzNH₃)η A+ nOH¯
 Resinas básicas fuertes (pH 0-12) son las que se aplican en
general. L as básicas débiles (pH 0-9) se usan para separar
ácidos fuertes.
ENTRECRUZAMIENTO
 <Entrecruzamiento; <diferencia de selectividad en una resina
 Se representa en forma de % de divinilbenceno.
 Entrecruzamiento: < rigidez, >hinchamiento, porosidad y
solubilidad de una resina.

9. Efecto del pH: separación de
aminoácidos
 Las formas iónicas de las sustancias son influenciadas por el
pH de la solución efluente.
 Los aminoácidos pueden tener carga positiva o negativa o ser
neutros ( en su punto isoeléctrico). Estas tres formas se pueden
separar con una combinación de resinas intercambiadora de
cationes y aniones.
 Para los aminoácidos anfóteros existen 3 formas de separación:
 La forma Zwitterion; por el punto isoeléctrico
 Moore y Stein
 Analizadores automáticos de aminoácidos.

10. Cromatografía iónica.
La aplicación de las técnicas
de HPLC a la cromatografía
de intercambio iónico se
llama Cromatografía
iónica.
La cromatografía iónica es la
forma de alto rendimiento
para la cromatografía de
intercambio iónico.

11. En 1970, William Bauman,
sugirió una forma de eliminar
el eluyente de fondo con una
segunda columna de
intercambio iónico
permitiendo así la detección
de los iones de analito con
un detector muy sensible
(micromhos).
Esta segunda columna se llama columna
supresora.
Esta columna remueve los iones del
eluyente e intercambia los iones del
analito por cationes u aniones, por lo que
se puede usar un detector de
conductividad de alta sensibilidad.

12. En la cromatografía iónica se
usan resinas intercambiadoras
débiles, aunque también se
usan fuentes.

13. Los aniones como F-, Cl-, Br-, así
como los ácidos orgánicos y sus
sales, se determinan con facilidad
en cuestión de minutos hasta
concentraciones de partes por
millón o menos.

14. CROMATOGRAFÍA DE CAPA
DELGADA (TLC)
 Es la forma plana, que se aplica en el cribado
a gran escala para análisis cuantitativo.
(Análisis cualitativo).
 La fase estacionaria es una capa delgada de
adsorbente finamente dividido, soportado
sobre una capa de vidrio o de aluminio, o
sobre una banda de plástico.
 Los sólidos que se usan en CLC, deben de
ser un aglutinante adecuado para tener
buena adherencia a la placa.

15. Disposición para la
cromatografía de capa delgada.
Tapa de la
cámara
Cámara
Línea con lápiz que
Puntos de marca el lugar de
aplicación con la los puntos de
muestra aplicación
Eluyente

16. Desarrollo del cromatograma
1. Trazar una raya delgada con un lápiz que cruce la placa a unos cm
arriba del fondo.
2. Se practican las manchas gota a gota, para referencia del Rf.
(separación máxima y mínimo arrastre).
3. Con una pistola de aire caliente evaporar el disolvente después de
cada gota.
4. Colocar en una cámara cerrada a presión, para evitar evaporación.
5. Duración de 10 min a 1 hr. (dependerá de la complejidad de la
mezcla de solutos a separar).
Ventaja:
 Se puede tener mayor poder de separación usando la
cromatografía bidimensional de capa delgada , en donde se usa
una placa grande y la muestra se deposita en una de sus esquinas
inferiores, después del desarrollo la capa se gira 90° y se sigue
desarrollando con otros disolventes.

17. Detección de las manchas
 Solutos fluorescentes (compuestos
orgánicos).
 Iluminar con una lámpara de luz
ultravioleta.
 Rociar con ácido sulfhídrico, hasta
quemar y desarrollar manchas negras.
 Manchas incoloras o no
fluorescentes.
 Exponer la placa a vapores de Yodo, que
producen colores.
 Después de identificar las manchas,
se lavan y se raspan los solutos,
para identificar cuantitativamente
con un micrométodo.

18. Fases estacionarias para la
cromatografía de capa delgada
 Polvo finamente dividido (10-50μm).
 Adsorbentes, son las que se usan con mayor
frecuencia, por ejemplo: gel de sílice, alúmina y
celulosa pulverizada.
 Líquidas, pueden ser preparadas para separación
mediante cromatografía de partición líquido-líquido
(Agua sobre gel sílice).
 Resinas de intercambio iónico (40 a 80 μm),
como por ejemplo: intercambiadora de cationes
Dowex 50 W (ácida), y la intercambiadora de
aniones Dowex 1 (básica).

19. Fases móviles para
cromatografía de capa delgada
 En la cromatografía de adsorción, el poder
eluyente de los disolventes aumenta al
incrementar su polaridad. (Hexano a
acetona a alcohol a agua).
 Se debe usar un disolvente o a lo mucho
tres.
 Los disolventes deben ser de gran pureza.

20. Mediciones cuantitativas
 Para la cromatografía bidimensional de capa delgada se
mide ópticamente la densidad de las manchas.
 Se mide la transmitancia de la luz que atraviesa la capa,
o la reflectancia de la luz que se atenúa por el color del
analito.
 Se mide la intensidad de fluorescencia al iluminar con
radiación ultravioleta.
CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA DE ALTA EFICIENCIA
(HPTLC)
Se usan partículas más finas para tener separaciones rápidas y
eficientes usando muestras más pequeñas.