1. Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre
Na)onal
de
Référence
des
Hépa)tes
Virales
B,
C
et
delta
Laboratoire
de
Virologie
&
INSERM
U955
Hôpital
Henri
Mondor
Université
Paris-­‐Est
Créteil

2. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
•
Découvert
par
Houghton
en
1989
•
1ère
cause
d’hépa)te
chronique
et
de
cirrhose
en
Europe
et
en
Amérique
du
Nord
•
1ère
indica)on
de
transplanta)on
hépa)que
dans
les
pays
industrialisés
Afdhal,
NH.
2004;
Sem
Liv
Dis,
24(Supp
2):
3-­‐8

3. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
• Famille
:
Flaviviridae
• Genre
:
Hepacivirus
Phylogénie
de
la
région
codant
la
protéine
NS5B
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.

4. Hépatite C : virus et marqueurs
Virus de l’Hépatite C
• Famille
:
Flaviviridae
• Genre
:
Hepacivirus
• Hôte
naturel
:
Homme
• Tropisme
:
Hépatocyte

5. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Structurale

6. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique des Flaviviridae
0
1800
3600
5400
7200
9000
10800
Hepa//s
C
virus
5’UTR
3’UTR
C
E1
E2
NS2
NS3
NS4B NS5A
NS5B
p7
4A
Pes/virus
5’UTR
3’UTR
C E0 E1
E2
NS2
NS3
NS4B
NS5A
NS5B
Npro
4A
p7
Yellow
fever
virus
5’UTR
3’UTR
prM
Cap C
E
NS1
2A 2B
NS3
NS4A 4B
NS5

7. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique
Protéines structurales Protéines non structurales
Popescu
and
Dubuisson,
Bio.
Cell
2010,
102(1):
63-­‐74.

8. Hépatite C : virus et marqueurs
Organisation Génomique
Bartenschlager
et
al,
Trends
Microbiol,
in
press.

9. Hépatite C : virus et marqueurs
IRES et Traduction
From
Department
of
Structural
Biology,
Stanford
University
Medical
School,
USA.

10. Hépatite C : virus et marqueurs
Réseaux d’Interactions
Park
et
al,
BMC
BioinformaTcs
2010,
11(Suppl
1):
S23.

11. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine de Capside
Boulant
et
al,
J
Virol
2005,
79(17):
11353-­‐11365.

12. VHC G1b
Piodi
et
al.,
Hepatology
2008,
48(1):
16-­‐27.

13. Hépatite C : virus et marqueurs
Capside et Lipides
Bartenschalger
et
al.,
Tends
Microbiol,
in
press.

14. Hépatite C : virus et marqueurs
Interaction entre la Capside et DGAT-1
*Diacylglycérol diacyltransférase-1
Herker
et
al.,
Nat
Med
2010,
16(11):
1295-­‐1298.

15. Hépatite C : virus et marqueurs
Glycoprotéine E2
• Hétérodimère avec E1
• Régions hypervariables
– HVR1
– HVR2
– igVR
• Rôles
– HVR2 et igVR
indispensables au “folding“
E1-E2
– Étapes précoces
(interaction avec CD81,
peptide de fusion)
Krey
et
al.,
PLoS
Pathog.
2010,
6(2):
e1000762;
McCaffrey
et
al.,
J
Gen
Virol
2011,
92:
112-­‐121.

16. Hépatite C : virus et marqueurs
Étape Précoce : Entrée du VHC
Popescu
et
al.,
Bio
Cell
2010,
102:
63-­‐74.

17. Hépatite C : virus et marqueurs
HVR1
Région HVR1 (27 amino-acides)
Ø 80% de divergence nucléotidique entre génotypes
Ø Epitope majeur de neutralisation
Timm
et
al.,
World
J
Gastroenterol
2007;
13(36)4808-­‐4817.

18. Hépatite C : virus et marqueurs
Transmission du VHC

19. Hépatite C : virus et marqueurs
Analyse Phylogénique
4a_ED43
Patient 7
Patient 4
Patient 8
1b_AWV2C33
Patient 6
1a_HCT18X5
Région HVR1(81 nt) 3a_CB
CLUSTALX 2a_Q2B
DNADist (PHYLIP 3.5) 1a_HCT27X5
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
S1 (6/05)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
Patient 3 (01/05)
NJPlot S2 (6/05)
S3 (6/05)
S4 (6/05)
Patient 3 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 2 (7/04)
100 Patient 3 (9/05)
Patient 3 (7/05)
S5 (7/05)
1b_HVR3812
5a_SA13
Patient 1 (7/04)
2b_JFH1
Surfaces inertes 6a_33
Séroconversion VHC 0.2
Patients VHC chroniques
Girou
et
al.,
Clin
Infect
Disease
2008,
47(5):
627-­‐633.

20. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine p7
• Viroporine
dont
la
structure
3D
a
été
récemment
déterminée
par
ME
• Rôle(s)
in
vivo
?
• Cible
thérapeu)que
poten)elle
Luik
et
al.,
Proc
Natl
Acad
Sci
2009,
4;106(31):
12712-­‐6;
Griffin
S,
Proc
Natl
Acad
Sci
2009,
106(31):
12567-­‐68.

21. Hépatite C : virus et marqueurs
Activité Antivirale du BIT225
• IC50
de
314
nM
dans
le
modèle
du
BVDV
• Ac)vité
synergique
Luscombe
et
al.,
AnTviral
Res
2010
May;86(2):144-­‐53.

22. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS2
• NS2
(région
N-­‐ter)
– Rôle
dans
l’organisaTon
de
la
formaTon
des
nucléocapsides
• NS2pro
(région
C-­‐ter)
Jirasko
et
al.,
PLoS
pathog
2010
Dec
16;6(12):
e1001233;
Ivo
et
al.,
Nature
2006,
442:
831-­‐835.

23. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS3-4A
Raney
et
al.,
J
Biol
Chem
2010,
285(30):
22725-­‐731.

24. Hépatite C : Nouvelles Hepatite C : virus et marqueurs
Inhibition de la Production d’IFN par NS3

25. Hépatite C : virus et marqueurs
Protéase NS3
Raney
et
al.,
J
Biol
Chem
2010,
285(30):
22725-­‐731.

26. Hépatite C : virus et marqueurs
Etudes de Phase III Présentées à l’AASLD™
2010
• SPRINT-­‐2
BOCEPREVIR
(BOC)
• RESPOND-­‐2
• ADVANCE
• ILLUMINATE
TELAPREVIR
(TVR)
• REALIZE

27. Hépatite C : virus et marqueurs
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de
Génotype 1 : Design de l’Etude
S4 S28 S48 S72
48
PR
PR
PR
+
placebo
Suivi
n
=
363
Lead-­‐in
ARN-­‐VHC
indétectable
à
S8-­‐24
Suivi
S24
BOC/TGR
PR
PR
+
boceprevir
ARN-­‐VHC
détectable
à
S8-­‐24
n
=
368
Lead-­‐in
P/R
+
placebo
Suivi
BOC/PR48
PR
n
=
366
Lead-­‐in
PR
+
boceprevir
Suivi
*BOC
800
mg
q8h;
pegIFN
alfa-­‐2b
1,5
µg/kg/s;
RBV
600-­‐1400
mg/j
adaptée
au
poids.
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.

28. Hépatite C : virus et marqueurs
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de
Génotype 1 : Caractéristiques des Patients
Cohorte 1 (caucasiens) [n=938]
PR48 BOC/RGT BOC/PR48
n=311 n=316 n=311
Sexe masculin [n(%)] 171 (55) 198 (63) 187 (60)
Age (années) [moyenne] 48 49 49
IMC (kg/m2) [moyenne (±DS)] 27 (±5) 28 (±5) 27 (±5)
ARN du VHC >400,000 UI/mL [n(%)] 286 (92) 287 (91) 289 (93)
Type/sous-type du VHC [n(%)]*
1a 186 (60) 196 (62) 196 (63)
1b 112 (36) 110 (35) 102 (33)
Fibrose sévère/Cirrhose
22 (7) 25 (8) 37 (12)
(METAVIR F3/F4) [n(%)]
*La
déterminaTon
du
type
et
du
sous-­‐type
a
été
réalisée
par
séquençage
d’une
porTon
de
la
région
NS5B
codant
l’ARNpol
(méthode
de
référence)
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.

29. Hépatite C : virus et marqueurs
SPRINT-2—BOC + PegIFN + RBV chez des
Patients Naïfs de Génotype 1 : RVS et Taux de
Rechute
p
<0,0001
p
<0,0001
Taux de RVS
Propor)on
de
pa)ents
(%)
Taux de rechute
125/311
37/311
213/311
21/232
211/316
18/230
Poordad F, et al. N Engl J Med. 2011;364:1195-1206.

30. Hépatite C : virus et marqueurs
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de
Génotype 1 : Design de l’Etude
S8
S12
S24
S36
S48
S72
PR48
Placebo
PR
Suivi
(n
=
361)
+
P/R
eRVR+
Suivi
T12PR
(n
=
363)
TVR
+
PR
PR
PR
Suivi
eRVR+
Suivi
T8PR
TVR
Pbo
(n
=
364)
+
PR
+
PR
PR
PR
Suivi
eRVR-­‐
*TVR
750
mg
q8h;
pegIFN
alfa-­‐2a
180
µg/s;
RBV
1000-­‐1200
mg/j
adaptée
au
poids.
eRVR
:
réponse
virologique
rapide
étendue
(ARN
indétectable
à
S4
et
à
S12)
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.

31. Hépatite C : virus et marqueurs
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients Naïfs de
Génotype 1 : Caractéristiques des Patients
T12PR (n = 363) T8PR (n = 364) PR (n = 361)
Sexe masculin [n (%)] 214 (59) 211 (58) 211 (58)
Origine ethnique
Caucasiens [n (%)] 325 (90) 315 (87) 318 (88)
Afro-Américains 26 (7) 40 (11) 28 (8)
Hispaniques 35 (10) 44 (12) 38 (11)
Âge (années) [médiane (intervalle)] 49 (19-69) 49 (19-68) 49 (18-69)
IMC (kg/m2) [médiane (intervalle)] 26 (18-47) 26 (17-46) 26 (17-48)
ARN du VHC > 800 000 UI/ml* [n (%)] 281 (77) 279 (77) 279 (77)
Type/sous-type du VHC** [n (%)]
1a 213 (59) 210 (58) 208 (58)
1b 149 (41) 151 (41) 151 (42)
1 non sous-typable 1 (< 1) 3 (1) 2 (1)
Stade de fibrose, n (%)
Fibrose en ponts 52 (14) 59 (16) 52 (14)
Cirrhose 21 (6) 26 (7) 21 (6)
*La
charge
virale
(ARN
du
VHC,
UI/ml)
a
été
déterminée
par
PCR
en
temps
réel
(TaqMan®
Roche),
avec
une
limite
de
quanTficaTon
de
25
UI/mL
**La
déterminaTon
du
génotype
viral
a
été
réalisée
par
hybridaTon
inverse,
INNO-­‐LiPA
v1.0
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.

32. Hépatite C : virus et marqueurs
ADVANCE—TVR + PegIFN + RBV chez des
Patients Naïfs de Génotype 1 : RVS et Taux de
Rechute
p
<0,0001
p
<0,0001
Propor)on
de
pa)ents
(%)
Taux
de
RVS
Taux
de
rechute
265/363
27/314
243/364
28/295
158/361
64/229
Jacobson IM, et al. N Engl J Med. 2011;364:2405-2416.

33. Hépatite C : virus et marqueurs
RESPOND-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients en
échec Thérapeutique de G1 : Design de l’Etude
S4
S28
S48
S72
PR48
PR
PR
+
placebo
Suivi
n
=
80
Lead-­‐in
ARN-­‐VHC
indétectable
à
S8
Suivi
S24
BOC/TGR
PR
PR
+
boceprevir
S32
ARN-­‐VHC
détectable
à
S8
n
=
162
Lead-­‐in
PR
+
Suivi
placebo
BOC/PR48
PR
n
=
162
Lead-­‐in
PR
+
boceprevir
Suivi
*BOC
800
mg
q8h;
pegIFN
alfa-­‐2b
1,5
µg/kg/s;
RBV
600-­‐1400
mg/j
adaptée
au
poids.
Bacon BR, et al. N Engl J Med. 2011;364:1207-1217.

34. Hépatite C : virus et marqueurs
RESPOND-2—BOC + PegIFN + RBV chez des Patients en
échec Thérapeutique de G1 : RVS en Fonction de la
Réponse Antérieure à la Bithérapie Pégylée
Propor)on
de
pa)ents
(%)
(TGR)
17/80
95/162
107/161
2/29
23/57
30/58
15/51
72/105
77/103
17/80
8/25
95/162
17/111
107/161
14/121
Bacon BR, et al. N Engl J Med. 2011;364:1207-1217.

35. Hépatite C : virus et marqueurs
REALIZE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients en Echec
Thérapeutique de G1 : Design de l’Etude
S4
S8
S12
S16
S48
S72
48
PR
PR
+
placebo
PR
Suivi
n
=
130
PR
n
=
260
PR
+
TVR
(Ll)
PR
Suivi
PR
n
=
260
(LI)
PR
+
TVR
PR
Suivi
*TVR
750
mg
q8h;
pegIFN
alfa-­‐2a
180
µg/s;
RBV
1000-­‐1200
mg/j
adaptée
au
poids.
Zeuzem S, et al. N Engl J Med. 2011;364:2417-2428.

36. Hépatite C : virus et marqueurs
REALIZE—TVR + PegIFN + RBV chez des Patients en Echec
Thérapeutique de G1 : RVS en Fonction de la Réponse
Antérieure à la Bithérapie Pégylée
*
*
Propor)on
de
pa)ents
(%)
*
*
*
*
21/72
25/75
4/27
26/48
26/48
16/68
124/141
121/145
17/80
2/37
8/25
95/162
17/111
107/161
14/121
*p
<0,0001
contre
PR48
Zeuzem S, et al. N Engl J Med. 2011;364:2417-2428.

37. Hépatite C : virus et marqueurs
TMC435 Administré en Monothérapie chez des
Patients de Génotype 2, 3, 4, 5 et 6
Diminu)on
moyenne
de
l’ARN
du
VHC
(Log
UI/mL)
J3
J7
Manns
et
al.,
AASLD
2010,
Abstract
82.

38. Nouvelles Hépatite C : virus et marqueurs
Protéine NS5B: RdRp
Lesburg
et
al.,
Nat
struct
Biol
1999,
6:
937-­‐943;
Bressanelli
et
al.,
Proc
Natl
Acad
Sci
USA
1999,
96:
13034-­‐13039;
Ago
et
al.,
Srructure
Fold
Des
1999,
7:
1417-­‐1426.

39. Hépatite C : virus et marqueurs
Réplication Virale
–
Modèle
du
poliovirus
.
Virus
à
ARN
monocaténaire
de
polarité
posiTve
RéplicaTon
De
Clercq.,
Nature
Review
Drug
Discovery,
2007;
6:
1001-­‐18

40. Hépatite C : virus et marqueurs
Variabilité Génétique
• Erreurs
au
cours
de
la
réplica)on
– Fréquentes
• 10-­‐4-­‐10-­‐4
mutaTons
par
nucléoTde
copié
au
cours
de
la
réplicaTon
du
VHC
– Spontanées
– Au
hasard
• Absence
d’ac)vité
exonucléasique
3’⇒5’
("proofreading")
– AccumulaTon
de
mutaTons
• A
l’origine
de
:
– La
diversificaTon
des
types
et
des
sous-­‐types
– La
distribuTon
en
quasi-­‐espèces

41. Hépatite C : virus et marqueurs
Diversification des Génotypes
Simmonds
et
al.,
Hepatology
2005,
42(4):962-­‐73.

42. Hépatite C : virus et marqueurs
Distribution des Génotypes
1a,
Adapted
from
Fang
J.,
et
al.
J.
Clin
Liver
Dis.
1997.

43. Hépatite C : virus et marqueurs
Distribution en Quasi-espèce
Domingo, E. Cell 1978, 13 (4):735-744.

44. Hépatite C : virus et marqueurs
Cibles des Molécules Antivirales
Site
C
(Palm)
Site
A
(Thumb/finger)ps)
(A-­‐837093)
(JTK-­‐109)
Mutants:
411,
414,
448
Mutants:
495,
496,
499
A
B E
C
D
Site
B
(Thumb)
HCV-­‐371
Site
E
(Finger,
hypothe)cal)
Mutants:
419,
423,
482
GS-­‐9190
Mutants:
445,448,452
Site
D
(Palm)
(HCV796)
Site
Ac)f
Mutants:
316
(R7128)
Mutants:
282
Copyright
©
2006
Merck
&
Co.,
Inc.,
Whitehouse
StaTon,
New
Jersey,
USA

45. Hépatite C : virus et marqueurs
Activité Antivirale du MK-0608
wt
S282R/T/I
wt
S282
MK-­‐0608
at
1mg.kg-­‐1
orally
7
6
HCV
RNA
(Log
IU/mL)
5
4
3
2
-­‐
4,6
-­‐
4,1
LOQ
1
(20
IU/mL)
TMA
+
+
+
+
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
+
+
0
-­‐15
-­‐10
-­‐5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Days

46. Hépatite C : virus et marqueurs
Cycle Viral
Adapted
from
Lindenbach
and
Rice,
Nature
(2005),
436:
933-­‐938.

47. Quasi-espèces virales: exemple du VHC
"Membranous Web"
Huh7
naïves
Huh7
infectées
(réplicon)
Gosert et al., J Virol 2003, 77(9): 5487-5492.

49. Hépatite C
Stratégie Diagnostique &
Suivi Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre
Na)onal
de
Référence
des
Hépa)tes
Virales
B,
C
et
delta
Laboratoire
de
Virologie
&
INSERM
U955
Hôpital
Henri
Mondor
Université
Paris-­‐Est
Créteil

50. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Marqueurs Virologiques
Marqueurs
indirects
AnTcorps
anT-­‐VHC
totaux
Marqueurs
directs
Ag
de
capside
(AgC)
ARN
VHC
Génotype
VHC
Profil
de
résistance

51. Diagnostic de l’infection par le VHC
Tests Sérologiques
• Détec)on
et
quan)fica)on
de
l’an)gène
de
capside
(AgC)
• Tests
“Combo”
– DétecTon
simultanée
de
l’AgC
et
des
anTcorps
anT-­‐VHC
• Détec)on
of
des
an)corps
an)-­‐VHC
par
EIA
de
3ème
généra)on

52. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside : un Marqueur
de la Réplication
r = 0.92; p < 0.0001
Bouvier-­‐Alias
et
al.,
Hepatology
2002,
36(1):
211-­‐218.

53. Diagnostic de l’infection par le VHC
Intérêts Cliniques de la Quantification de
l’AgC
• Diagnos)c
de
l’infec)on
– Trousses
commerciales
– Facile
à
uTliser,
automaTsé,
peu
coûteux
(20%
par
rapport
à
une
charge
virale
VHC)
• Décision
de
traiter
et
suivi
de
l’efficacité
des
traitements
an)viraux
– QuanTtaTf
(≤20,000
fmol/L*)
– AlternaTve
aux
techniques
de
détecTon-­‐quanTficaTon
de
l’ARN
du
VHC

54. Diagnostic de l’infection par le VHC
Performances Analytiques de la Trousse
Architect (Abbott)
• Spécificité
– 99,2%
à
100%
• Sensibilité
– ≤10
fmol/L
(i.e
500
to
3
000
UI/mL
d’ARN
VHC)
– Tous
les
génotypes
(excepté
génotype
2)
• Intervalle
de
quan)fica)on
– 10
à
20
000
fmol/L
(≤
7,8
Log10
UI/mL
d’ARN
VHC)
• Stable
à
37°C
pendant
96
heures
Ross et al., J Clin Micribiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.

55. Diagnostic de l’infection par le VHC
Trousse Architect : Monitorage des
Cinétiques Virales
RVR
(G1b)
RVS
(G1b)
Rechuteur
(G1b)
Non-­‐répondeur
(G1a)
Core Ag
RNA
Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.

56. Diagnostic de l’infection par le VHC
Performances de la Trousse Architect
chez les Patients Hémodialysés
n=90
r=0,9041;
p<0,0001
Mediouge et al., J Clin Virol 2010 May;48(1):18-21

57. Diagnostic de l’infection par le VHC
Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnos)c
de
l’infec)on
par
le
VHC
– Trousses
commerciales
– Faciles
à
uTliser,
automaTsés
– DiminuTon
de
la
fenêtre
sérologique
d’environ
20-­‐30
jours
– Moins
sensibles
que
les
tests
de
3ème
généraTon
pour
la
détecTon
des
anTcorps
anT-­‐VHC

58. Diagnostic de l’infection par le VHC
Détection des Anticorps Anti-VHC
• Diagnos)c
de
l’infec)on
par
le
VHC
– Trousses
commerciales
– Faciles
à
uTliser,
automaTsées
– A
l’aide
d’un
test
de
3ème
généraTon
.
ADVIA
Centaur
(Siemens)
.
VITROS
ECi
(Ortho-­‐Clinical
DiagnosTc)
.
AXSYM
HCV
3.0
(Abbo{)
.
Cobas
Elecsys
Modular
HCV
(Roche)
.
INNOTEST
HCV
Ab
IV
(InnogeneTcs)
.
Monolisa
anT-­‐HCV
Plus
version
2
(Bio-­‐Rad)

59. Diagnostic de l’infection par le VHC
Tests Virologiques Moléculaires
Tests
Qualita)fs-­‐Quan)ta)fs
Est-­‐ce
que
le
VHC
est
présent
et
en
quelle
quan)té
?
Détec)on
de
la
résistance
Détermina)on
du
Génotype
Quel
est
le
génotype
du
VHC
?
Quel
type
de
VHC
est
présent
?

60. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Avantages Techniques de la PCR en
Temps Réel
- Diminu)on
du
risque
de
contamina)on
- Améliora)on
de
la
sensibilité
- Augmenta)on
de
l’intervalle
de
quan)fica)on
linéaire
- Améliora)on
précision
et
reproduc)bilité
- Augmenta)on
de
débit
à
travers
l’automa)sa)on

61. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intervalles de Quantification
10
102
103
104
105
106
107
108
Cobas
Amplicor
HCV
Monitor
v2.0
SuperQuant
LCx
HCV
RNA
Assay
Versant
HCV
RNA
3.0
(bDNA)
Cobas
TaqMan
HCV
v1.0
(Roche)
RealTime™
HCV
(Abbov)
Cobas
TaqMan
HCV
v2.0
(Roche)*
Artus
HCV
QS-­‐RGQ
(Qiagen)*
Versant
HCV
RNA
1.0
(kPCR,
Siemens)*
*in
development

62. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Plates-formes
CAP-CTM96 (ROCHE)
kPCR (SIEMENS)
m2000SP-m2000RT (ABBOTT)

63. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Applications et Bénéfices de la PCR en
Temps Réel
• Remplace
les
techniques
qualita)ves
de
détec)on
de
l’ARN
du
VHC
• Quan)fie
l’ensemble
des
charges
virales
observées
en
pra)que
clinique
– Charges
virales
élevées
avant
traitement
– Faibles
charges
virales
au
cours
du
traitement
• Surveille
efficacement
les
ciné)ques
virales
afin
d’évaluer
l’efficacité
virologique
du
traitement

64. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC
(CTM, Roche)
8
HCV
RNA
level
in
CAP/CTM48
(Log10
IU/mL)
7
Genotype
1
(n=29)
6
Genotype
2
(n=27)
Genotype
3
(n=29)
5
Genotype
4
(n=30)
Genotype
5
(n=9)
4
Genotype
6
(n=2)
r
=
0.889;
p
<
0.0001
3
3
4
5
6
7
8
HCV
RNA
level
in
Versant
HCV
3.0
Assay
bDNA
(Log10
IU/mL)
Chevaliez
et
al.,
2007;
Hepatology,
46(1):
22-­‐31.

65. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Absence de Détection de l’ARN Viral de patients
Fortement Virémiques Infectés par un Génotype 4
(Log10 IU/mL) CAP/CTM96 m2000SP/m2000RT Versant 3.0
Patient 1 (4h) <1.08 5.4 5.0
Patient 2 (4l) <1.08 6.0 5.7
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|
F_7157 (4a): TAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCCGG
Patient 1 (4h): ...........................A.....................................A...................T...............
Patient 2 (4l): ...........................A.....................................A...................T...............
190 200 210 220 230 240 250 260 270
.........|.........|......-...|.........| .........|.........|.........|.........| .........|........
F_7157 (4a): GATGACCGGGTCCTTTCTTGGATTAA-CCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCC
Patient 1 (4h): ......................A.T.A..........................................................................
Patient 2 (4l): .......................C..-.......................................................C.......T..........
280 290 300 310 320 330 340
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.
F_7157 (4a): TTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC
Patient 1 (4h): .............................................................
Patient 2 (4l): .............................................................
Chevaliez
et
al.,
2008;
Hepatology,
49(4):
1397-­‐1398.

66. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages ou
Mutés en Position 145 et/ou 165
Measured
HCV
RNA
levels
(Log10
IU/mL)
HCV
5’NC
sequence
Real-­‐)me
PCR
assays
bDNA
assay
CTM
m2000
Versant
3.0
Wild-­‐type
(G145
and
A165)
5.73±0.13
6.05±0.10
6.43±0.01
Single
mutant
(G145A
and
4.02±0.13
6.00±0.11
6.69±0.02
A165)
Single
mutant
(G145
and
4.28±0.35
5.88±0.20
6.30±0.02
A165T)
Double
mutant
(G145A
and
<1.08*
5.95±0.25
6.60±0.18
A165T)
*Target
not
detected
Chevaliez
et
al.,
Hepatology,
2009,
50(5):
1681.

67. Diagnostic de l’infection par le VHC
Quantification de l’ARN du VHC
(CTM v2.0, Roche)
10,000
cp/mL
(input)
Mean
)ter
(Log10
cp/mL)
WT
G1
A165T
G145A+A165T
G4
A142G+G145A+A165T
Vermehren et al., 2011; J Clin Microbiol, 49(9): 3309-3315.

68. Diagnostic de l’infection par le VHC
Quantification de l’ARN du VHC
(CTM v2.0, Roche)
10,000
cp/mL
(input)
Mean
)ter
(Log10
cp/mL)
WT
G1
A165T
G145A+A165T
G4
A142G+G145A+A165T
Vermehren et al., 2011; J Clin Microbiol, 49(9): 3309-3315.

69. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC
(m2000, Abbott)
8
HCV
RNA
level
in
m2000SP/m2000RT
(Log10
IU/mL)
7
Genotype
1
(n=55)
6
Genotype
2
(n=21)
Genotype
3
(n=29)
5
Genotype
4
(n=24)
Genotype
5
(n=9)
4
Genotype
6
(n=3)
r
=
0.972;
p
<
0.0001
3
3
4
5
6
7
8
HCV
RNA
level
in
Versant
HCV
3.0
Assay
bDNA
(Log10
IU/mL)
Chevaliez
et
al.,
J
Clin
Microbiol,
2009,47(6):1726-­‐32.

70. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification ARN du VHC
(kPCR, Siemens)
132 clinical samples
David
Sherman.,
Molecular
Symposium,
September
2007
(source:
Siemens
Medical
SoluTons
DiagnosTcs).

71. Stratégie diagnostique & suivi virologique
LLOD & LOQ : Laquelle Utiliser pour
Prédire la RVS ?
Traitement
An)viral
Charge
virale
VHC
(Log10
UI/mL)
8
Détectable/
Rendu des Résultats
quan)fiable
6
Quantifiable
(toute valeurs > LOQ)
4
Détectable non
2
quantifiable
(LLOD<ARN <LOQ)
LOQ
Détectable/non
quan)fiable
1
LLOD
Indétectable
Indétectable
(ARN<LLOD)
0
0
Temps
RVS
Harrington et al., Hepatology 2011, sous-presse.

72. Stratégie diagnostique & suivi virologique
PCR en Temps Réel en Pratique
• En
pra)que
clinique,
la
quan)fica)on
de
l’ARN
du
VHC
doit
être
réalisée
à
l’aide
d’une
technique
de
PCR
en
temps
réel
– Expression
des
résultats
en
UI/mL
– LOD=LLOQ
de
l’ordre
de
10
à
15
UI/mL
• La
quan)fica)on
de
l’ARN
du
VHC
doit
être
réalisée
avant
le
début
du
traitement
et
aux
semaines
4,
(8),
12,
24,
en
fin
de
traitement
et
24
semaines
après
l’arrêt
du
traitement
• Pour
un
pa)ent
donné,
le
monitorage
de
la
charge
virale
doit
être
réalisé
avec
la
même
technique
de
PCR
en
temps
réel

73. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotypes du VHC
Simmonds
et
al.
Hepatology
2005.

74. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Répartition des Génotypes
1a,
Adapted
from
Fang
J.,
et
al.
J.
Clin
Liver
Dis.,
1997.

75. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
• Méthodes
moléculaires
(genotyping)
– Analyse
de
la
séquence
après
séquençage
direct
– HybridaTon
inverse
des
produits
d’amplificaTon
sur
des
supports
solides
comportant
des
sondes
génotype
spécifique
:
Line
Probe
Assay
(INNO-­‐LiPA
HCV,
InnogeneTcs)
– PCR
en
temps
réel
à
l’aide
d’amorces
et
de
sondes
génotype
spécifique
• Méthodes
sérologiques
(“serotyping”)
– ELISA
compéTTf
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.

76. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
• Méthodes
moléculaires
(genotyping)
– Analyse
de
la
séquence
après
séquençage
direct
– HybridaTon
inverse
des
produits
d’amplificaTon
sur
des
supports
solides
comportant
des
sondes
génotype
spécifique
:
Line
Probe
Assay
(INNO-­‐LiPA
HCV,
InnogeneTcs)
– PCR
en
temps
réel
à
l’aide
d’amorces
et
de
sondes
génotype
spécifique
• Méthodes
sérologiques
(“serotyping”)
– ELISA
compéTTf
Arens
et
al.,
J
Clin
Virol,
2001;
22:11-­‐29;
Davidson
et
al.,
J
Gen
Virol
1995;
76:
1197-­‐204;
Lareu
et
al.,
1997;
Le
Pogam
et
al.,
1998;
J
Clin
Microbiol;
36:
1461-­‐3;
Ilina
et
al.,
J
Clin
Miocrobiol,
2005;
43(6):
2810-­‐15.

77. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Analyse Phylogénique après Séquençage 1mGUI24
Direct
1mGUI11
1mGUI17
1dBA107
1dHC1N16
1dFR17
99
Pa)ent
26
2
Pa)ent
5
59
Pa)ent
60
98
Pa)ent
48
Génotype
1,
sous-­‐type
i
96
1iQC181
1iQC77
1iFR16
Pa)ent
40
1bHCP01
34
100
1bHCVBK
Génotype
1,
sous-­‐type
b
1bHCJ4
Région
NS5B
(286
nt)
Pa)ent
7
Pa)ent
8
CLUSTALX
Pa)ent
17
Pa)ent
18
DNADist
(PHYLIP
3.5)
Pa)ent
36
Matrice
de
distance:
Kimura
2-­‐
100
Pa)ent
16
Pa)ent
64
Génotype
1,
sous-­‐type
?
parameter
(Ts/Tv=2)
Pa)ent
28
Neighbor-­‐Joining
Pa)ent
2
Pa)ent
54
Bootstraping
:
1000
replicates
72
Pa)ent
46
NJPlot
Pa)ent
59
1fFR2
1l98CM1457
43
1l98CM1427
1lM5186N
1gEG024
1g2152
1g1382
1eQC172
1eCAM1078
1eM4541N
Génotype
1
1kQC82
1kQC68
1jQC89
1jQC2
1aHCJ1
1aHCVH
1aHCV1
1cKhaja1
1cSR031
1cHCG9
1h98CM1521
1h98CM1357
Génotype
4
1hFrSSD98
4aED43
Génotype
3
100
Pa)ent
62
0.05
Génotype
6
3aNLZ1
Génotype
3,
sous-­‐type
a
6aEUHK2
Génotype
5
Génotype
2
2aHCJ6
Pa)ent
49
Génotype
2
5aSA13

78. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Versant® HCV Genotype 2.0 Assay
(INNO-LiPA)

79. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- Modeste
différence
d’efficacité
de
la
trithérapie
- Profils
de
résistance
différents
en
cas
d’échec
de
la
trithérapie
- Pas
d’influence
sur
la
décision
thérapeu)que

80. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt du Sous-Type dans la Résistance
au Telaprevir
Subtype
1b
Subtype
1a
Subs)tu)ons
in
pa)ents
who
failed
to
achieve
an
SVR

81. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact du Sous-Type sur la Barrière
Génétique à la Résistance
HCV-­‐1a
prototype
...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...
HCV-­‐1b
prototype
... S -­‐ -­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐-­‐ -­‐
V ...
HCV-­‐1a
AGAèAAA
(R155K)
AGAèACA
(R155T)
HCV-­‐1b
CGAèAAA
(R155K)
CGAèACA
(R155T)

82. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- Modeste
différence
d’efficacité
de
la
trithérapie
- Profils
de
résistance
différents
en
cas
d’échec
de
la
trithérapie
- Pas
d’influence
sur
la
décision
thérapeu)que

83. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêt de la Détermination du Sous-Type
(1a vs 1b) ?
- OUI
.
Dans
les
essais
cliniques
afin
de
correctement
straTfier
l’efficacité
des
DAAs
et
d’interpréter
les
profils
de
résistance
- NON
.
En
praTque
clinique
car
le
sous-­‐type
n’a
pas
d’influence
sur
la
décision
thérapeuTque

84. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
• Détermina)on
du
génotype
(sous-­‐type)
VHC
– La
déterminaTon
du
génotype
sur
la
seule
région
5’NC
doit
être
proscrite
– La
2nde
généraTon
de
Line
Probe
Assay
qui
uTlise
des
sondes
dirigées
contre
la
région
core
en
plus
de
la
région
5’NC
est
la
meilleure
méthode
perme{ant
de
disTnguer
les
sous-­‐
types
1a
et
1b
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.

85. Stratégie diagnostique & suivi virologique
IL28B “Single Nucleotide
Polymorphism” (SNP)
En amont du géne de l’IL28B, codant l’IFN-λ3
rs12979860
Ge
et
al.,
Nature
2009;
461:
399-­‐401.

86. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Bithérapie Standard : RVS en Fonction du
Génotype IL28B
Réponse virologique soutenue (%)
Caucasians African-Americans Hispanics Combined
(n=1171) (n=300) (n=116) (n=1587)
TT CC TT
CC
12 CC TT 14
37% 37% 22% 29%
51% 49% 48%
CT CT
CT
Thompson
et
al.,
Gastroenterology
2010;
139(1):
120-­‐129.

87. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
- En pratique clinique, SNPs en amont du gène de
l’IL28B (rs12979860 et rs8099917) sont les facteurs
prédictifs les plus robustes de la RVS à la bithérapie
- Cependant, leur valeur prédictive à l’échelon
individuel n’est pas suffisante pour la prise en compte
dans les décisions thérapeutiques
- La détermination du génotype IL28B en association à
d’autre paramètres, comme la réponse virologique à
S4, pourrait être utile pour adapter le traitement,
éventuellement des patients sous triple combinaison
Ge
et
al.,
Nature
2009;
461:
399-­‐401;
Tanaka
et
al.,
Nat
Genet
2009;
41(10):
1105-­‐9;
Afdhal
et
al,
Hepatology
in
press.

88. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Intérêts des Tests Virologiques en
Thérapeutique
• Décision
de
traiter
• Op)misa)on
du
schéma
thérapeu)que
• Etude
de
la
réponse
virologique
au
traitement
Consensus
conference:
treatment
of
hepaTTs
C;
2002,
Gastroenterol
Clin
Biol,
26(2):
B303-­‐20

89. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Le Génotype du VHC Détermine l’Approche
du Traitement VHC
• Génotypes
2/3,
4,
(5/6)
– MainTen
de
la
bithérapie
pégylée
(pegIFN/RBV)
• Génotype
1
– OpTon
thérapeuTque
possible
:
inhibiteur
de
protéase
en
associaTon
à
l’interféron
pégylé
et
la
ribavirine
– Boceprevir
(Victrelis®)
et
Telaprevir
(Incivo®)
approuvés
depuis
mai
2011
par
la
FDA
et
respecTvement
en
juillet
et
septembre
2011
par
l’EMA

90. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Réponses au Traitement en Fonction des
Cinétiques Virales
SOC
+1
0
HCV
RNA
reduc)on
from
baseline
(Log10
IU/mL)
-­‐1
-­‐2
Diminu)on
≥
2
Log
-­‐3
-­‐4
Slow
VR
-­‐5
RVR
EVR
Detec)on
cut-­‐off
-­‐6
(10-­‐15
IU/mL)
0
2
4
8
12
Weeks

91. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Definitions of Virological Responses
Response
Defini/on
SVR
HCV
RNA
undetectable
24
weeks
a‚er
the
end
of
treatment
RVR
HCV
RNA
undetectable
at
week
4
EVR
HCV
RNA
undetectable
at
week
12
DVR
>2
Log10
IU/mL
drop
but
detectable
HCV
RNA
at
week
12
Null
response
Less
than
2
Log10
IU/mL
in
HCV
RNA
from
baseline
at
week
12
ParTal
response
>2
Log10
IU/mL
decrease
in
HCV
RNA
from
baseline
at
week
12
but
sTll
detectable
at
weeks
12
and
24
Viral
breakthrough
HCV
RNA
detectable
at
any
Tme
during
treatment
a‚er
virological
response
Relapse
HCV
RNA
detectable
a‚er
withdrawal
treatment
in
paTent
who
was
undetectable
at
the
end
of
treatment
New
response
categories
with
protease
inhibitor-­‐based
therapy
eRVR
with
BOC
HCV
RNA
undetectable
at
weeks
8
and
24
eRVR
with
TVR
HCV
RNA
undetectable
at
weeks
4
and
12

92. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Monitoring of Treatment Responses
BOC/PR
TVR/PR
PR
S4
S8
S12
S24
S36
S48
S72

93. Stratégie diagnostique & suivi virologique
RVR in Patients Receiving PegIFN plus
Ribavirin
• Undetectable
HCV
RNA
at
Wk
4
of
therapy
• Achieving
RVR
is
highly
predic)ve
of
SVR
– Independent
of
genotype
and
treatment
regimen
– RVR
achieved
by
15%
to
20%
of
paTents
with
genotype
1;
66%
with
genotypes
2/3
• Pa)ents
who
achieve
RVR
may
be
able
to
shorten
therapy
Ferenci P, et al. J Hepatol. 2005;43:425-433; Shiffman ML, et al. N Engl J Med. 2007;357:124-134; Jensen DM, et al. Hepatology. 2006;43:954-960.
Ghany MG, et al. Hepatology. 2009;49:1335-1374; Moreno et al., J Hepatol 2010; 52: 25-31.

94. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher Rates of SVR in Genotype 2/3 Patients
Who Achieved an RVR with 24 vs 16 Weeks
p<0.001
p<0.001
p=0.13
16
weeks
SVR
(%)
24
weeks
375/458
368/405
197/243
115/212
181/215
174/193
Diago et al., Hepatology 2010 Jun;51(6):1897-903.

95. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher Rates of SVR in Genotype 2/3 Patients
Who Achieved an RVR with 24 vs 16 Weeks
p=0.20
16
weeks
SVR
(%)
24
weeks
111/122
95/100
*HCV
RNA
level
<400,000
IU/mL
Diago et al., Hepatology 2010 Jun;51(6):1897-903.

96. HCV-­‐2/3
RNA
quan)fica)on
SOC
Response-­‐Guided
Therapy
Ribavirin
(1000-­‐1400
mg.d-­‐1)
RNA
quan)fica)on
at
W4
HCV
RNA
HCV
RNA
undetectable
detectable
Consider
24
weeks
of
12-­‐16
weeks
therapy
RNA
quan)fica)on
at
W12
of
therapy1
Decrease
<
2
Log
Decrease
≥
2
Log
Decrease
≥
2
Log
HCV
RNA
detectable
HCV
RNA
undetectable
Stop
an)viral
Con)nue
Rx
un)l
W48
treatment
1In
paTents
with
a
low
viral
load
at
baseline
(<400,000
IU/mL);
Marginally
less
effecTve
due
to
higher
rates
of
relapse
in
genotype
3
with
high
HCV
RNA
leval
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.

97. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Benefits of Response-Guided
Therapy
• Reduce
unnecessary
exposure
to
drugs
– By
shortening
therapy
in
paTents
likely
to
achieve
SVR
without
requiring
the
full
duraTon
– By
terminaTng
therapy
early
in
paTents
unlikely
to
achieve
SVR
• May
iden)fy
pa)ents
who
do
not
need
a
protease
inhibitor
– Due
to
high
likelihood
of
SVR
with
pegIFN
plus
ribavirin
alone

98. Peginterferon
and
ribavirin
(SOC)

99. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shorter SOC Treatment Duration in
Genotype 1 Patients with RVR
Pa/ents
with
RVR
Pa/ents
without
RVR
Propor)ons
of
pa)ents
(%)
24
weeks
48
weeks
Jensen DM, et al. Hepatology. 2006;43:954-960.

100. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Shorter Treatment Duration in
Genotype 1 Patients with RVR
• A
recent
meta-­‐analysis
suggested
that
– In
paTents
infected
with
HCV
genotype
1
with
an
RVR,
24
weeks
of
therapy
with
SOC
should
be
considered
only
in
subjects
with
low
baseline
viral
loads
– The
opTmal
cut-­‐off
defining
low
baseline
HCV
RNA
level
(400,000-­‐800,000
IU/mL)
is
not
clearly
defined
Moreno et al., J Hepatol 2010; 52: 25-31.

101. HCV-­‐1
RNA
quan)fica)on
SOC
Response-­‐Guided
Therapy
Ribavirin
(1000-­‐1400
mg.d-­‐1)
RNA
quan)fica)on
at
W4
HCV
RNA
HCV
RNA
undetectable
detectable
Consider
24
weeks
of
RNA
quan)fica)on
at
W12
therapy1
Decrease
<
2
Log
Decrease
≥
2
Log
Decrease
≥
2
Log
HCV
RNA
detectable
HCV
RNA
undetectable
Con)nue
Rx
un)l
W24
If
HCV
RNA
Stop
an)viral
undetetectable
Con)nue
Rx
un)l
W48
treatment
Con)nue
Rx
Un)l
W72
1In
paTents
with
a
low
viral
load
at
baseline
(<400,000
IU/mL);
2In
paTents
with
a
low
viral
load
at
baseline
(400,000-­‐600,000
IU/mL)
EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.

102. Triple
combina/on
of
Peginterferon,
ribavirin
and
a
protease
inhibitor
(BOC
or
TVR)
Pa/ents
Naïfs

103. Stratégie diagnostique & suivi virologique
Higher SVR Rates in Patients Achieving
an RVR
ADVANCE
SPRINT-­‐2
SVR
(%)
Jacobson et al., N Engl J Med. 2011, 364:2405-2416; Poordad et al., N Engl J Med. 2011, 364:1195-1206.
.

104. Stratégie diagnostique & suivi virologique
RVR : An Early Guide to Success
• Pa)ents
who
achieve
an
RVR
have
a
very
high
chance
of
achieving
an
SVR
• This
applies
to
pegIFN
and
ribavirin
with
or
without
a
protease
inhibitor
But
• With
a
protease
inhibitor,
many
more
pa)ents
achieve
an
RVR
– Defined
as
Wk
4
of
triple
therapy
(i.e,
Wk
8
of
the
treatment
course
in
paTents
receiving
BOC)