Chevaliez Hcv Virus Et Marqueurs

VIRUS DE L’HEPATITE C
L’HEPATITE
& Marqueurs

Stéphane Chevaliez
Stéphane

Centre National de Référence
Centre National de Référence
Des Hépatites B, C et delta
Des Hépatites B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Hôpital Henri Mondor
Université Paris XII
Université Paris XII
Créteil
Créteil

Virus de l’Hépatite C
l’Hépatite
I. Aspects Virologiques

Virus de l’Hépatite C et Marqueurs

l’Hépatite

• Famille : Flaviviridae

• Genre : Hepacivirus

Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Adapted from Simmonds et al., 1999; 2001.


l’Hépatite

• Famille : Flaviviridae

• Genre : Hepacivirus

• Hôte naturel : Homme

• Tropisme : Hépatocyte


Organisation Structurale


Organisation Génomique
Génomique

Protéines structurales Protéines non structurales

Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463.


Fonction des Protéines du VHC
Protéines
Protéines VHC Fonction
Capside Nucléocapside
F/ARF ?
E1 Enveloppe, domaine de fusion
E2 Enveloppe, liaison au récepteur
P7/NS1 Canal ionique Ca-dépendant
NS2 Autoprotéase NS2-3
NS3 Sérine protéase
NTPase/hélicase
NS4A Cofacteur de NS3
NS4B Inducteur de la formation
du "membranous web"
NS5A Indispensable à la réplication,
transactivateur?
NS5B ARN polymérase ARN-dépendante


Protéine de Capside
Protéine

– Composant essentiel de la particule virale

(nucléocapside)

– Formé de deux domaines D1 et D2

– Interaction avec le métabolisme lipidique
. Inhibition de la MTP et de la sécrétion des VLDL

. Interaction via le domaine D2 avec les gouttelettes lipidiques

– Rôle dans la pathogenèse
. Déterminant majeur des lésions hépatiques (stéatose, …)

VHC génotype 1b
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.

y x
z

z x
y

Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.


Protéine NS3
Protéine

– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)

. NTPase/hélicase (région C-terminale)

– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3


Inhibition de la Production d’IFN
d’IFN
par NS3


Protéine NS3
Protéine

– Deux régions
. Sérine protéase (région N-terminale)

. NTPase/hélicase (région C-terminale)

– Modulateur de la réponse interféron via les TLR3

– Cibles de molécules antivirales
. Telaprevir (VX-950, Vertex)

. Boceprevir (SCH503034, Merck)

. R7227 (ITMN191, Roche/Intermune)

Site actif
(His57, Asp81, Ser139)

OPM Database, University of Michigan, College of Pharmacy.

Boceprevir (SCH 503034)

Telaprevir (VX-950)

R7227 (ITMN 191)


Log HCV RNA reduction from baseline
Activité Antivirale du TVR
Activité

1
Baseline
0
Placebo (n=6)
-0,21
-1
Telaprevir 450mg q8h
-2 -2,21 (n=10)

Telaprevir 1250mg
-3 -2,37 q12h (n=10)

-4 -4,41
Telaprevir 750mg q8h
(n=8)
-5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Days on treatment

Reesink et al., Gastroenterology 2006, 131: 997-1002.


Protéine NS5B: RdRp
Protéine

Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold
Des 1999, 7: 1417-1426.


Réplication Virale
Réplication

– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN monocaténaire
de polarité positive
Réplication

De Clercq., Nature Review Drug Discovery, 2007; 6: 1001-18


Anti-polymérases
Anti-polymérases

• Analogues Nucléos(t)idiques
– R7128 (Pharmasset)
– IDX184 (Idenix Pharmaceuticals)

• Analogues non nucléosidiques
– Filibuvir (Pfizer)
– ANA598 (Anadys Pharmaceuticals)
– GS 9190 (Gilead)
– ABT-333 (Abbott)


Cibles des Molécules Antivirales
Molécules
Site C (Palm)
Site A (Thumb/fingertips) (A-837093)
(JTK-109) Mutants: 411, 414, 448
Mutants: 495, 496, 499

A

B E
C
D

Site B (Thumb)
HCV-371 Site E (Finger, hypothetical)
Mutants: 419, 423, 482 GS-9190
Mutants: 445,448,452

Site D (Palm)
(HCV796) Site Actif
Mutants: 316 (R7128)
Mutants: 282
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA


Activité Antivirale du MK-0608
Activité MK-0608

wt S282R/T/I wt S282
MK-0608 at 1mg.kg-1 orally
7
6
HCV RNA (Log IU/mL)

5
4
3
2 - 4,6 - 4,1
LOQ
1 (20 IU/mL)
TMA + + + + - - - - - - - - + +
0
-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Days


Cycle Viral

Moradpour et al., Nature Reviews Microbiology, 2007; 5: 453-463


Modèle d’Entrée Virale
Modèle d’Entrée



Cycle Viral



Maturation de la Polyprotéine
Polyprotéine



Structure des Protéines NS
Protéines



"Membranous Web"

Huh7 naïves

Huh7 infectées
(réplicon)

Gosert et al., J Virol 2003, 77(9): 5487-5492.

l’Hépatite
II. Modèles d’Etude
Modèles d’Etude


Modèles Animaux
Modèles

Souris transgéniques
Souris SCID/uPA


Modèles Cellulaires
Modèles

• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp)
• Réplicons génomiques et subgénomiques
• Système productif (HCVcc)


Modèles Acellulaires
Modèles

• Modèles enzymatiques
- Protéase NS3/4A
- ARN polymérase ARN-dépendante (NS5B)
- Cyclophyline B


Mesure de l’Activité Enzymatique
l’Activité
de RDRp
Agent intercalant

RdRp
PAS DE FLUORESCENCE

Matrice ARN simple-brin homopolymérique
simple- homopolymé

Agent intercalant FLUORESCENCE

RdRp
ARN double-brin
double-

- Simple
- Sensible
- Reproductible
A. Ahmed-Belkacen, 2007.
- Miniaturisé en microplaques 96 puits

l’Hépatite
III. Variabilité Génétique
Variabilité Génétique


Dynamiques Virales du VIH, VHB et
VHC

HIV HBV HCV

Daily virion production 1010 1012 - 1013 1012

Half-life of free virions (hr) 1 4 (<1) 2-3

Half-life of intracellular
Days Months Hours
virions
Mutation rate Very high High Very high

Viral reservoir Integrated cDNA cccDNA No

Soriano et al., J Antimicrob Chemother 2008, 62: 1-4, Murray et al., Hepatology 2006, 44: 1117-1121; Dandri et al., Hepatology 2008, 48(4):1079-86.


ARN Polymérase ARN-dépendante
Polymérase ARN-dépendante

• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10-4-10-4 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard

• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
⇒
("proofreading")
– Accumulation de mutations

• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces


Diversification des Génotypes
Génotypes
Central
Africa
7

Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.


Répartition Géographique
Répartition Géographique

1a,

Adapted from Fang J., et al. J. Clin Liver Dis., 1997.


Génotypes en France
Génotypes
2%

9,5%

1a
1a

19% 60%
60% 1b
1b

11

9,5%

G1 G2 G3 G4 G5


Intérêts de le Détermination des
Intérêts Détermination
Génotypes
Génotypes

• Détermination systématique du
génotype
– Facteur prédictif de la réponse au
traitement
– Conditionne
. La dose de ribavirine
. La durée du traitement (24 vs 48-72 semaines)


Distribution en Quasi-espèce
Quasi-espèce

Weiner et al., Virology 1991; 180:842-848; Martell et al., J Virol 1992;66:3225-36.


Mécanismes d’Evolution de la
Mécanismes d’Evolution
Quasi-espèce
Quasi-espèce

• Dérive génétique
– Accumulation de mutations ponctuelles

• Glissement génétique
– Suite à la modification brutale de l’environnement
réplicatif


Distribution en Quasi-espèce
Quasi-espèce
• Joue un rôle dans le maintien de
l’infection chronique

• Joue un rôle dans l’échec des
traitements antiviraux

• Joue un rôle dans la sévérité de la
maladie

Farci P, 2000; Science, 288: 339-344; Lavillette D, 2005; Journal of Virology, 79(10): 6023-6034; Farci P, 2002; PNAS, 99: 3081-3086;
Chambers TJ et al., 2005; 79: 3071-3083; Sullivan et al., JID 2007, 196: 239-248.

l’Hépatite
IV. Exemples d’Application
d’Application
de la Variabilité Génétique


Impacts de la Variabilité Génétique
du VHC

• Diversification et diffusion du VHC

• Transmission du VHC

• Mécanismes de persistance et d’infection du VHC

• Compartimentation tissulaire du VHC

• Mécanisme d’échec thérapeutique et de
résistance


Diversification des Génotypes
Génotypes
Central
Africa
7

Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.


Génotype & Mode de Transmission
Génotype

100%

80%

60% 63%
3
52% 1b
40% 54%
1a
Autres
20%

0%
UDVI Transfusion Autres

Pawlotsky et al., J Infect Dis, 1995; 171(6): 1607-10.


Génotype & Mode de Transmission
Génotype

100%

80%
36% 4
60% 3
2
39% 1b
40% 1a
1nt
20% 27%

0%
UDVI Transfusion Autres

Payan et al., J Viral Hepat 2005;12: 405-13.

JK049
HCV-3k TrKj
Virus de l’Hépatite C et Marqueurs HCV-3b NE125
HCV-3f NE048

Génotype 3a
HCV-3c
98
100

HCV-3a 62

Chez les UDVI 98

92
63

99

81

Argentine
60

Brézil

Australie

France

USA, Côte Est
56

USA, Côte Ouest
52

71
95

0.1 substitution per site

62

83

75
72
79

Morice et al., J Med Virol 2006;78:1296-1303.


Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
• Mise en évidence d’une séroconversion VHC lors du
dépistage et du suivi des patients hémodialysés en
juillet 2005, à l’hôpital Henri Mondor
• L’ensemble des patients hémodialysés ont été
testés (anticorps anti-VHC et ARN viral)
– Mise en évidence d’un 2nd cas au cours de la même période

• Analyses génétique et phylogénique
• Recherche du VHC dans l’environnement
– Supports et surfaces inertes


Transmission Nosocomiale
"Mondorienne"
Identification de deux cas de
séroconversion en 2004 au sein de l’unité
d’hémodialyse de l’hôpital Henri Mondor :

– Patient "1" infecté par un génotype 3a

– Patient "2" infecté par un génotype 1

Virus de l’Hépatite C et Marqueurs Genotype 4
4a_ED43
Genotype 3 100 3a_NLZ1

Analyse Genotype 6
Genotype 5
Genotype 2 5a_SA13
6a_EUHK2
Patient 1

2a_HCJ6

Phylogénique
Phylogénique Patient 2**
100 Patient 2*
Patient 3
1k_QC82
1k_QC68
1j_QC89
1j_QC2
1a_HCJ1
1a_HCVH
1a_HCV1
1g_EG024
1g_2152
1g_1382
Région NS5B (329 nt) 1e_QC172
CLUSTALX 1e_CAM1078
DNADist (PHYLIP 3.5) 1e_M4541N
1l_98CM1457
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2) 1l_98CM1427
Neighbor-Joining 1l_M5186N
Bootstraping : 1000 replicates 1c_Khaja1
NJPlot 1c_SR031
1c_HCG9
1b_HCVBK
G1
1b_HCP01
Patient 4
Patient 5
100 Patient 6
Patient 7
1b_HCJ4
Patient 8
1d_FR17
1d_BA107
Genotype 1 1d_HC1N16
1m_GUI24
1m_GUI11
1m_GUI17
1iQC181
Séroconversion VHC 1i_QC77
1i_FR16
Patients VHC chronique 1f_FR2
1h_98CM1357
0.05 1h_98CM1521
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633. 1h_FrSSD98


Analyse Phylogénique
Phylogénique
4a_ED43
Patient 7
Patient 4
Patient 8
1b_AWV2C33
Patient 6
1a_HCT18X5
Région HVR1 (81 nt) 3a_CB
CLUSTALX 2a_Q2B
DNADist (PHYLIP 3.5) 1a_HCT27X5
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Patient 3 (01/05)
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot

Patient 3 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 2 (7/04)
100 Patient 3 (9/05)
Patient 3 (7/05)

1b_HVR3812
5a_SA13
Patient 1 (7/04)
2b_JFH1
6a_33
Séroconversion VHC 0.2
Patients VHC chronique

Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.


Phylogénique
4a_ED43
Patient 7
Patient 4
Patient 8
1b_AWV2C33
Patient 6
1a_HCT18X5
Région HVR1 (81 nt) 3a_CB
CLUSTALX 2a_Q2B
DNADist (PHYLIP 3.5) 1a_HCT27X5
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2) S1 (6/05)
Neighbor-Joining
Patient 3 (01/05)
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
S2 (6/05)
S3 (6/05)
S4 (6/05)
Patient 3 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 2 (7/04)
100 Patient 3 (9/05)
Patient 3 (7/05)
S5 (7/05)
1b_HVR3812
5a_SA13
Patient 1 (7/04)
2b_JFH1
Surfaces inertes 6a_33
Séroconversion VHC 0.2
Patients VHC chronique

Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.


Transmission Nosocomiale au
Bénin
Bénin
• Screening de 64 patients hémodialysés à l’hôpital
Hubert Kutuku Maga, Cotonou, Bénin (Afrique)
– Détection anticorps anti-VHC
– Détection ARN VHC (limite détection <50UI/mL)

• Etude génétique et phylogénique de deux régions
distinctes du génome viral
– NS5B
– Core-E1


Phylogénique 1mGUI24
1mGUI11
1mGUI17
1dBA107
1dHC1N16
1dFR17
99 Patient 26
Patient 52
59 Patient 60
98 Patient 48 Génotype 1, sous-type i
96 1iQC181
1iQC77
1iFR16
Patient 40
1bHCP01
34
100
1bHCVBK Génotype 1, sous-type b
1bHCJ4
Patient 7
Région NS5B (286 nt) Patient 8
Patient 17
CLUSTALX Patient 18
DNADist (PHYLIP 3.5) Patient 36
Matrice de distance: Kimura 2- 100
Patient 16
Patient 64
Génotype 1, sous-type ?
parameter (Ts/Tv=2) Patient 28
Patient 2
Neighbor-Joining Patient 54
72 Patient 46
Bootstraping : 1000 replicates Patient 59
NJPlot 1fFR2
1l98CM1457
43 1l98CM1427
1lM5186N
1gEG024
1g2152
1g1382
1eQC172
1eCAM1078
1eM4541N
Génotype 1
1kQC82
1kQC68
1jQC89
1jQC2
1aHCJ1
1aHCVH
1aHCV1
1cKhaja1
1cSR031
1cHCG9
1h98CM1521
1h98CM1357
Génotype 4 1hFrSSD98
4aED43
Génotype 3 100 Patient 62
0.05 Génotype 6 3aNLZ1 Génotype 3, sous-type a
6aEUHK2
Génotype 2
2aHCJ6
Patient 49 Génotype 2
Génotype 5
5aSA13


Transmissions Nosocomiales
1bHVR3812
1bAWV2C33
Patient 60
Patient 48
Patient 52
Patient 40
Patient 26
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX Patient 59
DNADist (PHYLIP 3.5)
5aSA13
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2) Patient 46
Neighbor-Joining Patient 54
NJPlot
Patient 64
Patient 28
Patient 2
Patient 17
Patient 18
Patient 16
Patient 8
Patient 7
1aHCT27X5
4aED43
6a33
1aHCT18X5
2bJFH1
0.2 3aCB
2aQ2B


Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région NS5B
1c_AY051292 1c_AY051292
1c_D14853 1c_D14853
1a_M62321 1a_M62321
1a_M67463 1a_M67463
1k_AY434112 1k_AY434112
1k_AY434122 1k_AY434122
1j_AY434128 1j_AY434128
1j_AY434158 1j_AY434158
1h_AY434131 1g_AF271820
1i_AY434119 1g_AF271822
1b_D90208 1e_AY894555
1b_M58335 1b_D90208
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE 1d_L39299 PARCIMONIE 1b_M58335
1d_L39302 1d_L39299
1g_AF271820 1d_L39302
1g_AF271822 1i_AY434119
1e_AY894555 1h_AY434131
1f_L38350 1f_L38350
Patient 46 Patient 46
Patient 7 Patient 8
Patient 8 Patient 7
0.05


Assignation Provisoire d’un Nouveau
Sous-type : Etude de la région Core-E1
1h_AY257087
1a_M62321
1h_AY434132
1a_M67463
1f_L38371
1j_AY434106
1a_M62321
1j_AY434129
1a_M67463
1k_AY434113
1j_AY434106
1k_AY434123
1j_AY434129
1e_L38361 1k_AY434113
1e_AY894553
1k_AY434123
1g_AF271798
1e_L38361
1g_AF271797
1e_AY894553
1c_D14853
1g_AF271798
1c_AY051292
1g_AF271797
1l_AY257083
1c_D14853
1l_AY257091
1c_AY051292
1f_L38371
1l_AY257083
MAXIMUM DE VRAISEMBLANCE 1b_D90208 PARCIMONIE 1l_AY257091
1b_L38372
1b_M58335
1b_M58335
1b_L38372
1i_L48495
1b_D90208
1i_AY434120
1i_L48495
1d_L38377
1i_AY434120
1h_AY257087
1d_L38377
1h_AY434132
Patient 8 Patient 8
0.02 Patient 64
Patient 7


Transmission Nosocomiale en Grèce
Grèce

• Epidémie à VHC au sein d’une unité d’hémodialyse en
Grèce ("Papageorgiou General Hospital", Thessaloniki)
Hospital
• 17 patients hémodialysés contaminés en quelques
mois

• Analyses génétique et phylogénique
• Etude de la réponse neutralisante
– Système HCVpp

Lavillette et al., J Virol 2005;79:6023-34


Phylogénique
1a HCV-1
HCV-H
1c SR052
HC-G9
SR037

HCV-1 HC-J4
HCV-BK
BE90
Pt-16
Région HVR1 (81 nt)
1b Pt-2
CLUSTALX Pt-4
DNADist (PHYLIP 3.5) Pt-3
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Pt-1
Pt-17
Souche A
NJPlot Pt-7
Pt-6
Pt-8
Pt-11
Pt-10
0,1 substitution per site Pt-9
Pt-5
Pt-12
Pt-13
Souche B
Pt-15



Réponse Neutralisante - Groupe 1
Réponse

• Absence de réponse neutralisante et absence de
contrôle de l’infection

ARN VHC % neutralisation
(UI/mL) infection
1,E+08 100
200 Huh7
1,E+07
90
180
80
Patient-10 (souche B)
70
160
60
1,E+06 140
50
40
120
1,E+05 30
20
100
1,E+04 10
80
0
ARN VHC
-10
60
1,E+03
-20 Réponse Neutralisante
40
-30
1,E+02 -40
20
-50
Contrôle Neutralisation
1,E+01 -60
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 ALAT
Semaines



Réponse Neutralisante - Groupe 2
Réponse

• Réponse neutralisante forte et spécifique
• Réponse neutralisante inversement proportionnelle
à la cinétique de la charge virale
ARN VHC
(UI/mL) % neutralisation
infection
1,E+08 100
200 Huh7
90
180
Patient-1 (souche A)
1,E+07
80
160

1,E+06 70
140

60
120
1,E+05
50
100
1,E+04
40
80
ARN VHC
1,E+03 30
60
Réponse Neutralisante
20
40
1,E+02
10
20
Contrôle Neutralisation
1,E+01
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
0
ALAT
Semaines



Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë

Hépatite Chronique
50 - 80%
Stéatose
20 - 30 ans

Fibrose

Cirrhose 20 - 30%

Décompensation HCC
6 - 10% 4-5% par an

Mortalité


Histoire Naturelle
Hépatite Aiguë

Hépatite Chronique
50 - 85%
10 - 30 ans

Cirrhose 20 - 30%

Décompensation HCC
6 - 10% 4 - 5% par an

Mortalité


Persistance Virale

• Persistance virale
– Echec de la réponse immune, pourtant
présente et adaptée, à éliminer le virus ou les
cellules qui l’abritent

• Interface complexe


Processus Multi-étape
Hépatite Aiguë

Infection Chronique

Hépatite Chronique
50 - 85%

1. Mise en place de l’infection aiguë

2. Etablissement de la persistance virale

3. Maintient de l’infection au cours du temps


Processus Multi-étape
Hépatite Aiguë

Infection Chronique

Hépatite Chronique
50 - 85%

1. Mise en place de l’infection aiguë

2. Etablissement de la persistance virale ?

3. Maintient de l’infection au cours du temps


Persistance du VHC

Adapted from Ferrari C, Gasroenterology 2007; 132(2): 801-805


Compartimentation Plasma-PBMC
Plasma-PBMC

Région 5’NC Région E1-E2
(Pt-3) (Pt-3)

Roque-Afonso et al., J Virol 2005;79:6349-57)


Résistance du VHC
Résistance

• Résistance naturelle du VHC à
l’interféron

• Résistance du VHC à la thérapie par
l’interféron

• Résistance du VHC aux inhibiteurs
spécifiques (DAA)

HEPATITE C : Stratégie
Stratégie
Diagnostique & Suivi
Virologique

l’Hépatite
I. Cinétique des Marqueurs
Cinétique
Virologiques

Stratégie diagnostique & suivi virologique

Marqueurs Virologiques

Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside
ARN VHC
Génotype VHC


Cinétique des Marqueurs
Cinétique
Infection Aiguë

Symptômes +/-

Anti-VHC

ARN VHC
Titre

ALAT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Temps après contage (mois)


Cinétique des Marqueurs
Cinétique
Infection Chronique Anti-VHC

Symptômes +/-

ARN VHC
Titre

ALAT

Normal

0 1 2 3 4 5 6 12 24 36 48
Temps après contage (mois)

II. Tests Virologiques


Tests Virologiques Moléculaires
Moléculaires

Tests qualitatifs Tests quantitatifs
Très sensibles Seuil de détection ≥ qualitatifs
≤
(≤ 50 IU/mL)
Quelle quantité est présente ?
Est-ce que le VHC est présent ?

Détermination
du Génotype

Quel type de VHC est présent ?


Tests Virologiques Moléculaires
Moléculaires

Tests Qualitatifs - Quantitatifs

Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?

Détermination
du Génotype

Quel type de VHC est présent ?


Intérêts de la Détection -
Intérêts Détection
Quantification de l’ARN VHC
l’ARN

• Evaluation de la réplication virale chez des
patients anticorps anti-VHC positifs

• Evaluation de la réponse virologique au
cours du traitement standard
– Interféron pégylé alpha-2a ou -2b
– Ribavirine


Cinétiques & Réponses au
Traitement
Peg-IFN-RBV
8

7
ARN VHC (Log10 UI/mL)

6

5
Diminution ≥ 2 Log
4

3

2
Limite de détection
1 (10-15 UI/mL)

0
0 4 8 12
Semaines


Cinétiques & Réponses au
Traitement
Peg-IFN-RBV
8

7
ARN VHC (Log10 UI/mL)

6

5
Diminution ≥ 2 Log
4

3 RV lente
RVR
2
RVP Limite de détection
1 (10-15 UI/mL)

0
0 2 4 8 12
Semaines


Techniques Disponibles

b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction

Amplification du signal Amplification de la cible

Quantitative Quantitative


Principe des Techniques

b-DNA PCR
Branched DNA Polymerase chain reaction

Amplification du signal Amplification de la cible

Quantitative Quantitative


bDNA : Forces & Faiblesses
• Forces
– Quantification indépendante du génotype
– Tolérance de polymorphismes nucléotidiques
– Faible volume de prise d’essai
– Large intervalle de quantification linéaire
. ≥ 6,90 Log10 UI/mL

• Faiblesses
– Faible sensibilité
. LLOD: 2,80 Log10 UI/mL
– Faux positifs dans les faibles valeurs
– Méthode semi-automatisée (Siemens system 440 analyzer)
– 12 contrôles par run


Avantages Techniques de la PCR
en Temps Réel
– Diminution du risque de contamination
– Amélioration de la sensibilité
– Augmentation de l’intervalle de quantification
linéaire
– Précision et reproductibilité
– Augmentation de débit à travers
l’automatisation
– Diminution des coûts


Intervalles de Quantification
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0

SuperQuant

LCx HCV RNA
Assay

Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)


Intervalles de Quantification
10 102 103 104 105 106 107 108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0

SuperQuant

LCx HCV RNA
Assay

Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)

TaqMan 48 HCV
(Roche)

HCV Quant ASR
(Abbott)

Versant HCV RNA
1.0 (kPCR, Siemens)*

*en développement


Avantages Techniques de la PCR
en Temps Réel
– Diminution du risque de contamination
– Amélioration de la sensibilité
– Augmentation de l’intervalle de quantification
linéaire
– Précision et reproductibilité
– Augmentation du débit à travers
l’automatisation
– Diminution des coûts


Avantages Cliniques de la PCR
en Temps Réel

• Remplace les techniques qualitatives de
détection de l’ARN VHC

• Quantifie l’ensemble des charges virales
observées en pratique clinique
– Faibles charges virales au cours du traitement

• Surveille efficacement les cinétiques
virales (évaluation précoce des réponses
virologiques au traitement)


(CTM, Roche)
8
HCV RNA level in CAP/CTM48 (Log10 IU/mL)

7

Genotype 1 (n=29)
6
Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
5
Genotype 4 (n=30)
Genotype 5 (n=9)
4 Genotype 6 (n=2)

r = 0.889; p < 0.0001
3
3 4 5 6 7 8
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA
(Log10 UI/mL)
Chevaliez et al., 2007; Hepatology, 46(1): 22-31.


Différences de Quantification
Difference between HCV RNA levels measured in
CAP/CTM and in bDNA (in Log10 UI/mL)
CAP-CTM48 (Roche) versus bDNA 3.0 (Siemens)
1.5

1.0

0.5
Genotype 1 (n=29)
0.0 Genotype 2 (n=27)
Genotype 3 (n=29)
-0.5
Genotype 4 (n=30)

-1.0 Genotype 5 (n=9)
Genotype 6 (n=2)
-1.5

15%
30%


Absence de Détection de l’ARN Viral de
Patients Infectés par un VHC de Génotype 4

(Log10IU/mL) CAP/CTM96 m2000SP/m2000RT Versant 3.0
Patient 1 (4h) <1.08 5.4 5.0
Patient 2 (4l) <1.08 6.0 5.7

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.........|
F_7157 (4a): TAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATCGCCGG
Patient 1 (4h): ...........................A.....................................A...................T...............
Patient 2 (4l): ...........................A.....................................A...................T...............

190 200 210 220 230 240 250 260 270
.........|.........|......-...|.........| .........|.........|.........|.........| .........|........
F_7157 (4a): GATGACCGGGTCCTTTCTTGGATTAA-CCCGCTCAATGCCCGGAAATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCC
Patient 1 (4h): ......................A.T.A..........................................................................
Patient 2 (4l): .......................C..-.......................................................C.......T..........

280 290 300 310 320 330 340
|.........|.........|.........|.........|.........|.........|.
F_7157 (4a): TTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC
Patient 1 (4h): .............................................................
Patient 2 (4l): .............................................................

Chevaliez et al., 2008; Hepatology, 49(4): 1397-1398.


Quantification de Transcrits d’ARN Sauvages
ou Mutés en Position 145 et/ou 165

Measured HCV RNA levels (Log10 IU/mL)

HCV 5’NC sequence Real-time PCR assays bDNA assay

CTM m2000 Versant 3.0

Wild-type (G145 and
5.73±0.13 6.05±0.10 6.43±0.01
A165)
Single mutant (G145A and
4.02±0.13 6.00±0.11 6.69±0.02
A165)
Single mutant (G145 and
4.28±0.35 5.88±0.20 6.30±0.02
A165T)
Double mutant (G145A
<1.08* 5.95±0.25 6.60±0.18
and A165T)
*Target not detected

Chevaliez et al., Hepatology, 2009, 50(5): 1681.


(m2000, Abbott)
HCV RNA level in m2000SP/m2000RT (Log10 IU/mL)
8

7

Genotype 1 (n=55)
6
Genotype 2 (n=21)
Genotype 3 (n=29)
5
Genotype 4 (n=24)
Genotype 5 (n=9)
4 Genotype 6 (n=3)

r = 0.972; p < 0.0001
3
3 4 5 6 7 8
HCV RNA level in Versant HCV 3.0 Assay bDNA
(Log10 UI/mL)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.


(kPCR, Siemens)

132 clinical samples

David Sherman., Molecular Symposium, September 2007 (source: Siemens Medical Solutions Diagnostics).


Génotypes du VHC
Génotypes
Central
Africa
7

Simmonds et al. Hepatology 2005; Murphy et al., AASLD, Hepatology, 2007.


Intérêts de la Détermination du
Génotype
Génotype
• Détermination systématique du
génotype
– Facteur prédictif de la réponse au
traitement
– Conditionne
. La dose de ribavirine
. La durée du traitement (24 vs 48 semaines)


Détermination du Génotype
Détermination Génotype

• Détermination moléculaire du génotype
VHC (génotypage)

• Détermination sérologique du génotype
VHC (“sérotypage”)


Régions Virales Ciblées
Régions Ciblées

– Complete genome (new subtype
identification)

– NS5B coding region (the reference region)

– Envelope E1 coding region (the second
reference region)

– 5’-untranslated region, 5’UTR (the most
frequently used in practice)


Méthodes Moléculaires de Génotypage
Méthodes Moléculaires Génotypage

• Séquençage direct des produits d’amplification1

• Hybridation inverse des produits d’amplification sur
support solide : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)

• PCR en temps réel à l’aide de primers et/ou sondes
génotype spécifiques

• Autres méthodes :
– Restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP)
– Single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP)
– Spectrométrie de masse MALDI-TOF après miniséquençage

Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.


Analyse Après Séquençage Direct

• The reference method

• Direct sequence analysis of NS5B or,
eventually , E1 is used for accurate
genotype and subtype determination

• Direct sequence analysis of the 5’UTR can
be used in clinical practice.


TRUGENE® HCV 5’NC Genotyping
(Siemens)

• One-step RT-PCR generating a 244-bp fragment

• PCR products are sequenced in both senses

• Forward and reverse sequences are aligned
with prototype reference strain sequences from
the GeneLibrarian database

• The HCV genotype is determined by sequence
homology

Young et al., J Clin Microbil, 1993; 31: 882-86; Roos et al., J Cli Microbiol, 2000; 38(10): 3581-84; Germer et al., J Clin Microbiol, 2003; 41(10): 4855-577


Analyse Après Séquençage Direct

• Pros
– Reference method for HCV genotype and subtype
determination
– Can be used, with the appropriate target region, for
. Identification of new subtypes
. Molecular epidemiology studies
– Assays are available for use in clinical practice

• Cons
– Mixed genotype infections are not detected
– Labor intensive and time-consuming
– Costly


Hybridation Inverse

• Line probe assay

• Based on reverse hybridization of PCR
products onto genotype-specific probes

• Two generations of assays
– 1st-generation assay: probes in the 5’UTR
– 2nd-generation assay: probes in the 5’UTR and
core region


Versant® HCV Genotype 2.0 Assay
®

(INNO-LiPA)
(INNO-LiPA)


Hybridation Inverse

• Pros
– Easy to use and potential semi-automation (Auto-
LiPA)
– Cheaper
– Mixed genotype infections can be detected

• Cons
– Should not be used for identification of new
subtypes or molecular epidemiology studies
because of possible mis-subtyping


Intérêts de la Détermination du
Sous-Type ?
Sous-Type
• DAA drugs may have different antiviral
efficacies on different HCV genotype 1
subtypes in vitro and in vivo

• DAA drugs administration may be associated
with different resistance profiles with different
HCV genotype 1 subtypes in vitro and in vivo


Activité Antivirale Sous-Type
Dépendant

• BILB 1941, an NNI inhibitor of HCV RNA-
dependent RNA polymerase, showed better
antiviral efficacy in HCV subtype 1b than in
subtype 1a
– In vitro, EC50s: 84 nM in subtype 1a vs 153 nM in
subtype 1b
– In vivo, over 5 days of administration in HCV-infected
patients

Erhardt et al., Antivir Ther 2009, 14: 23-32.


Profil de Résistance Sous-Type
Dépendant
• HCV genotype 1 subtype-specific resistance to
telaprevir
– In vitro, R155K substitutions are selected only in genotype
1a replicons
– In vivo, amino acid substitutions at positions 36 and 155 are
selected only in patients infected with subtype 1a

• HCV genotype 1 subtype-specific fitness of
variants resistant to HCV-796
– In patients infected with subtype 1b, the C316Y substitution
is found alone in fit resistant variants
– In patients infected with subtype 1a, the C316Y substitution
requires additional substitutions to gain full fitness

Kieffer et al., hepatology 2007, 46: 631-639; Sarrazin et al., Gastroenterology 2007, 132: 1767-1777;; Delano et al., 1st International Workshop on
HepC Resistance and New Compounds 2006; McCown et al., Antimicrob Agents Chemother 2009.


Importance de la Région Virale
Région
pour la Détermination du Sous-type
Détermination Sous-type

1st Generation of 2nd Generation of
Sequence Analysis RealTime HCV
Line Probe Assay Line Probe Assay
of the 5’NCR Genotype II
(LiPA 1.0) (LiPA 2.0)

GT 1a 77.6% 70.5% 97.5% 93.2%
(n=237) (n=184) (n=167) (n=231) (n=220)

GT 1b 90.5% 91.3% 96.2% 88.6%
(n=263) (n=238) (n=240) (n=253) (n=233)

Chevaliez et al., PLoS One 2009, 4(12): e820.


Intérêts des "Nouveaux" Tests
Intérêts
Sérologiques ?
Sérologiques

• Détection - quantification de l’antigène de
capside (AgC)

• Test de détection des antigènes et des
anticorps (combo)


Antigène de Capside : Marqueur
Indirect de la Réplication Virale

r = 0.92; p < 0.0001

Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218.


Intérêts de la Détection-
Quantification de l’Ag de Capside
• Diagnostic de l’infection virale C
– Marqueur sérologique précoce
. Réduction de la fenêtre sérologique à environ 20 jours
. Génotype-indépendant
– Facile à mettre en œuvre, rapide, bon marché (ELISA
automatisée)
– Trousse commerciale

• Décision de traiter et Monitoring de l’efficacité du
traitement
– Marqueur indirect de la réplication virale
. 1 pg d’Ag C ≈ 8 000 UI/mL ARN
– Alternative aux méthodes moléculaires de quantification de l’ARN
– Seuil de quantification équivalent à 20 000 UI/mL d’ARN

Bouvier-Alias et al., Hepatology 2002, 36(1): 211-218; Mehdi et al., Clin Biochem. 2008, 41(18):1493.


Détection Simultanée Ag/Ac
(Test Combo)
• Diagnostic de l’infection virale C
– Réduction de la fenêtre sérologique (~20 jours)
. ~60 jours avec les dernières générations de trousses anticorps
. ~40 jours ave les trousses Combo
– Alternative aux méthodes de DGV
– Facile à mettre en œuvre, rapide (ELISA automatisé)
– Trousses commerciales

– Pas aussi sensible que les méthodes qualitative de détection
de l’ARN et de détection de l’Ag de capside

Laperche et al. J Clin Micribiol 2005, 43(8): 3877-3883; Alzahrani AJ., J Med Virol 2008, 80(4): 603-6.

III. Diagnostic Virologique


Diagnostic de l’Infection Aiguë
l’Infection Aiguë

Ac anti-VHC ARN VHC* Diagnostic

- - Absence d’infection aiguë

- + Infection aiguë C

+ - Probablement pas d’infection
aiguë

+ + Difficile de conclure

* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL


Diagnostic de l’Infection Aiguë
l’Infection Aiguë

• Facteurs supplémentaires à prendre en
compte chez des populations à risque

– Niveaux de charges virales

– Variation de la charge virale 4 et 10 semaines
après la suspicion de l’hépatite aiguë

– Activité sérique des transaminases

McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.


Algorithme pour le Diagnostic de
l’Hépatite Aiguë*
Suspicion d’hépatite aiguë

ARN VHC Fluctuations ARN Fluctuations ARN
Séroconversion
< 5Log10 UI/mL >1 Log10 UI/mL <1 Log10 UI/mL
ou
ARN VHC
> 5 Log10 UI/mL

ALAT> 7xLSN ALAT> 7xLSN

Probabilité Probabilité Probabilité
Hépatite aiguë
élevée modérée faible
*population à risque (IDVU)
McGovern et al., CID 2009, 49: 1051-1060.


Diagnostic de l’Infection Chronique
l’Infection

– Détection des anticorps anti-VHC totaux par
ELISA

– Recherche d’ARN du VHC par un test
sensible*

– Détection d’ARN du VHC* si le test ELISA
est négatif chez des patients hémodialysés
ou immunodéprimés

* Technique sensible seuil de détection ≤ 10-15 UI/mL

III. Prise en Charge Thérapeutique


Intérêts des Tests Virologiques en
Intérêts
Thérapeutique
Thérapeutique
– Décision de traiter

– Optimisation du schéma
thérapeutique

– Etude de la réponse virologique au
traitement

Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20.


Classification des Patients

Génotypes VHC

Type Types Types
1 2, 3 4, 5, 6

Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20


Indications Actuelles du Traitement

• Patients infectés par un VHC de génotype 1
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)
– Durée : 48 semaines

• Patients infectés par un VHC de génotype 2/3
– Interferon pégylé plus ribavirine (800 mg/j)

• Patients infectés par une VHC de génotype 4, 5 et 6
– Interferon pégylé plus ribavirine (1000 - 1400 mg/j)

Consensus conference: treatment of hepatitis C; 2002, Gastroenterol Clin Biol, 26(2): B303-20

Génotype VHC
VHC-1 (4,5,6) VHC-2,3
Quantification ARN

Bithérapie Bithérapie
48 semaines 24 semaines
Ribavirine 1000-1400 mg Ribavirine 800 mg

Quantification ARN à S12

Diminution < 2 Log Diminution ≥ 2 Log diminution ≥ 2 Log
ARN VHC + ARN VHC -

Arrêt traitement
poursuite avec Poursuite jusqu’à
IFN pégylé pour S24
ralentir la
progression de la Si ARN VHC -
maladie Poursuite jusqu’à Poursuite jusqu’à
hépatique S48 S48


Optimisation du Traitement en
Fonction de la Réponse Virologique
Réponse

• Outils virologiques sensibles
– Sensibilité : 10-15 UI/mL
– Evaluation de la réponse au traitement

• Répondeurs virologiques rapides
– Raccourcissement de la durée de traitement

• Répondeurs virologiques précoces partiels
– Allongement de la durée de traitement

Raccourcissement de la
Durée de Traitement

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