Thesis for Laurea Specialistica in Biology

1. “ CLICK CHEMISTRY”: UN NUOVA STRATEGIA NELLO STUDIO DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE Relatore: Candidato: Prof. Stefano Papa Paolo Elia Cappella Matricola 224444 Discussione Tesi di Laurea 21 Ottobre 2009 Università degli Studi “Carlo Bo” di Urbino Facoltà di Scienze e Tecnologie Corso di Laurea Specialistica in “Tecnologie applicate alla diagnostica di laboratorio biomedico”

2. Paolo Elia Cappella Introduzione Gratzner HG. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 1982 E’ il “Gold standard” per lo studio della proliferazione, sostituendo l’uso della timidina triziata… … e in più di 15.000 pubblicazioni è stata usata (in oncologia, ma anche in immunologia, microbiologia, neurobiologia, biologia marina, etc) dal 1982 al 2008 5-Bromo-2’-deoxyuridine

5. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Durante la fase S Reazione di cicloaddizione Azide-Alchino catalizzata da Cu +1 (CuAAC) Rivelazione mediante mAb anti-BrdU Click-IT ™ (Invitrogen ®)

6. Paolo Elia Cappella Probes per Click Chemistry AlexaFluor488 ™ azide (Invitrogen) Probes usati nello studio TsCl NaN 3

7. Paolo Elia Cappella Click Chemistry e DNA LC/MS ESI +/- 1 H-NMR 500Mhz

8. Paolo Elia Cappella Click Chemistry e DNA EdU esibisce una moderata attività citotossica, in confronto a BrdU. Considerando però che può essere usata 20 volte meno della BrdU dando un buon segnale, i margini di tollerabilità sono comparabili. Inoltre trattamenti brevi (1h) portano a perturbazioni transienti. ATP-Glow Promega in 96wells (chemoluminescenza) Cappella, Cytometry A (2008)

9. Paolo Elia Cappella Click Chemistry e DNA FCM – verde (AlexaFlor488 ™) EdU viene incorporata nel DNA a basse concentrazioni (0.1-1  M) già a partire da 20 minuti Cappella, Cytometry A (2008) ctrl 0.01 µM 0.1 µM 1 µM 10 µM ctrl 0.01 µM 0.1 µM 1 µM 10 µM 1 µM 1h 1h

10. Paolo Elia Cappella Click Chemistry: titolo della BrdU azide La Reazione tra EdU e BMA è velocissima: già dopo 5 min e con BMA a 5 x 10 -8 mol/M cellule si osserva plateau di segnale. Titolazione in FCM del probe BrdU monoazide (BMA) % cellule positive Rapporto S/N FCM data Reazione 12’

11. L’approccio con Brdu Azidi è superiore a quello con AlexaFluor ™ azidi in quanto non è affetto dal quenching con ioduro di propidio, risultantando in un elevato rapporto S/N Paolo Elia Cappella Effetto del PI sulla fluorescenza Confronto tra AlexaFluor ™ azide e BrdU azidi (BMA/BDA) in FCM Cappella, Cytometry A (2008) S/N 4 S/N 19 S/N 34 S/N 27 S/N 19 S/N 2 S/N 2 S/N 16 S/N 21

12. Paolo Elia Cappella Titolazione delle Azidi in cellule U2-OS Blocco della sintesi con timidina AlexaFluor ™ 488 Azide (Click-IT ®) BMA + mAb AlexaFluor ™ 488 BDA + mAb AlexaFluor ™ 488 Cappella, Cytometry A (2008)

13. Analisi dot-plot EdU-BrdU/PI di cellule trattate con camptotecina o Paclitaxel e separate per fasi del ciclo cellulare. Paolo Elia Cappella Analisi triparametrica DNA/EdU/proteine Analisi dot-plot EdU-BrdU/ proteine di cellule trattate con camptotecina o Paclitaxel e separate per fasi del ciclo cellulare. (caspasi 3 clivata, marker di apoptosi e phospho-H3, marker di mitosi) Questo approccio rende possibile lo studio dell’espressione di proteine sensibili ad agenti denaturanti espresse nelle fasi del ciclo cellulare, non valutabili altrimenti con il metodo tradizionale basato su BrdU. Cappella, Cytometry A (2008)

14. Paolo Elia Cappella Topi Xenograft trattati con EdU o BrdU Topi xenograft portanti tumore A2780 iniettati con i.p. tramite una dose escalation di EdU da 0.5 to 50 mg/kg in comparazione a BrdU at 100mg/kg. Era analizzato il bone marrow e il tumore A2780 disgregato Cappella, Cytometry A (2008) Bone marrow Tumore A2780 (disgregato)

16. Ringraziamenti Paolo Elia Cappella Biology: J u rgen Moll Fabio Gasparri (HCA) Chemistry: Maurizio Pulici (BMA) J. Paul Robinson Premio Farmindustria 2009