1. การแยกแบคทีเ รีย แลคติก ที่ส ามารถผลิต แบคทีร ิโ อ
ซิน จากผัก ผลไม้ และธัญ พืช หมัก
ขนิษ ฐา ปัญ ญา สุม ิต รา ฤาชา
_____________________________
บทคัด ย่อ
การแยกแบคทีเรียแลคติกเพื่อคัดเลือกสายพันธุ์ที่สามารถ
ผลิตแบคทีริโอซินจากตัวอย่างผัก ผลไม้ และธัญพืชหมัก จำานวน
30 ตั ว อย่ า ง โดยใช้ อ าหาร MRS agar ที่ เ ติ ม CaCO3 1% พบ
ว่ า สามารถแยกแบคที เ รี ย แกรมบวก ไม่ ส ร้ า งสปอร์ ไม่ ส ร้ า ง
เอนไซม์คะตะเลส ทั้งหมด 21 ไอโซเลท โดยมี รู ป ร่ างกลม 12
ไอโซเลท และรูปท่อน 9 ไอโซเลท เมือนำาแบคทีเรียแลคติกทีแยก
่ ่
ได้ทงหมดไปตรวจหาแบคทีรโอซินทียบยังการเจริญของแบคทีเรีย
ั้ ิ ่ ั ้
ท ด ส อ บ 4 ช นิ ด คื อ Bacillus cereus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. ด้วยวิธี agar
well diffusion assay พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1, E2
และ I2 มีความสามารถในการผลิตแบคทีริโอซินยับยังการเจริญ ้
ของ B. cereus ได้ เมือจัดจำาแนกสายพันธุแบคทีเรียแล
่ ์
คติก ที่ผ ลิต แบคทีริโ อซิน โดยชุด ทดสอบสำา เร็ จ รู ป API 50 CHL
(BioMerieux) พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1 และ E2 คือ
Lactobacillus acidophilus แ ล ะ ไ อ โ ซ เ ล ท I2 คื อ
Pediococcus sp.
การศึ ก ษาคุ ณ สมบั ติ เ บื้ อ งต้ น ของแบคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ต
จากเชื้ อ Lb. acidophilus E1 สามารถทนความร้อนได้ดทสดที่ ี ี่ ุ
อุณหภูมิ 63 และ 80 องศาเซลเซียส มีความคงตัวในช่วง pH 5-7
ใ น ข ณ ะ ที่ แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น จ า ก Lb. acidophilus E2 แ ล ะ
Pediococcus sp.ไอโซเลท I2 สู ญ เสี ย ความสามารถในการ
ยับยัง B. cereus เมือผ่านความร้อนและการเปลี่ยนแปลงค่า pH
้ ่
นิย ามศัพ ท์ : แบคทีริโอซิน, แบคทีเรียแลคติก

2. Isolation of lactic acid bacteria with
produced bacteriocin from fermented
of vegetable, fruit and cereal products
Khanitha Panya, Sumitra Ruecha
________________________
Abstract
Isolation of lactic acid bacteria (LAB) with
produced bacteriocin from 30 fermented
vegable,fruit and cereal product samples by using
MRS agar with 1% CaCO3. The results showed that,
21 LAB isolates were gram positive, nonsporing,
catalase negative, 12 isolates were cocci shaped and
9 isolates were rod shaped. Furthermore, agar well
diffusion assay was used to detect the bacteriocin
activity by using indicator strains, Bacillus cereus,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus and
Salmonella sp. LAB isolate E1, E2 and I2 could inhibit
B. cereus. The results from identification using a
commercial test kit API 50 CHL system (Biomerieux),
isolate E1 and E2 were Lactobacillus acidophilus and
I2 was Pediococcus sp.
The primary characterization of bacteriocin
activity from Lb. acidophilus E1 showed that its
activity was not affected when treated at 63 and 80
๐
C and was stable at pH 5-7. Wherease Lb.
acidophilus E2 and Pediococcus sp. I2 were lost

3. bacteriocin activity when heat treated and pH
changed.
Keyword: Bacteriocin, Lactic acid bacteria
บทนำา
แบคทีริโอซิน (Bacteriocin) เป็ นสารยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ
จุลินทรีย์ที่มีโครงสร้างเป็นโปรตีน ที่สามารถซึมผ่านเยื่อของเซลล์
จุลินทรีย์เป้าหมายได้ ทำา ให้เกิดรูรั่วของเยื่อเซลล์และเกิดการรั่ว
ไหลขององค์ ป ระกอบเซลล์ ติ ด ตามมา (สาโรจน์ , 2543) กลไก
การทำางานของแบคทีริโอซินเกิดจากการที่แบคทีริโอซินเข้าจับกับ
เซลล์เป้าหมายทำา ให้เยื่อหุ้มเซลล์ถูกรบกวน ทำา ให้เกิดรูหรือช่อง
ว่างที่มีลักษณะคล้ายชิ้นไม้ที่นำามาประกอบกันเป็นถังมีรูตรงกลาง
ส่งผลให้เกิดการรั่วขององค์ประกอบภายในเซลล์เป็นกรดอะมิโน
สารประกอบอนินทรีย์ในกลุ่มฟอสเฟตซึ่งเป็นสารให้พลังงานของ
เซลล์และไอออนของสารที่จำาเป็นต่อการดำารงชีวิตของเซลล์ ใน
กรณีสปอร์พบว่าเยื่อหุ้มเซลล์จะถูกทำาลายอย่างรวดเร็วในระหว่าง
ที่ ส ปอร์ ง อกขึ้ น มา และแบคที ริ โ อซิ น ที่ ค วามเข้ ม ข้ น สู ง สามารถ
ยับยั้งการสร้างเพปติโดกลัยแคน (peptidoglycan) ซึ่งเป็นส่วน
ป ร ะ ก อ บ ที่ สำา คั ญ ข อ ง ผ นั ง เ ซ ล ล์ ข อ ง Bacillus
sterothermophillus แล ะ Escherichia coli ได้ (สุพ รรณิ
การ์, 2548)
แบคทีริโ อซิน ที่ส ร้ า งจากแบคที เ รี ย แลคติ ก ส่ ว นใหญ่ จ ะ
ยับยังการเจริญของแบคทีเรีย
้ สายพันธุทใกล้ชดกับแบคทีเรีย
์ ี่ ิ
แลคติกชนิดที่สร้างแบคทีริโอซินนั้น อย่างไรก็ตามมีรายงานว่า
แบคทีรโอซินจากแบคทีเรียแลคติกบางชนิดสามารถยับยังแบคทีเรีย
ิ ้
แกรมบวกที่ทำา ให้เกิด โรคอาหารเป็น พิ ษ ได้ เ ช่ น Bacillus cereus,

4. Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes แ ล ะ
Staphylococcus aureus ดั ง นั้ น จึ ง ทำา ให้ มี ผู้ ส นใจศึ ก ษาเกี่ ย วกั บ
แบคที เ รี ย แลคติ ก ที่ ผ ลิ ต แบคที ริ โ อซิ น ได้ จ ากผลิ ต ภั ณ ฑ์ อ าหาร
ชนิดต่างๆกันอย่างกว้างขวาง เพื่อหาแนวทางในการนำามาใช้เป็น
ส า ร กั น เ สี ย ต า ม ธ ร ร ม ช า ติ (ส ม ใ จ แ ล ะ ค ณ ะ , 2550)
การค้นพบแบคทีริโอซินจากแบคทีเรียแลคติก มีรายงานครั้ง
แรกตั้งแต่ปี ค.ศ. 1928 โดยRogers พบว่า Lb. lactis สามารถ
สร้ า งสารยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ Lb. bulgaricus ได้ ต่ อ มาในปี
ค.ศ. 1947 Mattick และ Hirsch ได้ ศึ ก ษาพบว่ า สารที่ ยั บ ยั้ ง
การเจริญ ของ Lb. bulgaricus ได้ นี้ มี โครงสร้ า งทาง
เคมีเป็นเปปไทด์และตั้งชื่อว่าไนซิน หลังจากนั้นมีการศึกษาพบว่า
ไนซิ นนอกจากจะยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ lactobacilli ได้ แ ล้ ว ยั ง
สามารถยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของจุ ลิ น ทรี ย์ อื่ น ได้ อี ก หลายชนิ ด คื อ
streptococci, staphylococci, Bacillus sp. แ ล ะ
Clostridium และมีรายงานว่าแบคทีเรีย แลคติกสายพันธุ์ที่
ส ร้ า ง ไ น ซิ น ไ ด้ ส า ม า ร ถ ยั บ ยั้ ง ก า ร ง อ ก ข อ ง ส ป อ ร์ ข อ ง Cl.
botulinum และยั บ ยั้ ง การเจริ ญ ของ L. monocytogenes ใน
ระหว่างการผลิต Camembert cheese ได้ ปัจจุบันไนซินได้รับ
การยอมรับในสหรัฐอเมริกาว่าปลอดภัย (GRAS) และมีการนำา ไป
ใช้เป็นสารเสริมเพื่อช่วยยับยั้ งการเจริญ ของจุ ลินทรี ย์ก่อ โรคใน
ผลิ ต ภั ณ ฑ์ อ าหารหลายชนิ ด ทั่ ว โลก (สมใจ และคณะ, 2550)
การศึกษาเกี่ยวกับการผลิตแบคทีริโอซินจากแบคทีเรียแล
คติกที่แยกได้จากผลิตภัณฑ์อาหารชนิดต่างๆ กันอย่างกว้างขวาง
แ ล ะ มี ร า ย ง า น ว่ า แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก ห ล า ย ช นิ ด ใ น จี นั ส
Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus,
Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Weissella และ Vagococcus สามารถ
ส ร้ า ง แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น ไ ด้
ประเทศไทยมีผลิตภัณฑ์พืชหมักพื้นบ้านหลายชนิดที่ผลิต
เช่ น กะหลำ่า ปลี ด อง มะม่ ว งดอง ผั ก กาดดอง ขนมจี น หมั ก
เป็ น ต้ น ซึ่ ง ส่ ว นใหญ่ มี ก ารผลิ ต ในระดั บ ครั ว เรื อ นโดยอาศั ย
กิ จ กรรมของแบคที เ รี ย แลคติ ก ที่ ป นเปื้ อ นมาในวั ต ถุ ดิ บ ตาม
ธรรมชาติ ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะคัดแยกแบคทีเรียแลคติก

5. ที่ มี ค วามสามารถผลิ ต แบคที ริ โ อซิ น จากผลิ ต ภั ณ ฑ์ พื ช หมั ก และ
ศึกษาคุณสมบัติบางประการของเชื้อที่แยกได้ เพื่อเป็นแนวทาง
ใ น ก า ร นำา ส า ย พั น ธุ์ ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก ที่ ส า ม า ร ถ ส ร้ า ง
แบคทีริโอซินไปพัฒนากระบวนการหมักที่เหมาะสมของผลิตภัณฑ์
พื ช ห มั ก ท้ อ ง ถิ่ น ต่ อ ไ ป
อุ ป ก ร ณ์ แ ล ะ วิ ธี ก า ร ท ด ล อ ง
ตัว อย่า งอาหารหมัก
เก็บตัวอย่างอาหารหมักจากผัก ผลไม้ และธัญพืช ได้แก่
ได้แก่ หน่อไม้ดอง กระเทียมดอง หัวไชโป๊ มะนาวดอง ผักกาด
ดอง กุ่มดอง มะดันดอง องุ่นดอง ขนมจีนหมัก ข้าวหมาก ลูกแป้ง
สาโท เต้าเจี้ยว เต้าหู้ยี้ นำ้าหมักลูกยอ มะยมดอง และมะม่วงดอง
จากร้านค้าในตลาดจังหวัดลพบุรี สิงห์บุรีและสระบุรีจำานวน 30
ตัวอย่าง
จุ ลิ น ท รี ย์ ที่ ใ ช้ เ ป็ น เ ชื้ อ ท ด ส อ บ
Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus และ Salmonella sp.
ก า ร แ ย ก แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก
ชั่ ง ตั ว อย่ า งอาหาร 10 กรั ม ใส่ ล งในอาหาร MRS broth
ปริ ม าตร 90 มิ ล ลิ ลิ ต ร นำา ไปบ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37 องศาเซลเซี ย ส
เป็นเวลา 48 ชั่วโมง นำามาเจือจางด้วย โซเดียมคลอไรด์ 0.85
เปอร์เซ็นต์ ให้ได้ระดับการเจือจางที่เหมาะสม จากนั้นปิเปตมา 1
มิ ล ลิ ลิ ต ร ลงในจานเพาะเชื้ อ แล้ ว เทอาหาร MRS agar ที่ เ ติ ม
CaCO3 1 % เททั บ ด้ ว ยอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37
องศาเซลเซี ย ส เป็ น เวลา 48 ชั่ ว โมง ในสภาวะไร้ อ อกซิ เ จน
ก า ร แ ย ก เ ชื้ อ บ ริ สุ ท ธิ์
แยกแบคทีเรียแลคติกซึ่งมีบริเวณใสรอบโคโลนี โดยทำาการ
ขีดเชื้อ (cross streak) บนอาหารแข็ง MRS agar ที่
เติ ม CaCO3 1 % บ่มทีอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48
่

6. ชัวโมง
่ ในสภาวะไร้ออกซิเจน ทำา การเพาะเลี้ ย ง 2 ครั้ ง และ
ตรวจสอบเชื้อ บริ สุท ธิ์ด้ ว ยการส่ อ ง กล้ อ งจุ ล ทรรศน์
เก็บรักษาเชื้อโดยการเขี่ยเชื้อบริสุทธิ์โคโลนีเดี่ยวมาแทงใน
หลอดอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37 องศาเซลเซี ย ส ใน
สภาวะไร้ออกซิเจน เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บที่อุณหภูมิ 4 องศา
เซลเซียส และทำาการต่อเชื้อทุก 1 เดือน
การศึก ษาอนุก รมวิธ านของแบคทีเ รีย แลคติก ที่แ ยกได้
เลี้ย งเชื้อ บริ สุ ท ธิ์บ นอาหาร MRS agar บ่ ม ที่ อุ ณ หภู มิ 37
องศาเซลเซี ย ส เป็ น เวลา 24 ชั่ ว โมง แล้ ว นำา มาทดสอบ ดั ง นี้
1.ก า ร ติ ด สี แ ก ร ม รู ป ร่ า ง แ ล ะ ก า ร จั ด เ รี ย ง ตั ว
2.ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง เ อ น ไ ซ ม์ ค ะ ต ะ เ ล ส
3.ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง ก๊ า ซ
4.การทดสอบการเจริ ญ ที่ อุ ณ หภู มิ 10 และ 45 องศา
เ ซ ล เ ซี ย ส
5.การทดสอบการทนเกลื อ ที่ ร ะดั บ โซเดี ย มคลอไรด์ 6.5
แ ล ะ 18 เ ป อ ร์ เ ซ็ น ต์
6.การทดสอบความสามารถในการเจริ ญ ที่ pH 4.5 และ
9.6
7.ก า ร ศึ ก ษ า คุ ณ ส ม บั ติ ก า ร ห มั ก ย่ อ ย ค า ร์ โ บ ไ ฮ เ ด ร ต
ก า ร ท ด ส อ บ โ ด ย วิ ธี agar well diffusion assay
ก า ร เ ต รี ย ม เ ชื้ อ ท ด ส อ บ
นำาแบคทีเรียก่อโรคในระบบทางเดินอาหารมาทดสอบ 4
ช นิ ด ไ ด้ แ ก่ Bacillus cereus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus และ Salmonella sp. มาทำา การ
เพาะเลี้ยงบนอาหาร TSA (ภาคผนวก ก) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา
เซลเซี ย ส เป็น เวลา 24-48 ชั่ ว โมง เขี่ ย เชื้ อ ลงในโซเดี ย มคลอ
ไรด์ 0.85 เปอร์เซ็นต์ ปรับความขุ่นของเชื้อให้มีความขุ่นเท่ากับ
ความขุ่นของสารละลายมาตรฐาน Mc Farland No.0.5 จากนั้น
ใช้ไม้พันปลายสำา ลีจุ่มนำ้า เลี้ยงเชื้อ ทำา ให้หมาด โดยการกดที่ผิว

7. ข้ า งในหลอดทดลองเกลี่ ย ให้ ทั่ ว บนผิ ว หน้ า อาหาร TSA ทิ้ ง ไว้
ป ร ะ ม า ณ 10 น า ที
ก า ร เ ต รี ย ม ส า ร ท ด ส อ บ
ถ่ายเชือแบคทีเรียแลคติกลงในอาหาร MRS broth
้
ปริม าตร 10 มิล ลิลิต ร ในหลอดทดลอง บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 48 ชัวโมง ปรับ pH ด้วยสารละลายโซเดียมไฮ
่
ดรอกไซด์ 1 นอร์มัล ทีปราศจากเชือ ให้ได้ค่า pH ให้เป็นกลาง
่ ้
จากนั้น นำา ไปปั่น แยกเซลล์ ด้ ว ยเครื่อ งปั่น เหวี่ย งที่ค วามเร็ ว รอบ
6000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ทีอณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
่ ุ
กรองให้ปราศจากเชือโดยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมตร จะได้
้
เ ป็ น crude filtrate supernatant fluid (CFSF)
ก า ร ท ด ส อ บ ส า ร ยั บ ยั้ ง แ บ ค ที เ รี ย ท ด ส อ บ
นำา CFSF ปริม าตร 50 ไมโครลิ ต ร ใส่ ล งในจานเพาะเชื้ อ
อาหารแข็ง TSA ที่ swab แบคที เรี ย ทดสอบซึ่ งเจาะหลุ ม ไว้ แล้ ว
บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สังเกตการ
เ กิ ด บ ริ เ ว ณ ใ ส ร อ บ ๆ ห ลุ ม
การทด สอ บคุณ สมบัต ิเ บื้อ งต้น ขอ งแบคทีร ิโ อ ซิน ที่ผ ลิต ได้
ถ่ า ยเชื้ อ แบคที เ รี ย แลคติ ก ลงในอาหาร MRS broth
ปริมาตร 10 มิลลิลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา
48 ชั่ว โมง ปรับ pH ให้ เป็ น กลาง จากนั้ น นำา ไปปั่ น แยกเซลล์ ที่
ความเร็วรอบ 6,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ
4 องศาเซลเซียส กรองด้วยกระดาษกรอง 0.45 ไมโครเมตร จาก
นั้ น นำา ไ ป ท ด ส อ บ ดั ง นี้
ก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม ส า ม า ร ถ ใ น ก า ร ท น ค ว า ม ร้ อ น ข อ ง
แ บ ค ที ริ โ อ ซิ น
นำา CFSF ไปให้ความร้อนทีอณหภูมิ 63, 80 และ 100
่ ุ
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10, 20 และ 30 นาที จากนั้นทดสอบ
โดยวิธี agar well diffusion assay เปรียบเทียบกับ CFSF ทีไม่ ่
ไ ด้ ผ่ า น ค ว า ม ร้ อ น
การทดสอบความคงตัว ของแบคทีร ิโ อซิน ที่ pH ต่า งๆ

8. นำา CFSF มาปรับ pH ทีระดับ 3, 5, 7 และ 9 โดยใช้
่
1 โมลาร์ ไฮโดรคลอลิก หรือ 1 นอร์มล โซเดียมไฮดรอกไซด์ บ่มที่
ั
อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 4 ชัวโมง จากนันนำามาปรับ
่ ้
pH ใ ห้ เ ป็ น ก ล า ง แ ล้ ว จึ ง นำา ไ ป ท ด ส อ บ โ ด ย วิ ธี agar well
diffusion assay
ผ ล ก า ร ท ด ล อ ง
จากการแยกแบคที เ รี ย จากตั ว อย่ า งอาหารพื ช หมั ก 30
ตัวอย่าง โดยใช้อาหาร MRS agar ที่เติม CaCO3 1% พบว่าได้
แบคทีเรียแกรมบวก จำา นวน 21 ไอโซเลท แบ่งออกเป็น รูปร่าง
กลม 12 ไอโซเลท รูปร่างท่อนสั้น 3 ไอโซเลท และรูปร่างท่อน 6
ไอโซเลท คุ ณ สมบั ติ สำา คั ญ ของแบคที เ รี ย กลุ่ ม นี้ มี ค่ า pH ของ
อาหารอยู่ในช่วง 3.23-4.83 จากนั้นนำา แบคทีเรี ยที่ แยกได้ ม า
ทดสอบคุณ สมบั ติ ท างเคมี ได้ แ ก่ เอนไซม์ ค ะตะเลส การสร้ า ง
ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ การเจริญที่อุณหภูมิ 10 และ 45 องศา
เซลเซียส การเจริญในอาหารที่มีโซเดียมคลอไรด์ 6.5 และ 18
เปอร์เซ็นต์ และการเจริญที่ pH 4.5 และ 9.6 พบว่า แบคทีเรีย
แลคติกทั้ง 21 ไอโซเลท ให้ปฏิกิริยาคะตะเลสเป็นลบ ไม่สร้าง
ก๊ า ซคาร์ บ อนไดออกไซด์ จ ากการหมั ก กลู โ คสจึ ง จั ด อยู่ ใ นกลุ่ ม
homofermentative ซึ่ ง แบคที เ รี ย กลุ่ ม นี้ เ มื่ อ เกิ ด กระบวนการ
หมั ก ผลผลิ ต ที่ ไ ด้ คื อ กรดแลคติ ก เป็ น ผลิ ต ภั ณ ฑ์ ส่ ว นใหญ่
สามารถเจริ ญ ได้ ที่ ช่ ว งอุ ณ หภู มิ สู ง แต่ ไ ม่ เ จริ ญ ช่ ว งอุ ณ หภู มิ ตำ่า
เจริญเติบโตในอาหารเหลวที่เติมเกลือโซเดียมคลอไรด์ 6.5 แต่
ไม่เจริญที่ 18 เปอร์เซ็นต์ และเจริญเติบโตในอาหารเหลวที่มีค่า
pH 4.5 แ ต่ ไ ม่ เ จ ริ ญ ที่ pH 9.6
ก า ร ท ด ส อ บ ก า ร ส ร้ า ง แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น โ ด ย วิ ธ ี agar well
diffusion assay
จากการศึกษาความสามารถการยั บยั้ งแบคที เรี ย ทดสอบ 4
ชนิด โดยวิธี agar well diffusion assay พบว่าแบคทีเรียแล
คติ ก 3 ไอโซเลท คื อ E1, E2 และ I2 สามารถยั บ ยั้ ง การเจริ ญ

9. ของ B. cereus ได้มากที่ สุ ด โดยทำา ให้ เกิ ดบริเวณใสมี เส้ นผ่ า น
ศูนย์กลาง 15, 11 และ 11 มิลลิเมตรตามลำา ดับ ซึ่งเปรียบเทียบ
กับชุดควบคุม คือ อาหาร MRS broth ที่ไม่มีการยับยั้งแบคทีเรีย
ท ด ส อ บ ส่ ว น แ บ ค ที เ รี ย ท ด ส อ บ E. coli, S. aureus แ ล ะ
Salmonella sp. แบคทีเรียแลคติกที่แยกได้ไม่สามารถยับยั้งการ
เจริ ญ ได้ ซึ่ ง การทดสอบวิ ธี นี้ เ ป็ น การนำา สารทดสอบที่ ผ ลิ ต จาก
แบคทีเรียแลคติกที่อยู่ในอาหาร MRS broth และทำาการปรับ pH
ของสารทดสอบให้เป็นกลาง จึงมีแนวโน้ม ว่ าเป็ นแบคที ริ โอซิ น
การทดสอ บความสามารถในการท นความร้อ นขอ งแบคที
ริ โ อ ซิ น
เมื่อ นำา แบคทีริโอซินที่ผ ลิต จากไอโซเลท E1 มาผ่านความ
ร้อนทีอณหภูมิ 63 และ 80 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10, 20 และ
่ ุ
30 นาที พบว่า กิจกรรมของการยับยังไม่เปลียนแปลง
้ ่ ดังแสดง
ในภาพที่ 5 แสดงถึง ความสามารถในการสร้ า งแบคทีริ โ อซิ น ที่
สามารถทนความร้อนได้ในระดับ นี้ ในขณะที่ให้ความร้อ น 100
องศาเซลเซี ย ส พบว่ า กิ จ กรรมการยั บ ยั้ ง B. cereus ลดลง
แบคทีริโอซินที่ผ ลิ ต จากไอโซเลท I2 เมื่อ ผ่ านความร้ อ นที่
อุณหภูมิ 63 องศาเซลเซียส กิจกรรมการยับยั้งลดลง เมื่อเปรียบ
เที ย บกับที่ ไม่ ผ่า นความร้ อ นและจะสู ญ เสี ย ความสามารถในการ
ยับยั้งเมื่อผ่านความร้อนที่อุณหภูมิ 80 และ 100 องศาเซลเซียส
ในขณะที่ แ บคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ต จาก ไอโซเลท E2 สู ญ เสี ย ความ
สามารถในการยั บ ยั้ ง เมื่ อ ผ่ า นความร้ อ นที่ อุ ณ หภู มิ 63 องศา
เ ซ ล เ ซี ย ส ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 1
ตารางที่ 1 ผลการทดสอบความสามารถทนความร้อนของแบคที
ริ โ อ ซิ น ที่ ผ ลิ ต จ า ก แ บ ค ที เ รี ย
แ ล ค ติ ก จ า ก ไ อ โ ซ เ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2

10. อุณ หภูม ิ/เวลา บริเ วณใสของการยับ ยัง แบคทีเ รีย
้
ทดสอบ (มิล ลิเ มตร)
E1 E2 I2
ไม่ผ่านความร้อน 16 8 8
63 °C 10 นาที 16 - 8
63 °C 20 นาที 16 - 8
63 °C 30 นาที 16 - 8
80 °C 10 นาที 16 - -
80 °C 20 นาที 16 - -
80 °C 30 นาที 16 - -
100 °C 10 นาที 11 - -
100 °C 20 นาที 11 - -
100 °C 30 นาที 10 - -
หมายเหตุ - หมายถึง ไ ม่ มี บ ริ เ ว ณ ใ ส
ก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม ค ง ตั ว ข อ ง แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น ที่ pH ต่ า ง ๆ
จากการทดสอบแบคทีรโอซินทีผลิตจากไอโซเลท E1 มีความ
ิ ่
สามารถในการยับ ยั้ง B. cereus ที่ pH 5 และ 7 โดยไม่มีก าร
เปลียนแปลงเมือเปรียบเทียบกับชุดควบคุมทีไม่ผานการปรับค่า pH
่ ่ ่ ่
ในขณะทีการยับยังไม่เกิดขึนที่ pH 3 และ pH 9 แสดงว่าแบคทีรโอ
่ ้ ้ ิ
ซินทีผลิตจากไอโซเลท E1 มีความคงตัวดีที่ pH 5 และ 7 แบคทีริ
่
โอซินทีผลิตจากไอโซเลท E2 มีความสามารถในการยับยังที่ pH 9
่ ้
โดยมีบริเวณยับยังมากกว่าชุดควบคุมทีไม่ผานการปรับค่า pH และ
้ ่ ่
แบคทีรโอซินทีผลิตจากไอโซเลท I2 มีความสามารถยับยังได้ดใน
ิ ่ ้ ี
ช่ ว ง pH ที่ เ ป็ น ก ร ด ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 2

11. ตารางที่ 2 ผลการทดสอบความคงตั ว ของแบคที ริ โ อซิ น ที่
pH ต่างๆ ของแบคทีเรียแลคติก ไอโซเลท E1, E2
แ ล ะ I2
ระดับ pH บริเ วณใสของการยับ ยั้ง แบคทีเ รีย ทดสอบ
(มิล ลิเ มตร)
E1 E2 I2
ไม่ปรับ pH 15 8 10
pH 3 - - 8
pH 5 15 7 10
pH 7 15 - -
pH 9 - 15 -
หมายเหตุ - หมายถึง ไ ม่ มี บ ริ เ ว ณ ใ ส
การจัด จำา แนกชนิด แบคทีเ รีย แลคติก ทีส ามารถผลิต แบคทีร ิ
่
โ อ ซิ น
จากการจัดจำาแนกชนิด แบคทีเรียแลคติกไอโซเลท E1 และ
E2 มีความสามารถในการหมักย่อยคาร์โบไฮเดรตได้ใกล้เคียงกัน
คื อ สามารถหมั ก ย่ อ ยนำ้า ตาล glucose, fructose, salicin,
cellubiose, sucrose, trehalose และ gentiobiose ส่ ว น
แบคที เ รี ย แลคติ ก ไอโซเลท I2 สามารถหมั ก ย่ อ ย ribose,
galactose, glucose, fructose, mannose, N-Acetyl-
Glucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin,
cellubiose, maltose, sucrose, trehalose, gentiobiose
แ ล ะ d-tagalose
จากการนำาข้อมูล การผลิตกรดจากแหล่งคาร์โบไฮเดรตชนิด
ต่ า งๆ มาวิ เ คราะห์ ด้ ว ยโปรแกรม apiwebTM identification
software และพิจารณาจากรูปร่างเซลล์ พบว่า ไอโซเลท E1 และ
E2 คือ Lactobacillus acidophilus ทีระดับความถูกต้องของการ
่
จัดจำาแนก 98.5 % และ 99.5 % ตามลำาดับ และไอโซเลท I2 คือ

12. Pediococcus pentosaceus ที่ ร ะดั บ ความถู ก ต้ อ งของการจั ด
จำา แ น ก 8.3 % ดั ง แ ส ด ง ใ น ต า ร า ง ที่ 3
ต า ร า ง ที่ 3 ผลการทดสอบการหมั ก คาร์ โ บไฮเดรต 49 ชนิ ด
โดยชุดทดสอบสำาเร็จรูป API 50 CHL ของแบคทีเรียแล
ค ติ ก จ า ก ไ อ โ ซ เ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2
คาร์โ บไฮเดรต E1 E2 I2
1. Glycerol - - -
2. Erythritol - - -
3. D-Arabinose - - -
4. L-Arabinose ? ? -
5. Ribose - - +
6. D-Xylose - - -
7. L-Xylose - - -
8. Adonitol - - -
9. β-methyl-D-xyloside - - -
10. Galactose ? ? +
11. Glucose + + +
12. Fructose + + +
13. Mannose + + +
14. Sorbose - - -
15. Rhamnose - - -
16. Dulcitol - - -
17. Inositol - - -
18. Mannitol ? ? -
19. Sorbitol - ? -
20. α-Methyl-D- - - -
Mannoside
ต า ร า ง ที่ 3 (ต่ อ )
คาร์โ บไฮเดรต E1 E2 I2
21. α-Methyl-D- - - -
Glucoside
22. N-Acetyl- ? ? +
Glucosamine
23. Amygdalin + + +
24. Arbutin - - +

13. 25. Esculin + + +
26. Salicin + + +
27. Cellubiose + + +
28. Maltose - - +
29. Lactose ? - -
30. Melibiose - - -
31. Sucrose + + +
32. Trehalose + + +
33. Inulin - - -
34. Melezitose - - -
35. Raffinose ? + -
36. Starch - - -
37. Glycogen - - -
38. Xylitol - - -
39. Gentiobiose + + +
40. D-Turanose - - -
41. D-Lyxose - - -
42. D-Tagalose - - +
43. D-Fucose - - -
44. L-Fucose - - -
45. D-Arabitol - - -
46. L-Arabitol - - -
47. Gluconate - - -
48. 2-keto-gluconate - - -
49. 5-keto-gluconate - - -
หมายเหตุ + ใช้เป็นแหล่งคาร์บอนได้ - ใช้เป็นแหล่งคาร์บอน
ไ ม่ ไ ด้ ? ผ ล ก า ร ท ด ส อ บ ไ ม่ ชั ด เ จ น
ส รุ ป แ ล ะ วิ จ า ร ณ์ ผ ล ก า ร ท ด ล อ ง
การแยกแบคที เ รี ย แลคติ ก จากผั ก ผลไม้ และธั ญ พื ช หมั ก
และนำามาทดสอบความสามารถในการผลิตแบคทีริโอซินในเบื้อง
ต้ น โดยวิ ธี ก ารแยกเชื้ อ ในอาหาร MRS agar ที่ เ ติ ม CaCO3
1%พบว่ า จากตั ว อย่ า งผั ก ผลไม้ และธั ญ พื ช หมั ก จำา นวน 30
ตัวอย่าง สามารถแยกแบคทีเรียแลคติกได้จำา นวน 21 ไอโซเลท
โดยทั้งหมดเป็นแบคทีเรียแกรมบวก รูปร่างกลม12 ไอโซเลท และ
รูปร่างท่อน 9 ไอโซเลท ไม่สร้างสปอร์ ไม่สร้างเอนไซม์คะตะเลส
ไม่สร้างก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์จากการหมักกลูโคสจึงจัดอยู่ใน
ก ลุ่ ม homofermentative ส า ม า ร ถ เ จ ริ ญ ไ ด้ ที่ อุ ณ ห ภู มิ 45
องศาเซลเซีย ส เจริญ ได้ ในที่ มี เกลื อ 6.5% สามารถผลิ ต กรดใน
อาหารเหลวได้ เมื่อนำาแบคทีเรียแลคติกไปทดสอบความสามารถ

14. ในการยั บ ยั้ ง แบคที เ รี ย ทดสอบ 4 ชนิ ด ได้ แ ก่ B. cereus, E.
coli, S. aureus แ ล ะ Salmonella sp. โ ด ย วิ ธี Agar well
diffusion assay พบว่ า มี 3 ไอโซเลท คื อ E1, E2 และ I2 ที่
สามารถยับยั้ง B. cereus ได้โดยบริ เวณใสมี เส้ นผ่านศูนย์กลาง
15, 11 และ 11 มิลลิเมตร ตามลำาดับ ซึ่งแบคทีเรียแลคติก 3 ไอ
โซเลทแยกได้จากนำ้าหมักลูกยอและเต้าหู้ยี้ เมือทำาการจัดจำาแนก
่
แบคทีเรียแลคติกทีสามารถผลิตแบคทีรโอซินในระดับสปีชสโดยใช้
่ ิ ี ์
ชุดทดสอบสำา เร็จ รูป API 50 CHL พบว่าแบคทีเรียแลคติกไอโซ
เ ล ท E1, E2 แ ล ะ I2 คื อ Lactobacillus acidophilus แ ล ะ
Pediococcus sp. จากการศึกษาคุณสมบัตเบืองต้นของแบคทีรโอ
ิ ้ ิ
ซิ น ได้ ผ ล ดั ง นี้ แบคที ริ โ อซิ น ที่ ผ ลิ ต จากเชื้ อ Lactobacillus
acidophilus E1 สามารถทนความร้ อ นที่อุ ณ หภู มิ 63 และ 80
องศาเซลเซียสได้ มีความ คงตัวดีในช่วง pH 5-7 ส่วนแบคทีรโอ ิ
ซินที่ผ ลิต จากเชื้อ Lactobacillus acidophilus E2 ไม่ส ามารถ
ทนความร้นได้ มีความคงตัวในช่วง pH 9 และแบคทีรโอซินทีผลิต ิ ่
จากเชือ Pediococcus sp. I2 สามารถทนความร้อนทีอณหภูมิ
้ ่ ุ
63 อ ง ศ า เ ซ ล เ ซี ย ส มี ค ว า ม ค ง ตั ว ดี ใ น ช่ ว ง pH 3-5
จากงานวิ จั ย นี้ จ ะเห็ น ได้ ว่ า Lb. acidophilus E1, Lb.
acidophilus E2 และ Pediococcus sp.I2 สามารถยั บ ยั้ ง การ
เจริญ ของแบคทีเรีย ก่อ โรคอาหารเป็ นพิ ษ ได้ คื อ B. cereus ดัง
นั้นจึงอาจนำาไปใช้เป็นกล้าเชื้อในการผลิตอาหารหมักที่ปลอดภัย
และได้ ม าตรฐาน หรื อ นำา ไปใช้ ใ นการผลิ ต สารยั บ ยั้ ง เชื้ อ โรค
อ า ห า ร เ ป็ น พิ ษ ใ น อ า ห า ร ไ ด้
เ อ ก ส า ร อ้ า ง อิ ง
1. จ า รุ ว ร ร ณ ม ณี ศ รี . 2551. เ ท ค โ น โ ล ยี อ า ห า ร ห มั ก .
ก รุ ง เ ท พ ฯ : สำา นั ก พิ ม พ์ โ ฟ ร เ พ ซ

15. 2. ชิดชม ฮิรางะ มาลัย บุญรัตนกรกิจ มณฑาทิพย์ ยุ่นฉลาด
และ กรุณ า วงษ์กระจ่ า ง. 2550. การเปลี่ ย นแปลงชนิ ด และ
ปริ ม าณจุ ลิ น ทรี ย์ ร ะหว่ า งการหมั ก ยอ ในกระบวนการผลิ ต
เครื่ อ งดื่ ม นำ้า ลู ก ยอไทย. ว . ว ช . (วิ ท ย์ ). 39 (1): 95-104.
3. ชุตินันท์ รัตนไพบูลย์สวัสดิ์ . 2547. กา ร ศึก ษ า คุณ ลัก ษ ณ ะ
ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก ที่ ผ ลิ ต ส า ร ยั บ ยั้ ง ก า ร เ จ ริ ญ
ข อ ง Staphylococcus aureus. วิทยานิ พนธ์วิ ทยาศาสตร
มหาบั ณ ฑิ ต ,สาขาเทคโนโลยี ชี ว ภาพ ภาควิ ช าเทคโนโลยี
ชี ว ภ า พ ม ห า วิ ท ย า ลั ย เ ก ษ ต ร ศ า ส ต ร์ .
4. ณัฐพร ภัทรสินไพบูลย์ อรอนงค์ พริ้งศุลกะ อัจฉริยา รังษิรุจิ
และ ณัฏฐิกา สุวรรณาศรัย. 2552. การแย กแลบเฟจจาก
ตั ว อ ย่ า ง แ ห น ม ใ น ป ร ะ เ ท ศ ไ ท ย ว า ร ส า ร วิ ท ย า ศ า ส ต ร์
ม ศ ว . 25(1): 101-113.
5. ดวงพร คั น ธโชติ . 2537. อ นุ ก ร ม วิ ธ า น ข อ ง แ บ ค ที เ รี ย
และ ปฏิบ ัต ิก า ร . กรุงเทพฯ: สำา นักพิมพ์ โอเดียนสโตร์
6. นิ ด า อาบสุว รรณ์ . 2550. ก า ร ผ ลิ ต แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น จ า ก แ ล
ค ติก แ อ ซิด แ บ ค ทีเ รี ย ที่ท น อุณ ห ภูม ิส ู ง . วิทยานิพนธ์วิทยา
ศาสตรมหาบัณฑิต ,สาขาเทคโนโลยีชีวภาพ บัณฑิตวิทยาลัย
ม ห า วิ ท ย า ลั ย ข อ น แ ก่ น .
7. ปิ่ น ม ณี ข วั ญ เ มื อ ง . 2547. แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก ใ น
ผ ลิ ต ภั ณ ฑ์ อ า ห า ร ห มั ก ด อ ง . ว า ร ส า ร ค รุ ศ า ส ต ร์
อุ ต ส า ห ก ร ร ม . 3(1): 65.
8. มาตรฐานผลิตภัณฑ์ ชุม ชนนำ้า ลู กยอ. (2553, มิถุนายน 23).
มาตรฐานผลิต ภัณ ฑ์ช ุม ชนนำ้า ลูก ยอ . [ออนไลน์] เข้าถึงได้
จ า ก : http://www.tisi.go.th.
9. มี ชั ย ลั ด ดี . 2552. บ ท ป ฏิ บั ติ ก า ร ที่ 2 ก า ร คั ด แ ย ก
แ บ ค ที เ รี ย ก ร ด แ ล ค ติ ก . [อ อ น ไ ล น์ ]. เ ข้ า ถึ ง ไ ด้ จ า ก :
http://www.agro.kmutnb.ac.th. (วั น ที่ ค้ น ข้ อ มู ล :10
ธันวาคม 2553)

16. 10. วรายุทธ สุระนรากุล สัมภาษณ์ คุณสุข ปาริชาติ พุ่มขจร
พงศ์ศักดิ์ รัตนชัยกุลโสภณ. 2550. คุณสมบัติของแบคทีริโอซิ
นที่ ส ร้ า งโดยแลคติ ก แอซิ ด แบคที เ รี ย ที่ แ ยกได้ จ ากอาหาร
หมั ก .ว า ร ส า ร วิ จ ั ย ม ห า วิ ท ย า ลั ย ข อ น แ ก่ น 7(1): 17-26.
11. วิเชียร ลีลาวัชรมาศ. 2534. อาหารจากแล คติค แอ ซิด
แบคทีเ รีย ในอุต สาหกรรมไทย . โปรซีดดิ้งส์ แลคติคแอซิด
แ บ ค ที เ รี ย ใ น อุ ต ส า ห ก ร ร ม ไ ท ย ค รั้ ง ที่ 1.ม ห า วิ ท ย า ลั ย
เ ก ษ ต ร ศ า ส ต ร์ ก รุ ง เ ท พ ม ห า น ค ร .
12. สมใจ ศิริโภค ประวัติ อังประภาพรชัย ขจีนาฏ โพธิเวชกุล
และอรอนงค์ พริ้ ง ศุ ล กะ. 2550. การคั ด เลื อ กและการจั ด
จำา แนกชนิ ด แบคที ริ โ อซิ น ได้ จ ากอาหารหมั ก และการศึ ก ษา
คุณสมบัติเบื้องต้นของแบคทีริโอซินที่ผลิตได้ . บทคว าม วิจ ัย
วา ร ส า ร วิท ย าศ า ส ต ร์ ปีท ี่ 23 (ฉบับ ที่ 2 ) มห า วิท ย า ลัย
ศ รี น ค ริ น ท ร วิ โ ร ฒ .
13. สาโรจน์ ศิ ริ ศั น สนี ย กุ ล . 2543. แ บ ค ที ร ิ โ อ ซิ น : ส า ร
ยั บ ยั้ ง จุ ล ิ น ท รี ย ์ ใ น อ า ห า ร . ภาควิ ช าเทคโนโลยี ชี ว ภาพ
คณะอุ ต สาหกรรมเกษตร มหาวิ ท ยาลั ย เกษตรศ าส ตร์ .
14. สุพรรณิการ์ ศรีบัว ทอง. 2548. ก า ร คัด เ ลื อ ก แ บ ค ที เ รี ย
ก ร ด แ ล ค ติ ก จ า ก ข้ า ว ห มั ก เ พื่ อ ใ ช้ เ ป็ น ก ล้ า เ ชื้ อ ข น ม จี น
แ ป้ ง ห มั ก .วิ ท ยานิ พ นธ์ วิ ท ย าศ าส ตรมห าบั ณ ฑิ ต , สาข า
วิทยาศาสตร์การอาหาร ภาควิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
ก า ร อ า ห า ร .
15. สุม ณฑา วัฒนสินธุ์ . 2545. จุ ล ชี ว วิ ท ย า ท า ง อ า ห า ร .
ก รุ ง เ ท พ ฯ : โ ร ง พิ ม พ์ ม ห า วิ ท ย า ลั ย ธ ร ร ม ศ า ส ต ร์ .
16. ศรั ณ ย์ พรหมสาย. 2549. ก า ร แ ย ก แ ล ะ ก า ร คั ด ก ร อ ง
แบคทีเ รีย กรดแลคติก ที่ส ามารถผลิต แบคทีร ิ
โ อ ซิน .วิท ยานิพนธ์วิท ยาศาสตรมหาบั ณ ฑิ ต , สาขาชีว วิท ยา
ค ณ ะ วิ ท ย า ศ า ส ต ร์ ม ห า วิ ท ย า ลั ย เ ชี ย ง ใ ห ม่ .
17. อรอนงค์ พริ้ ง ศุ ล กะ. 2550. แบคที ริ โ อซิ น ที่ ส ร้ า งจาก
แบคทีเรียแลคติก. บทความวิช าการ วารสารวิท ยาศาสตร์
ปี ท ี่ 23 (ฉ บั บ ที่ 2) ม ห า วิ ท ย า ลั ย ศ รี น ค ริ น ท ร วิ โ ร ฒ .

17. 18. อั จ ฉรา เพิ่ ม . 2549. แ บ ค ที เ รี ย แ ล ค ติ ก . กรุ ง เทพฯ:
ห จ ก . ภ า พ พิ ม พ์
19. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria :
classification and physiology. In Salminen, S. and
A. Wright. Lactic acid bacteria: microbiology and
functional espects : third edition, revised and
expanded. Marcel Dekker, Inc., New York.
20. Jones, R.J., Hussein, H.M., Zagorec, M., Brightwell,
G. and Tagg, J.R.2008. Isolation of lactic acid
bacteria with inhibitory activity against pathogens
and spoilage organisms associated with fresh meat.
Food Microbiology. 25: 228-234.
21. Tamang, J.P., Tamang, B., Schillinger, U.,
Guigas, C., Holzapfel , W.H. 2009. Funtional
properties of lactic acid bacteria isolated from
ethnic fermented vegetables of the Himalayas.
International Journal of Food Microbiology 135,
28-33.
22. Thongsanit, J., Tanikawa , M., Yano, S., Tachiki,
T., and Wakayama, M. 2009. Identification of
glutaminase-producing lactic acid bacteria isolated
from Nham, a traditional Thai fermented food and
characterisation of glutaminase activity of isolated
Weissella cibaria. Annals of Microbiology. 59 (4):
715-720.