1. Inversão de fases,determinação por HPLCdo tamoxifeno noCÃOplasma e de
seusFARMACOCINÉTICAApós a administração deuma única dose oral
Resumo:
O método analíticodesenvolvido para avaliaro tamoxifenem amostras de plasmade
cãoerapreciso, exacto, robusto e linear no intervalode5-200ng /mL.Os limites de
detecçãoe quantificação foram0,981ng /mLe 2,97ng /mL,respectivamente.Além disso,
ointra-diavariaçõesde precisãoe acurácia foram8,78 e10,16%, respectivamente. As
concentraçõesde tamoxifenoforam analisadas porcombinadoinvertidocromatografiaem
fase líquidae detecçãoUV (λ = 280nm).O estudo foi conduzidoutilizandoum
abertorandomizadocruzado2 períodos
design equilibradocom umperíodo de intervalo deuma semanaentre
asdoses.Estemétodo simples, rápidoe selectivoé adequado
parabiodisponibilidade,farmacocinética eestudos de bioequivalência.
INTRODUÇÃO
Tamoxifené umagentenão esteróideque tem demonstradopotenteantiestrogénico
propriedadesemsistemas de testesanimais.Ocitrato detamoxifenoestá disponívelna
forma de comprimidosorais, sendo amplamente utilizado comoterapia endócrinapara o
câncer demama. A biodisponibilidadedos comprimidosde citrato detamoxifenotem
sidoextensivamente estudadaem vários paísesao redor do mundo. O tamoxifenoé
extensivamente metabolizadoapós administração oraladministraçãoeN-desmetil
tamoxifenoé o principal metabolitoencontrada no plasma humano.
O uso generalizado detamoxifenotem estimuladoesforços para desenvolver os
ensaiosde rotina paraa droga eos seus metabolitosno plasma humano.
Procedimentos baseados emcromatografia gasosa comespectrometria de massa
são altamente específicose envolvemequipamento nãogeralmente disponíveis.
O métodode Lee etal.representauma evolução doFried
e Wainer, com três diferenças importantes: a incorporação deum padrão internopara o
ensaio,a utilização de umaextracção líquido-líquido e um procedimentopara purificar
adicionalmentee permitir quea concentraçãoda amostra,ea quantificação de4-hidroxi-
N-desmetiltamoxifeno, umametabolitoquepodem teratividade anti câncer.Infelizmente,
tempo de execuçãototal alcançadofoi de cerca de60 min.
As preparações farmacêuticasde citrato de tamoxifenodisponíveis
no Brasilbaseiam-se emdiferentes excipientese algunsfilmesde revestimento,
o que pode nãorefletir abiodisponibilidadedescrito paraestes
comprimidos.Voluntários humanossão normalmente utilizadosem testesde
biodisponibilidadepara a determinação dasconcentrações plasmáticasda medicação
estudada. Neste estudo,foram utilizados carrochos saudáveis comomodelo animal
emsubstituiçãoaos seres humanos, devido ao baixo custo e aosatisfatório
resultado emcomparação comvoluntários humanos. Verificou-se também
que os métodostradicionais para adeterminação daconcentração plasmática
dotamoxifenosão geralmentecaros.Assim, umametodologia analíticafoi adaptada a
partir da literaturapara a determinaçãodo tamoxifeno noplasmade cachorrosde alta

2. performanceatravésde cromatografia líquida(HPLC)acoplada aultravioleta,
detecçãocomsensibilidadee selectividadeadequadaspara realizar
o estudo de bioequivalênciaentre as duastamoxifeno(10mg)por via oral
formulações.
EXPERIMENTAL
Drogas e produtos químicos
Os orgânicos solventes grau HPLC utilizados para a extração e móveis fase de preparação
foram adquiridos da Merck (Rio de Janeiro,RJ, Brasil). Todos os outros reagentes foram de grau
analítico.
A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) Hewlett Packard sistema foi utilizado a fim de
otimizar a separação de tamoxifenoe do padrão interno de clomifeno. Este sistema foi
composto por um sistema controlado, injetado por mão com alça de 50 mL e Detector
UVVisível operado a 280 nm. A fim de otimizar a Método de análise do tamoxifeno no plasma,
uma HPLC SPC-10.
O desempenho do método foi avaliado usando as soluções padrão dos compostos.
Após a análise subsequente dos resultados do método foi otimizado utilizando amostras de
plasma, paraestudos in vivo.
Soluções padrão
A solução-mãe padrão de citrato de tamoxifeno foi preparada por dissolução de 0,0050 g do
padrão decitrato de tamoxifeno em um 50 mL de metanol. Diluições posteriores foram
realizadas a fim de se obter as concentrações finais de 4, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 ug / mL. O estoque
solução do padrão interno foi também preparado dissolvendo 0,0050 g de clomifeno, em 50
mL de metanol. Do mesmo modo, as diluições foram realizados para se obter uma
concentração final de 2ug / mL. Estoque e soluções de trabalho padrão foram protegidos da
luz e armazenados à temperatura de -20 ° C até ser usado.
A preparação das amostras
Para proceder à determinação do tamoxifeno no plasma do cachorro, as amostras de sangue
foram colhidas e colocadas em tubos contendo EDTA. Os tubos foram centrifugadas (2000 g
durante 20 min) a 27 ° C, a fim de remover os elementos do sangue. O plasma foi então
transferido para frascos de limpar e armazenadas a -70 ° C para posterior análise.
Validação do Método
Para realizar o ensaio de validação do método de plasma no cachorro os seguintes parâmetros
foram investigados: seletividade, linearidade, precisão e exatidão, robustez, limite de
quantificação, limite de detecção e recuperação.
Protocolo clínico
Este estudo foi realizado de acordo com um processo aberto, randomizado, dois períodos
desenho cruzado. A formulação teste de tamoxifenocitrato por Libra-Zita ® e a formulação de
referência do tamoxifenopor Wyeth-Whitehall foram utilizados na forma de comprimidos (10
mg).
Neste estudo, foram utilizados 14 cães (Caniumvulgaris) com a raça não definido (RND)
divididos em três grupos de animais [grupo I (n = 5),o grupo II (n = 5) e o grupo de controlo (n =

3. 4)]. O grupo I foi o grupo de referência e do II grupo foi o teste. Os cães tinham cerca de 3,4
anos (idade mínima de 2,5 anos e máxima idade de 5,5 anos), peso médio de 18,6 kg (peso
mínimo de 13 e peso máximo de 26 kg). Os critérios de inclusão adotados foram:parâmetros
clínicos e laboratoriais, como exames hematológicos e sorológicos, nem história prévia de
doença renal e doenças hepáticas nem hipersensibilidade ao tamoxifeno. O critérios de
exclusão adotados foram: qualquer doença aguda ou crônica que modificar a absorção, o
metabolismo ou a excreção da tamoxifeno; animais que tinham tomado qualquer droga por
duas semanas antes do início do estudo; presença de algumas infecções ectoparasitáriassem
influência nos testes clínicos e laboratoriais. Durante o período de repouso, foi permitido a
administração de medicamentos comunspara vermes (Ancylex ® ou Oxprux®), e nos casos de
infecções de sarna, durante o ensaio, o tratamento deverá ser realizada com Ivomec ®. Para
ter os possíveis efeitos colaterais relacionados, os cães foram avaliados diariamente pelos
pesquisadores e do médico veterinário.
Os fármacos foram administrados de acordo com um período de doisdesenho cruzado.
No primeiro período, os animais foram divididos em dois grupos de estudo. Durante cada
período, os cães foram submetidos a uma dieta com ração balanceada padrão às 17h00 antes
do dia de o estudo, quando começou a jejuar, buscando o início do estudo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As soluções de tamoxifeno e clomifeno testado com colunaWaters Nova-Pak CN 60 Å, 4 mm (6
x 75 mm) apresentou bom tempo de retenção em todas as fases móveis avaliadas, com
exceção da fase móvel constituída por ácido acético: acetato de amónio a 0,01% em metanol
(99:1), devido à separação dos isómeros de clomifeno. As fases móveis compostas por
metanol: ácido acético (99:1) + acetato de amónio (0,025; 0,018; 0,014 e 0,01%) foram
utilizadas para avaliar o comportamento cromatográfico do tamoxifenoe clomifeno no plasma.
Dentro das fases móveis testadas, a composição de 0,014% de acetato de amónio em metanol
e ácido acético apresentou o melhor tempo de retenção, bem como uma boa separação das
proteínas plasmáticas. Os tempos de retenção do tamoxifeno e os seus padrão interno foram
de 12,3 e 10,3 min.