Outils de mesure des contaminants des milieux lagunaires et marins. Delphine GUILLEBAULT (UMR LOMIC, Présidente de Microbia Environnement)

1. Des bio-puces pour la mesure des
contaminations microbiennes
Delphine Guillebault
13 novembre 2013

2. L’eau est le vecteur de nombreux microorganismes
ayant un impact sociétal et économique fort
Des dinoflagellés
Des diatomées
Des bactéries
Des efflorescences d’algues toxiques
Des contaminations bactériennes
La diversité microbienne, les
empreintes génétiques et
chimiques
La biologie moléculaire, des bases de
données, des technologies de pointes

3. ** *

5. Des enjeux environnementaux…
• Révision des standards microbiologiques CE en 2015
• Augmentation de la population mondiale, réchauffement
climatique avec (ré-) émergence de microorganismes
indésirables pour l’homme
• Les questions:
 Quelle qualité des eaux de consommation, d’élevage et
récréatives?
 Les réservoirs naturels?
 Le recyclage de l’eau?
 La réutilisation des eaux industrielles?

6. Le principe des bio-puces
Un
individu
Une
identité
Des gènes
Des
séquences

7. Le principe des bio-puces
Qui est là et combien sont-ils?
Une population
= un assemblage
d’individus
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!"
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Un assemblage
d’individuUn gène
= un assemblage
d’identité
30
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Reconnaissance des
séquences par une sonde
Aujour’hui en catalogue:
spécifique
Zig, Puce, Jules, Jim etc….
Une séquence

8. Développement et/ou adaptation de sondes
ciblant des micro-organismes d’intérêt
Choix d’un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques:
• molécule possédant des régions très conservée entre les différentes
espèces et moins conservée
• Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants
• Peu de transfert horizontal
• Très abondante
• Bases de données très riches et bien alimentées
Ensemble de séquences
uniques
Sondes hiérachiques:
 Groupe
 phylum
 Classe
 Genre
 Espèces
Contrôle interne
de présence de la
cible

9. En pratique….
L’identification d’espèces à l’aide de sondes
Échantillon
environnemental
ou issu de culture
Isolation des messagers RNA
Marquage
Fluorescent des RNA
Hybridation
sur la bio-puce
Indicateur
d’activité
Plus le signal
fluorescent est fort
plus la cible est
présente en grande
quantité

10. En pratique…
Schéma d’une expérience d’hybridation de bio-puce
ARN marqué
fluorescent
Sondes immobilisées
(Oligonucleotides,
PCR-Fragments, cDNA)
Lame dotée d‘un revêtement
spécifique

11. En pratique…
Les résultats obtenus

12. Le projet européen MicroAQUA
7th Framework Programme
Theme: Innovative aquatic biosensors
Objectifs:
Designer des sondes spécifiques ciblant des
cyanobactéries et des diatomées toxiques, des
bactéries, virus et protozoaires pathogènes
=> participer aux efforts européens de surveillance des eaux
côtières en matière de pathogènes véhiculés par l’eau douce à
travers l’évaluation de la qualité microbiologiques de l’eau

13. Les micro-organismes ciblés dans ce projet:
Group
Pathogen
Bacteria
Campylobacter
E. coli O157:H7
Legionella
Mycobacterium
Salmonella
Shigella
Aereomonas spp.
Bacillus cereus 1
Clostridium botulinum
Clostridium perfringens
Listeria monocytogenes
Pseudomonas pp.
Staphylococcus aureus
Vibrio spp.
Yersinia enterocolitica
Microcystis aeruginosa
Planktonthrix
Nodularia spumigena
Anabaena spp.
Aphanizomenon flos-aquae
Cylindrospermopsis
Cyanobacteria
2 step detection rRNA
Standard probe on
Standard probe on
and toxin gene on
microtiter plate assay microarray glass slide
micro-array glass clide
Standard probe to
designed and
validated
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
x
x
x
x
x
x

14. La finalité du projet
Set de sondes spécifiques de
chaque cibles
Sondes hiérarchiques:
Groupe
phylum
Classe
Genre
Espèces
Impression des sondes sur
un support
Une bio-puce dédiée à la
détection et la
quantification de
nombreuses cibles
microbiennes
Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue 2015-2016

15. L’organisation d’une bio-puce
Grille
Impression des sondes sur
un support
Super-grille
Cluster de
Super-grille
Plusieurs millions de
spots (NimbleGen
Systems, Affymetrix,
Agilent Technologie)
Dupliqua
Du cluster de
Super-grille

16. Un autre type de puce: les puces ciblant les toxines
Toxine
+
Anticorps
=
SPR CHIP SURFACE
Plus le signal est faible, plus il y a de
toxines dans l’échantillon

17. Les toxines détectées à l’aide de puces
• Acide okadaïque
• Acide domoique
• Neosaxitoxine
• Saxitoxine
• Microcystine
• Anatoxines
• Cylindrospermopsines
• Nodularines

18. Les avantages des bio-puces sur les autres méthodes
• Pyroséquençage 454: délai de plusieurs semaines
• Spectrométrie de masse: réponse en plusieurs jours et coût élevé
• Microscopie (LM & SEM): temps et expertise taxonomique, faible nombre
d’échantillons
• Hybridation FISH: une espèce à la fois parfois deux
• qPCR limitée à 8 espèces maximum (multiplexe), inhibitions fréquentes des
réactions d’amplification
Bio-puces
• Nombre illimité d’espèces déposées sur la bio-puce avec possibilité
d’étudier facilement les nouvelles espèces
• Coût raisonnable 40 € par échantillon avec 2 réplicas et un nombre
d’espèces très important

19. L’accès à ces technologies?
Une jeune société créée en Avril 2013 co-fondée par
les Drs Carmem-Lara Manes et Delphine Guillebault
(Présidente):
Microbia Environnement

20. R&D
Bio-puce diagnostic
algues toxiques,
microorganismes
pathogènes
Développement de biopuce et biocapteurs
diagnostic et aide au
transfert de technologies
similaires
Commercialisation
produits
Prestation de
services
Diagnostic biologique
et caractérisation
phylogénétique d’un
environnement naturel
ou industriel à façon

21.  Prestations de services: diagnostic, identification,
surveillance, valorisation, projets à façon
 Développement technologique d’outils moléculaires de
détection
 Commercialisation de bio-puces de diagnostic
Vente de la bio-puce MIDTAL ou de
la prestation MIDTAL pour la
surveillance des algues toxiques
contact@microbiaenvironnement.com

22. Merci de votre attention