Toxicidad Aguda del Aceite Esencial Tomillo

Universidad Nacional San
Agustín de Arequipa

Wright SAC – Div.
WrightLab

TOXICIDAD AGUDA (DL50) DEL ACEITE
ESENCIAL de Thymus vulgaris L. “tomillo”
FRENTE A Artemia sp. y EFECTO SOBRE
POLIMORFONUCLEARES

CONSUELO E. ORIHUELA ABARCA
RENEE M. CONDORI APAZA
SAUL PEREZ MONTAÑO

ANTECEDENTES GENERALES
JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE LA INVESTIGACIÓN
El incremento del uso de los aceites esenciales en; la industria farmacológica,
cosmética, aromaterapia, bebidas y productos alimenticios, han creado una gran
necesidad de análisis para determinar su toxicidad y así poder realizar un uso
adecuado de estas sustancias.
El modo de acción de la mayoría de aceites esenciales con propiedad
antibacteriana, reside en su capacidad de dañar la integridad de la membrana
celular bacteriana, además de afectar el pH del medio intracelular y el equilibrio de
los iones inorgánicos. Este efecto se aprecia sobre todo en aquellos aceites que
tienen en su composición timol y carvacrol, como es el caso del aceite esencial de
tomillo.
La mayoría de estos trabajos coinciden en que uno de los aceites con mayor
potencial bacteriostático y bactericida es el aceite esencial de tomillo, el que
además por su alto contenido en compuestos fenólicos, es uno de los aceites con
mayor actividad antioxidante.
El carácter lipofílico de los compuestos fenólicos explica la capacidad
antimicrobiana del aceite de tomillo, debido a su capacidad de incorporarse a la
membrana lipídica de la célula microbiana, provocando la desestabilización de la
membrana, incrementando su fluidez y permeabilidad, deja salir el contenido
celular por lo cual la célula finalmente muere.

OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la toxicidad aguda del aceite esencial de Thymus vulgaris
L. “tomillo” sobre Artemia sp. y su efecto en polimorfonucleares.

Objetivos Específicos.
 Extraer aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”.
 Determinar la DL50 del aceite esencial de Thymus vulgaris L.
“tomillo” mediante el bioensayo con Artemia sp.
 Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L.
“tomillo” sobre la viabilidad de polimorfonucleares con la DL50
obtenida.
 Determinar el efecto del aceite esencial de Thymus vulgaris L.
“tomillo” sobre la funcionalidad de polimorfonucleares con la DL50
obtenida.

TOMILLO Thymus vulgaris L.
Clasificación taxonómica
 Reino: Plantae
 División: Magnoliophyta
 Clase: Magnoliopsida
 Orden: Lamiales
 Familia: Lamiaceae
 Subfamilia: Nepetoideae
 Tribu: Mentheae
 Género: Thymus
 Especie: T. vulgaris
Descripción botánica:
Es un arbusto de 0.10 a 0.40 m. Tallo tortuoso, leñoso, muy ramificado,
cuadrangular. Hojas opuestas, oblongo-lineares, pequeñas (hasta 8 x 1,5 mm),
de margen revoluto y no ciliado. Cáliz bilabiado, el labio superior formado por
tres dientes triangulares, anchos y el inferior por dos dientes largos y estrechos
de márgenes ciliados. Las flores son rosadas, pequeñas, en corimbo, se
encuentran dispuestas en verticilios. Los 4 estambres sobresalen de la corola y
el fruto es un tetraquenio, lampiño, de color marrón.

Composición Química

Esta planta contiene no menos de 1% de aceite volátil y por lo menos de
0.5% de fenoles. Los principales componentes de Thymus vulgaris son
el timol y el carvacrol (más del 64% del aceite) junto con el linalol, cimol,
p-cimeno, timeno, pineno, apigenina, luteolina, y 6-hidroxiluteolina
glicosidos, así como flavonoides di-, tri- y tetrametoxilados. El fármaco
también contiene flavonoides, como luteolina, apigenina, naringenina,
eriodictol, cirsilineol, salvigenina, cirsimaritina, timonina y timusina, entre
otros.
También contiene heterósidos monoterpénicos, ya que una pequeña
parte de timol y carvacrol se halla en forma de glucósidos o de
galactósidos6. Presenta otros componentes como los ácidos fenoles:
cafeico, rosmarínico; taninos y triterpernos (ácidos ursólico y oleanólico).
Sus componentes alcanzan la mayor concentración durante la época de
floración. Se ha visto que el aceite esencial extraído del tomillo en flor
llena, presenta un mayor poder bactericida.

Usos y propiedades
Actividad espasmolítico y antitusiva: Es atribuido a los constituyentes
fenólicos timol y carvacrol, las cuales constituyen un gran porcentaje de
el aceite volátil, también se debe por otra parte a las flavonas
metoxiladas. Estas últimas serían las responsables de la actividad de los
extractos fluidos de tomillo, cuyo contenido en timol y carvacrol suele ser
muy bajo. Por otro lado, se ha comprobado que la acción de los
flavonoides derivados del luteolol potencia la acción espasmolítico de los
fenoles, actuando sobre todo en la tráquea, gracias a una inhibición de la
fosfodiesterasa, seguida de un incremento del nivel intracelular del
AMPc.
Actividad expectorante y secretomotora: Evidencias experimentales
sugieren que esta actividad ha sido asociado con una saponina extraída
de T. vulgaris. Se ha observado además un incremento en la secreción
mucosa de los bronquios, después del tratamiento con aceite esencial
de “tomillo”. El aceite esencial de tomillo provoca una fluidificación de las
secreciones bronquiales y favorece a su eliminación, ejerce un efecto
relajante del músculo liso bronquial que justifica su uso como antitusivo.

Actividad antifungal y antibacteriana: El aceite esencial de tomillo debido a
sus componentes fenólicos, timol y carvacrol, tiene actividad antibacteriana
frente a bacterias Gram negativas y Gram positivas. Este efecto es debido a su
acción sobre la membrana. Estudios in vitro han demostrado que el aceite
esencial de Thymus vulgaris y el timol tienen actividad antifúngica frente a un
número de hongos incluyendo Cryptococcus neoformans, Aspergillus,
Saprolegnia, y especies de Zygorhynchus. Ambos, el aceite esencial y el timol
tienen actividad antibacterial frente a Salmonella typhimurium,4 Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, especies de Candida y un número de otras especies de
bacterias.
Por otra parte el extracto acuoso de tomillo inhibe de forma significativa, in Vitro,
el crecimiento de Helicobacter pylori y su potente actividad ureasa.
Otras acciones:
Actividad antioxidante, en la que se encuentran implicados el timol y el carvacrol
de la esencia, así como los flavonoides y otros polifenoles.
Produce una considerable estimulación de la leucopoyesis y una elevación de
los niveles de trombocitos en sangre, por ello se considera que puede ser
interesante su uso como potenciador de la acción de otros inmunoestimulantes.
Regulador hormonal: es débilmente estrogénico, compitiendo con el estradiol a
nivel del los receptores intracelulares. Por esta acción es posible la prevención
de enfermedades producidas por un exceso de xenoestrógenos, como es el
caso del cáncer de mama.

Modo de uso
La hierba desecada se utiliza para infusión, aceite esencial y tintura.
Vía oral:
Infusión al 5%:
Fármaco pulverizado encapsulado: 400 mg del polvo del Tomillo.
Extracto fluido, 1:1 (g/ml).
Extracto seco (5:1)
Aceite esencial: el aceite esencial se puede administrar por vía oral (1-5
gotas por dosis, sobre un terrón de azúcar o en solución acuosa), en
forma de inhalaciones secas, inhalaciones húmedas o vahos, cápsulas
entéricas (25-50 mg por cápsula), entre otras.
Vía tópica:
Decocción al 5%
Gel antiséptico al aceite esencial de tomillo: 5% de extracto glucólico.
Alcohol de tomillo (antiséptico).
Aceite al tomillo (antiséptico).
Extracto fluido (1:1): puro o diluido al 50% (colutorios o gargarismos).

ACEITES ESENCIALES
Son mezclas complejas de diferentes sustancias químicas, (generalmente en
número mayor de un millar); sin embargo, sus componentes principales
pueden ser menores, la proporción de estas sustancias varía de un aceite
esencial a otro, e incluso dentro de una misma especie, dándoles unas
propiedades medicinales y una toxicidad característica para cada
planta, estas proporciones varían en función del momento de recolección de
la planta.
Son líquidos (en algunas casos semisólidos y muy raras veces sólidos) poco
solubles en agua pero si volatilizables con vapor, se evaporan a diferentes
velocidades bajo presión atmosférica.
Los aceites esenciales son variables en sus constituyentes, observándose
dos series, caracterizadas por orígenes biosintéticos distintos, la serie
terpénica y la serie aromática; los compuestos arénicos son derivados del
fenilpropano y existen en diversas partes de las plantas. Los terpenos son
los constituyentes de los aceites esenciales con mayor predominancia
siendo principalmente cadenas de hidrocarbonos, monoterpénicos y
sesquiterpeno con la formula general (C5H8)n que derivan de componentes
oxigenados de estos hidrocarbonos donde están los
alcoholes, aldehídos, esteres, éteres, cetonas, fenoles y óxidos

Composición de los aceites esenciales
Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta más
de 100 componentes que pueden tener la siguiente naturaleza química:
Serie terpénica.
 Monoterpenos; Están constituidos principalmente por hidrocarburos
acíclicos, monocíclicos, bicíclicos policíclicos, los que van acompañados
de sus alcoholes, aldehídos, cetonas, esteres, éteres. Aunque están
formados por dos isoprenos curiosamente son llamados monoterpenos.
 Sesquiterpenos.- La cadena al aumentar el número de ciclaciones y de
modificaciones posteriores posibles crece de manera espectacular.
Serie aromática.
Los compuestos de esta serie son mucho menos frecuentes que los monos y
sesquiterpenos, derivando en su mayoría del fenilpropano, que son producto
del metabolismo del ácido shikimico.
Algunos aceites esenciales contienen pequeñas cantidades de compuestos
acíclicos no terpénicos como alcoholes, aldehídos, cetonas de peso
molecular bajo.

Tipos de
Extracción de
los Aceites
Esenciales

ARTEMIA Sp.
Descripción
 Reino: Animalia
 Filo: Arthropoda
 Subfilo: Crustacea
 Clase: Branchiopoda
 Orden: Anostraca
 Familia: Artemiidae
 Género: Artemia
 Especie: Artemia sp.
Del griego artemía que significa óptima conservación. Género de
crustáceos branquiopodos del orden anostráceos, de pequeño tamaño
llegando a alcanzar 10-15 mm en etapa adulta, y desprovistos de
caparazón. Viven en las aguas salobres del litoral o del interior.
Presentan razas anfigónicas y partenogenéticas, adaptadas a cada
medio en particular. En las razas partenogenéticas son frecuentes las
formas polipoides. La Artemia es un filtrador no selectivo y se alimenta
tanto de materia orgánica particulada.

Ciclo de Vida y Desarrollo
El camarón de salmuera posee la propiedad de reproducirse de dos
maneras diferentes.
Dependiendo de las condiciones ambientales ya sea larvas de libre
natación (ovoviviparidad) o quistes o huevos latentes (oviparidad) son
liberados. La reproducción ovovivípara (nauplios como descendencia)
ocurre mayormente en niveles de baja salinidad, considerando que los
quistes (reproducción ovípara) son producidos en salinidades más allá
de 150 ppt.

Cultivo de Artemias Salinas
Parámetros Ambientales
 Temperatura: Deberá mantenerse en el intervalo de 25–30°C. A
temperatura por debajo de 25°C la eclosión es más lente y por encima
de 30°C el metabolismo de los quistes se detiene irreversiblemente.
 Salinidad y pH: La composición química del medio debe de tener iones
de Na, K, Mg en proporciones adecuadas. La relación Na:P es muy
importante. Cabe mencionar que se han transferido especies de medios
con sales de Carbonatos a medios con sales de Sulfatos, y se ha
reportado que pueden adaptarse a ellos, observándose cambios de
interés en la cepa adaptada diferente a la cepa original.
 pH: En relación al pH, se considera adecuado el rango de 8.0 a 10.0.
 Oxígeno: El rango de O2 es amplio desde 1.0 mg/l hasta saturación de
O2 .
Alimentación
Se han encontrado en análisis del contenido del tubo digestivo desde algas
y detritus hasta granos de arena, lo que demuestra que es un organismo
filtrador no selectivo, por lo que puede ingerir materiales contaminados.
Ingiere partículas de 1.2 a 50 μ. Sólo se alimenta de partículas, no de
alimentos solubles. La Artemia no regula su nutrición (se alimenta las 24 h).

Proceso de Eclosión
Es un fenómeno químico puro (intercambio iónico), relacionado con la
concentración de glicerol que posee el embrión, a mayor producción de
glicerol hay mayor absorción de agua; en etapas críticas de presión osmótica
la membrana se rompe, y después la concentración de glicerol súbitamente
baja a cero, el glicerol es liberado. Si bien se ha observado que en altas
densidades de quistes la presencia de glicerol es importante, pues interviene
en la sincronía de la eclosión (ya que no actúa tóxicamente sobre las larvas).

Bioensayo con Artemia sp
Los bioensayos permiten evaluar la bioactividad presentada por algunos
metabolitos secundarios y las respuestas que generan al establecerse la
interacción del producto natural con los organismos.
Actualmente, la Artemia se utiliza como especie de bioensayo para una
variedad de objetivos tales como:
Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y
muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguda de sustancias químicas,
extractos vegetales, detección de toxinas naturales en comestibles y
farmacéuticos, estudios de modelos de acción toxica de sustancias, y
estudios de la transferencia trófica de contaminantes.

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD
TOXICOLÓGICA
Uno de los aspectos importantes para la evaluación de la actividad
toxicológica es la relación entre la concentración de un compuesto
químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto
nocivo que le produce. Esta relación, conocida como relación dosis-
respuesta.
Dosis Letal DL50
La dosis letal 50 % (DL50) es un término muy utilizado para expresar la
magnitud de la virulencia de microorganismos (virus, bacterias) y la
toxicidad de sustancias sintetizadas por éstos.
Análisis Probit
El análisis estadístico Probit es un tipo de regresión utilizado para
analizar las variables de respuesta binomial. La cual transforma la
respuesta de la curva de dosis-respuesta de forma sigmoide en una
línea recta que luego pueden ser analizados por la regresión o bien a
través de los mínimos cuadrados o máxima verosimilitud.

INTRODUCCIÓN AL SISTEMA
INMUNITARIO
Las células fagocíticas son muy importantes en la defensa de los seres
vivos frente a lo que les es extraño. Esta acción protectora se ve
reforzada por el resto de los sistemas de defensa que junto a las
primeras, constituyen el sistema inmunológico:

a) La inmunidad inespecífica o innata, se compone de las barreras
naturales, los factores celulares y los humorales.
b) La inmunidad específica o adaptativa, surge tras la interacción
entre el agente reconocido como extraño y el sistema inmune.
Existen dos tipos de inmunidad específica.

LEUCOCITOS
Hace aproximadamente un siglo, Paul Ehrlich sentó las bases de la
inmunidad inespecífica al describir la existencia de tres tipos de células
fagocíticas en la sangre: los neutrófilos, los eosinófilos y los
monocitos, pero fue Elie Metchnikoff quien delimitó poco más tarde
sus funciones al observar que durante la respuesta inflamatoria los
leucocitos ingerían microorganismos mediante el proceso que
denominó fagocitosis. Existen dos tipos de fagocitos: los leucocitos
polimorfonucleares (PMN), que son células circulantes que emigran a
los sitios de inflamación y los fagocitos mononucleares, que circulan
por la sangre o bien se encuentran fijos en los tejidos y que también se
acumulan en los lugares de inflamación.
En la sangre se encuentras seis tipos de glóbulos blancos:
polimorfonucleares neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos,
linfocitos, y células plasmáticas. Además hay un gran número de
plaquetas.

POLIMORFONUCLEARES
NEUTRÓFILOS (PMN)
Se llaman polimorfonucleares por su núcleo multilobulado, neutrófilos por
carecer de coloración citoplasmática específica. Son los leucocitos más
numerosos en la circulación. Los PMN neutrófilos son células sanguíneas
de vida efímera y sumamente móviles que penetran rápidamente en las
zonas de infección para ingerir y destruir a los microorganismos.
Producción
La médula ósea es el sitio de producción de los polimorfos y su desarrollo
se puede dividir en dos etapas una primera fase proliferativa o mitótica
seguida de una segunda fase de maduración.
Función
La función de la célula fagocítica en la defensa del hospedador contra los
microbios depende de los siguientes pasos 58: migración de los fagocitos
sanguíneos al interior de los tejidos y establecimiento de contacto con los
microbios invasores, fagocitosis, y acontecimientos post fagocíticas que
conducen a la muerte intracelular y digestión de los microbios.

Migración de los neutrófilos al interior de los tejidos.
La secuencia de sucesos en la migración de los neutrófilos comienza
con la adherencia de la célula al endotelio vascular, especialmente a las
vénulas postcapilares.
El receptor MAC-1, también llamado MO-1 y OKM-1, se encuentra en
PMN y también en monocitos, células NK y en algunos linfocitos; esta
molécula funciona como el receptor de C3b~ (CR3).

Quimiotaxis.
Los leucocitos son capaces de responder frente a determinadas
sustancias con un movimiento dirigido, desde una concentración menor
a una mayor. Este es el fenómeno de la quimiotaxis y depende del
complemento e indirectamente de las inmunoglobulinas lgM e lgG que al
unirse a los anticuerpos superficiales del organismo activan
secuencialmente los componentes del complemento.

Fagocitosis.
Es el proceso por el cual las células ingieren sustancias particuladas. En
ella hay un reconocimiento previo a la ingestión. Para que una partícula
sea ingerida es necesario que se una a determinadas áreas de la célula
fagocítica. Los microorganismos encapsulados evitan esa unión y por lo
tanto resisten la ingestión, contribuyendo este hecho a su patogenicidad.
Esta propiedad antifagocitaria puede quedar limitada por el proceso de
opsonización.
Acontecimientos postfagocíticos.
a) Desgranulación. Es el proceso por el cual gránulos citoplásmicos se
fusionan con la membrana del fagosoma y vierten su contenido
enzimático al interior de aquél. Este fenómeno se ve acompañado de una
caída del pH en el interior del fagosoma hasta valores de 3,5 o 4, acidez
necesaria para activar las hidrolasas ácidas vertidas por los gránulos.
b) Estimulación del metabolismo celular oxidativo. También llamado
estallido respiratorio; implica un marcado aumento en el consumo de
oxígeno y a un sistema enzimático, NADPH oxidasa, que cataliza la
transferencia de un electrón del NADPH al oxigeno molecular. El producto
de esta reacción es el anión superóxido (O;) con la consiguiente
formación de agua oxigenada gracias al pH ácido del fagosoma.

CANDIDA ALBICANS
Es un levadura polimórfica asociada obligatoriamente a animales de
sangre caliente. Normalmente está presente en el hombre como
comensal, pero puede presentarse como patógeno produciendo
infecciones. Este Hongo dimorfo que forma largas seudohifas, hifas y
blastoconidios (células gemantes subesféricas de 3-8 x 2-7 μm).
Asimilan y fermentan azúcares. Numerosas clamidosporas unicelulares,
redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente (8-16 μm de
diámetro), situadas al final de las hifas, seudohifas o laterales sobre
blastoconidios ovalados. Se caracteriza de la siguiente forma:
 Reino: Fungi
 Phylum: Ascomycota
 Orden: Sacharomycetales
 Familia: Sacharomicetaceae
 Género: Candida
 Especie: C. albicans

Interacciones entre Quimioterápicos, Microorganismos y Células
Fagocíticas:
La evolución favorable de las enfermedades infecciosas depende
esencialmente de la eficacia de las células fagocíticas para destruir
microorganismos y de una quimioterapia adecuada. Esto hace que sea
necesario conocer las interacciones que se establezcan entre
microorganismos, células fagocíticas y quimioterápicos.
Interacción de Quimioterápicos con Agente Patógeno y Hospedador
(Triángulo de Davis)

Interacción de los Quimioterápicos con la Actividad Funcional de
las Células Fagocíticas:
Los quimioterápicos pueden actuar directamente sobre las células
fagocíticas modificando su capacidad funcional. Las funciones que
pueden quedar alteradas son la quimiotaxís, la fagocitosis y la capacidad
microbicida.

Efecto de los quimioterápicos en las interacciones leucocito-
microbio: efectos PAE, PAFE Y PALE. (efecto post antibiótico, post
antifúngico y efecto post antibiótico leucocitario):
Los efectos de los quimioterápicos sobre las células fagocíticas descritos
anteriormente se pueden suplementar con los efectos independientes de
los quimioterápicos sobre los propios agentes patógenos.

INTERACCIONES PMN-QUIMIOTERAPICO

Métodos para medir la fagocitosis:
Se puede medir desde la incubación con partículas inertes con bacterias.

Microscopía: Consiste en contar el número de partículas ingeridas en
función del tiempo, su ventaja es que provee una vía visual directa y
como tal es de gran valor para validar los resultados obtenidos con otros
métodos o para contar el número de partículas ingeridas por un
determinado número de fagocitos.

Algunos autores utilizan antibióticos para combatir bacterias
extracelulares, pero puede producirse interacciones no deseables.
Durante el ensayo se puede contabilizar la ingesta de partículas
intracelulares o bien se puede contabilizar las partículas ingeridas
restando del total adicionado las que se observan en el sobrenadante
después de un pase de centrifugación. Con éste método se intenta
distinguir entre la ingesta completa de la partícula y los elementos
adheridos a la célula.

METODOLOGIA
Determinación de la toxicidad aguda (DL50) del aceite esencial de
“tomillo” (Thymus vulgaris L.) en Artemia sp. y Efecto sobre PMNs

Obtención del aceite esencial de Thymus vulgaris L.
Se adquirió material vegetal seco consistente en hojas y flores de
Thymus vulgaris (tomillo) .

El método que se empleó para la obtención de aceite esencial, fue el
método de destilación por arrastre con vapor de agua, siendo este el
método más usado actualmente, porque permite aislar el aceite esencial
con buen rendimiento y tratar una cantidad grande de material. Entonces
se colocó aproximadamente 1Kg de material seco dentro de un
alambique de acero inoxidable, el material se encontraba separado
mediante una plataforma perforada del agua en ebullición, de tal manera
que no hacía contacto directo con el agua, pero si tenia un contacto
directo con el vapor de agua, este vapor mas el aceite esencial pasa a
través de un condensador de serpentín, que desemboca en una probeta
graduada, donde el aceite se separa del agua y se ubica en la parte
exterior, el aceite fue separado del agua poco a poco haciendo uso de
una jeringa. Se extrajo 12ml de aceite esencial, que fue conservado en
un frasco de vidrio ámbar, en un lugar fresco y protegido de la luz, hasta
su posterior utilización.

Procedimiento para el Bioensayo en Artemia sp.

Huevos de Artemia sp

Aceite esencial de Thymus Desactivación de la
vulgaris diapausa

Eclosión de huevos y
Preparación de diluciones
separación de nauplios de
con DMSO
Artemia sp

Bioensayo

Experimental 5 tubos x
Blanco x 5 tubo (10
Control x 5 tubos cada dilucion (10 indiv.
indiv. x tubo)
(10 indiv. x tubo) x tubo)

Incubación con
Incubación con dilución de aceite
Incubación con solución salina y
solución salina esencial+DMSO en
DMSO solución salina

24 horas de incubación

Conteo de individuos muertos

Determinación de la DL50
mediante el método de Finney

Evaluación del efecto tóxico en Polimorfonucleares - PMNs

Obtención de PMNs:
Se tomaron muestras de sangre venosa periférica de un donante sano. Se
colocaron dos gotas separadas de sangre en una lámina portaobjetos
limpia, se prepararon cinco láminas para control, y cinco láminas para la
muestra experimental, todas las láminas fueron llevadas a incubar en
cámara húmeda a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos.
Transcurrido este tiempo, se extrajo de la estufa, la cámara húmeda y se
procedió a cubrir las gotas de sangre con PBS (solución buffer fosfato
salino), para luego comenzar a despegar cuidadosamente los bordes de
los coágulos con una aguja desechable, seguidamente se procedió con la
remoción del coágulo y lavado de la lámina mediante un chorro continuo
de PBS con la ayuda de una pipeta Pasteur, concluido este proceso se
obtuvieron dos áreas de PMNs adheridos en cada lámina portaobjetos.

Prueba de viabilidad
El punto de partida de los tratamientos será la Dosis letal media (DL50
hallada en el bioensayo con Artemia sp.), para comprobar el efecto sobre
la viabilidad de los PMNs. La solución de aceite esencial fue preparada
con PBS y utilizando DMSO como diluyente.

Se dispusieron 5 láminas para ser expuestas a la acción del aceite
esencial y 5 láminas para servir en calidad de control.
Se cubrió las áreas de PMNs adheridos, con las soluciones que
correspondían, según se trataba de controles o de muestras
experimentales, se llevaron las láminas a incubar a 37ºC durante 30 ó 60
minutos, según era el caso. Al cabo de este tiempo se procedió a lavar las
láminas con PBS, luego se cubrió el área de PMNs con una gota de Azul
de Tripán al 0.4% (peso/volumen en solución isotónica salina), se colocó
un cubreobjetos a fin de eliminar el exceso de colorante. Luego se
procedió al conteo de PMNs en un microscopio óptico a 40X,
diferenciando las células vivas (refringentes) de las muertas (azules).
Con los datos se obtuvo los porcentajes de viabilidad de las muestras y
de los controles, valores con los cuales se halló el índice de viabilidad,
haciendo uso de las siguientes fórmulas:

Se consideró una concentración como tóxica cuando su índice de
viabilidad fue menor a 90%. Así mismo las láminas control que
presentaron una viabilidad menor del 95% fueron descartadas.
Prueba de funcionalidad de polimorfos
La cepa de Candida albicans fue obtenida del laboratorio UPSIPROBI e
identificada por el método del tallo germinativo, una vez identificada la cepa
se procedió a su siembra en agar Saboraud y a su posterior incubación a 37º
C por 24 horas. Concluido este tiempo se extrajo la placa de la estufa y se
mantuvo en refrigeración hasta su posterior utilización, se realizó la
renovación del cultivo cada cuatro días.
Para la preparación de la suspensión se tomó una muestra de las colonias
de Candida albicans formadas en la placa con un asa de siembra, se disolvió
en 5ml de PBS (buffer fosfato salino, pH 7.4). Seguidamente se colocó sobre
una lámina portaobjetos, una gota de la suspensión preparada, se vertió una
gota de azul de Tripán y se procedió a leer la viabilidad de la C. albicans en
un microscopio óptico a 40x, se descartaron las muestras que presentaron
una viabilidad menor a 95%.
Luego se realizó el conteo de levaduras de la suspensión en una cámara de
Newbauer, luego se ajustó la suspensión a 2x106 C. albicans/ml en una
solución de PBS con 20% de suero autólogo para la opsonización de las
levaduras.

Prueba de funcionalidad
Para esta prueba se utilizó la Dosis letal media hallada en el bioensayo
con Artemia sp.
Los PMNs aislados fueron expuestos durante 30 y 60 minutos a la acción
del aceite esencial de T. vulgaris, luego de transcurrido el tiempo, se lavó
las láminas con PBS y se cubrió los PMNs con aproximadamente 0.5ml
de la suspensión de C. albicans preparada previamente, la cual contenía
2x106 candidas/ml y 20% de suero antólogo.
Se incubaron las láminas en cámara húmeda a 37ºC por 30 minutos,
luego del cual se lavaron las láminas con PBS. Seguidamente se fijaron
con metanol absoluto durante 30 a 60 segundos, se enjuagaron con agua
y se procedió a teñir con Giemsa .3%, cubriendo el área con el colorante
y dejándolo actuar durante 7 a 10 minutos, a continuación se lavó las
láminas y se las dejó escurriendo hasta el momento de su lectura en
microscopio óptico a 100X.
Se contabilizó el número de PMNs que lograron fagocitar y la cantidad de
partículas ingeridas por cada PMN, se contarán un total de 100 PMNs en
cada área de las láminas expuesta al aceite esencial, es decir 200 PMNs
por lámina portaobjetos.

Luego se obtuvieron los índices fagocíticos de las muestras y de los
controles, índices que fueron relacionados en una fórmula, para obtener
de este modo las eficiencias fagocíticas para cada muestra.

Se consideró una concentración como tóxica siempre y cuando en las
láminas expuestas a esta concentración presentaron una eficiencia
fagocítica menor al 95%.

Metodología estadística
Para analizar los experimentos se compararon los 4 grupos (DL50 a los
30min, DL50 a los 60min y sus respectivos controles) por medio de un
análisis de varianza, con un nivel de significancia de p< 0.05.

Adicionalmente se comparó a través de una prueba de T de student para
datos emparejados (resultados de los tratamientos con sus respectivos
controles), con un nivel de significancia de p< 0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Rendimiento y densidad del aceite esencial de Thymus
vulgaris
Luego de la extracción del aceite de Tomillo se logro determinar un
rendimiento de 1.5%, lo cual significa que para obtener un litro de aceite
esencial de tomillo se requieren aprox. 67 kilos de tomillo desecado.
En otro estudio se encontró un rendimiento de 2.05% utilizando la
misma metodología empleada en esta investigación, es también
importante mencionar que el rendimiento de los aceites depende de
factores climáticos y calidad de los suelos.

La densidad del aceite esencial de tomillo obtenido fue de 0.969g/ml,
este valor no difiere mucho del encontrado en otro estudio (0.939g/ml).
Esto es muy relativo ya que como puede variar el rendimiento y la
composición por diversos factores, también otros parámetros físicos
como la densidad también puede variar debido a la variación de
quimiotipos, etapa del ciclo de vida de la planta, diferentes partes de la
planta, factores ambientales y estacionales, condiciones estacionales de
cultivo.

RESULTADOS DEL BIOENSAYO EN Artemia sp.
Dosis Porcentaje de
Log (Dosis) Probit
(ppm) Mortalidad (%)
3.03 0.48 6.7 3.50
6.06 0.78 35.5 4.63
12.11 1.08 91.7 6.39
24.23 1.38 100.00 8.72
48.45 1.69 100.00 -
96.9 1.99 100.00 -

El grado de mortalidad parece guardar una correlación con la dosis
empleada, ya que a dosis mayores se puede apreciar una porcentaje de
mortalidad mayor, así se puede apreciar que el menor porcentaje de
mortalidad se encuentra a la dosis de 3.03ppm y el mayor porcentaje de
mortalidad a las dosis de 24.23ppm, también se puede notar que la DL50
podría hallarse entre la concentraciones de 6.06ppm a 12.11ppm.

PROBIT VS LOGARITMO DE DOSIS

Para fines de lograr una regresión lineal se han transformado los
porcentajes de mortalidad a Probits (Tabla de Finney) y la concentración
en logaritmo de dosis, según la gráfica, el coeficiente de correlación (R2)
tiene un valor de 0.976, por lo tanto si conocemos el valor del Probit
podremos predecir con un 97.6% de confiabilidad el valor del Log de la
dosis y un valor preliminar de 6.18ppm para la DL50 del aceite de tomillo.

Resultados del Segundo Bioensayo en Artemia sp.
Dosis Porcentaje de
Log (Dosis) Probit
(ppm) Mortalidad (%)
1.6 0,2 1,5 2.83
3.2 0,5 7,8 3.58
6.4 0,8 44,9 4.87
12.8 1,10 85,5 6.06
25.6 1,40 98,3 7.12

En el segundo bioensayo se han utilizado dosis intermedias a las
empleadas en el primer bioensayo para hallar un valor de DL50 más
exacto.
En los resultados obtenidos se puede apreciar que la DL50 se encuentra
más cercana a la dosis de 6.4ppm.

PROBIT VS LOGARITMO DE DOSIS

La gráfica corresponde a la regresión lineal obtenida entre los Probits y el
Logaritmo de las dosis utilizadas, el coeficiente de correlación (R2) en este
bioensayo, es de 0.9943, lo cual indica que existe una mejor correlación
que en la regresión del primer bioensayo, por lo tanto en éste segundo
bioensayo luego de aplicar el método de Finney y de realizar los cálculos
respectivos se ha determinado el valor de 6.75ppm para la DL50 del aceite
de tomillo siendo este valor más exacto.

La toxicidad hallada en este experimento es más elevada a la que se
encontró en larvas del insecto Spodoptera frugiperda (0.277g/ml lo que
equivale a 277000ppm), lo cual es lógico debido a que estas larvas
presentan una estructura más compleja que las larvas de Artemia sp.
La toxicidad observada es un indicativo de la presencia de potentes
componentes citotóxicos, de hecho, se ha comprobado en numerosos
casos la actividad biológica del aceite esencial de tomillo, así, numerosos
estudios consideran que el aceite esencial de tomillo está entre los más
potentes aceites esenciales con respecto a las propiedades
antimicrobianas, sumado a esto, de manera aislada los componentes
mayoritarios del aceite esencial de tomillo (timol y carvacrol) tienen
comprobada actividad citotóxica, así es que están considerados entre los
más activos compuestos agonistas de múltiples patógenos transmitidos
por alimentos, el timol, compuesto fenólico monocíclico con actividad
bactericida, también se le ha encontrado propiedades moluscicidas e
insecticidas.
Es conocido que la Na-K-ATPasa es una enzima fundamental para
mantener el equilibrio iónico dentro del fluido corporal interno de la
Artemia, en este contexto algún factor externo que perturbe el adecuado
funcionamiento de esta enzima denotaría graves alteraciones fisiológicas,
que podrían concluir con la muerte del organismo.

Resultados de la Prueba de Viabilidad de PMNs

Fuente de
GL SC MS Fc
variación

Tratamiento 3 348.9 116.3
9.9487
Error 36 421 11.69
Total 39 769.9
Fc > Ft; p<0.05

Luego de aplicar la prueba de Análisis de Varianza con un 99.5% de
confianza se ha determinado que existe diferencia significativa entre los
grupos de investigación evaluados .

T de Student para la Prueba de Viabilidad de PMNs
Dosis Tiempo x ds t p
7ppm 93.4 ± 5.19
30min 3.683 <0.05
control 99.5 ± 0.71
7ppm 93.8 ± 4.26
60min 4.169 <0.05
control 99.5 ± 0.71
7ppm 30min 93.4 ± 5.19
0.188 >0.05
7ppm 60min 93.8 ± 4.26
12ppm 75.3 ± 4.97
30min 15.248 <0.05
control 99.5 ± 0.71

El T de Student con un 99.5% de confianza ha demostrando que existe un
efecto del aceite esencial sobre los PMNs, no obstante como se puede
observar, los valores promedio de viabilidad en los tratamientos no son
menores a 90% en ninguno de los casos, siendo este el valor que se toma
como parámetro de normalidad. Dado que la viabilidad es normal, no se
considera que exista un efecto tóxico del aceite esencial sobre PMNs a la
concentración empleada. Sin embargo cuando la concentración del aceite
esencial es de 12ppm, el porcentaje de viabilidad se reduce a 75.3% lo
cual indica la existencia de un efecto tóxico al compararlo con los
parámetros normales de referencia, además, la diferencia estadística con
el control es mayor que en los casos anteriores.

Resultados de prueba de funcionalidad en PMNs

Fuente de
GL SC MS Fc
variación

1.025
Error 20 528.17 26.41
Total 23 609.40
Fc < Ft; p>0.05

Luego de la prueba estadística aplicada se ha determinado con un 99.5%
de grado de confianza que no existe diferencia significativa entre los
grupos evaluados.

T de Student para el porcentaje de fagocitosis

Dosis Tiempo x ds t p
7ppm 83.0 ± 7.68
30min 1.604 >0.05
control 88.5 ± 3.39
7ppm
60min 80.83 ± 4.75 0.827 >0.05
control
82.83 ± 3.54

Aplicando la prueba T de Student, con un 99.5% de confianza se ha
determinado que no existe diferencia significativa entre los tratamientos
y los respectivos controles. Debido a estos resultados se puede inferir
que no existe efecto tóxico del aceite esencial a la concentración
probada.

Eficiencia fagocítica de PMNs sometidos al aceite esencial

Tiempo de Eficiencia
Dosis
exposición Fagocítica (%)
30 min 94.88
7ppm
60 min 90.48

Los resultados de la tabla indican los porcentajes de eficiencia
fagocítica de los PMNs luego de ser sometidos a dos tiempos de
exposición.
Los porcentajes se encuentran dentro de los parámetros normales que
se ha tomado como referencia en el presente estudio (mínimo 85%), lo
cual indica que no ha existido efecto tóxico del aceite esencial sobre la
funcionalidad de los PMNs, a la dosis evaluada.

Análisis del promedio de levaduras fagocitadas por
PMNs
Fuente de Dosis Tiempo x ds t p
GL SC MS Fc
variación 7ppm
30min 2.41 ± 0.3 0.610 >0.05
control
2.54 ± 0.42
7ppm
3.725 60min 2.85 ± 0.31 1.515 >0.05
control
Error 20 3.53 0.1767 3.15 ± 0.38
7ppm 30min
Total 23 5.51 2.41 ± 0.3 2.5 <0.05
7ppm 60min
Fc > Ft; p<0.05 2.85 ± 0.31

Se ha determinado con un 99.5% de confianza que existe diferencia
significativa entre los grupos evaluados y al aplicar la prueba de T de
Student con un 99.5% de confianza se ha determinado que no existe
diferencia significativa entre los tratamientos con aceite esencial y los
respectivos controles.
Sin embargo se ha encontrado una diferencia significativa entre los tiempos
de tratamiento, lo cual demuestra que el tiempo ha influenciado en el
número de levaduras fagocitadas por PMNs. Siendo mayor el promedio a
los 60min.
Por lo tanto al incrementar el tiempo de exposición con la suspensión de
Candida albicans, los PMNs han logrado fagocitar un mayor número de

CONCLUSIONES
 Se extrajo el aceite esencial de Thymus vulgaris L. “tomillo”,
obteniéndose con un rendimiento de extracción de 1.5% y una
densidad de 0.969g/ml.
 Mediante la DL50 se determino el grado de toxicidad del aceite
esencial Thymus vulgaris L. “tomillo” mediante el bioensayo con
Artemia sp obteniéndose un grado de toxicidad a 6.75ppm.
 Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial
de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la viabilidad de
polimorfonucleares al emplearse la dosis hallada por la DL50
obtenida en el bioensayo. Sin embargo el efecto tóxico se
manifiesta a la dosis de 12ppm.
 Se ha determinado que no existe efecto tóxico del aceite esencial
de Thymus vulgaris L. “tomillo” sobre la funcionalidad de
polimorfonucleares con la dosis de la DL50 obtenida en el
bioensayo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Cosentino S, Tuberoso CIG, Pisano B, Satta M, Arzedi E, Plamas F: In
vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinians
Thymus essential oils. Lett Appl Microbiol 1999; 29:130-135.
 Crespo ME, Jimenez J, Gomis E, Navarro C: Antibacterial activities of
the essential oil of Thymus serpylloides subspecies gadorensis.
Microbios 1990; 61:181-184.
 Culici M, Capretti V, Dal Sasso M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC:
Evaluation of thymol inhibition of Candida albicans adhesiveness to
human vaginal cells. GIMMOC (submitted), 2005.
 Dal Sasso M, Culici M, Guffanti EE, Mucci M, Braga PC: Thymol
inhibitory activity on Escherichia coli and Staphylococcus aureus
adhesion to human vaginal cells. J Essent Oil Res (submitted), 2005.
 Dorman HJ, Deans SG: Antimicrobial agents from plants: antibacterial
activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol 2000; 88:308-316.
 Vardar-Ünlü G, Candan F, Sökmen A, Daferera D, Polissiou M,
Sökmen M, Dönmez E, Tepe B: Antimcirobial and antioxidant activity of
the essential oil and methanol extracts of Thymus pectinatus Fisch, et
Mey. Var. pectinaus (Lamiaceae). J Agric Food Chem 2003; 51:63-67.

Bajo un sueño se avanza, la Ciencia!!!

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