Présentation mémoire Master de Recherche en Biologie Fonctionnelle Parcours: Physiologie Appliquée et Physiopathologies
1. Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en
Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage
Bronchiolo-Alvéolaire
1
FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
HÔPITALABDERRAHMEN MAMI DE L’ARIANA
LABORATOIRE D’ANATOMIE ET CYTOLOGIE
PATHOLOGIQUE
INSTITUT PASTEUR DE TUNIS
LABORATOIRE D’HÉMATOLOGIE
RÉPUBLIQUE TUNISIENNE, MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR
Réalisé et présenté par:
Rihem KASMI
Soutenue devant:
Président de Jury: Pr. MARRAKCHI Raja
Examinateur : Pr. MEZNI Faouzi
Encadreurs: Dr. MLIKA Mouna
Dr. SAFRA Inès
2. Plan
Introduction : les pneumopathies interstitielles diffuses
Objectif
Patients et méthodes
Résultats et discussion
Conclusions et perspectives
2
3. Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Définition des PID
• Groupe hétérogène de pathologies
pulmonaires diffuses.
• Caractéristiques histologiques:
Atteinte de l’interstitium pulmonaire
Espaces entre les cellules alvéolaires et les
membranes basales endothéliales par de
l’inflammation et de la fibrose
• Autres structures:
les lumières alvéolaires
les bronchioles
les vaisseaux 3
4. 4
Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Pneumopathies interstitielles idiopathiques
NSIP
COP RB-ILD LIPUIP
AIP DIP
ATS/ERS consensus ERS 2002
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cause connue
Connectivite, médicament,
exposition
Cause inconnue, entités bien
déterminées
Granulomatose
Sarcoïdose
l’alvéolite allergique
l’histiocytose X
6. Épidémiologie:
• En Tunisie:
2000-2005 : 1707 7.2% des motifs d’hospitalisation.
Âge moyen = 51 ans.
Sex-ratio = 0,51.
6
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Prévalence 67-81/100 000
Incidence 26-32/100 000/an
Âge moyen 51-69 ans
Coultas et al. Am J Respir Crit Care Med 1994
Cas
asymptomatiques
non diagnostiqués
Cas
symptomatiques=10X
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
7. 7
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Physiopathologies des
PID
• Mécanismes méconnus:
• Origine infectieuse
• Origine immunologique
• Origine environnementale
• Origine toxique.
Facteurs génétiques
Facteurs environnementales
Poussières, fumées
Agression
Infections
Tabagisme
Radiation
Facteurs
immunologiques
Autres maladies
Lésions de l’épithélium alvéolaire
Pneumopathie interstitielle Guérison
Activation du processus de réparationPrédisposition génétique à une altération
du processus de réparation
7
8. Démarche diagnostique:
• Processus dynamique résultant
d’une concertation multi-disciplinaire
• Peut prendre du temps
• Peut être révisé à tout moment lors du suivi
8
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Démarche
diagnostique
Radiologues
PathologistesPneumologues
9. Démarche diagnostique:
9
Endoscopie bronchique et Lavage Broncho-
Alvéolaire
Imagerie médicale
Radiographie standard du thorax
TDM-HR
Examen clinique
Explorations respiratoires
Examens biologiques
Interrogatoire
Histoire du patient
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
10. Démarche diagnostique: Interrogatoire et ATCD
• L’interrogatoire joue un rôle clé:
• Recherche de signes d’orientation
• Recherche d’une éventuelle exposition
• Recherche d’ATCD à valeur dianostique
Interrogatoire
Histoire du patient
10
11. • Bilan immunologique:
systématiquement en cas:
Atteinte extra-respiratoire
Une maladie systémique était suspectée
Selon Cottin: recherche
Anticorps anti-nucléaires
Anticorps anti-peptides cycliques citrulinés
Facteur rhumatoide.
Recherche de précipitines justifiée si notion
d’exposition à des antigènes organiques ou
suspicion de PHS à l’interrogatoire
• Examen clinique:
• selon les dernières recommandations de la
Société Française de Pneumologie, râles
crépitants secs et bilatéraux reproduisant le
bruit du « velcro » constants et précoces
• Hippocratisme digital présent dans près de
50% des cas.
Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et
explorations respiratoires
Examen clinique
Examens biologiques
Explorations respiratoires
Explorations respiratoires
Gazométrie arterielle
Hypocapnie au repos:
plus fréquente et plus
précoce.
Test de marche de 6
minutes
Selon Cottin, moyen
fiable pour évaluer
la fonction
respiratoire au cours
de l’exercice.
Exploration fonctionnelle
respiratoire
Selon les recommandations de la
Société Française de
Pneumologie:
il faut évaluer la CVF et la TLco
chez tout patient présentant une
PID au moment du diagnostic à
la recherche d’un trouble
ventilatoire restrictif et d’une
diminution de la Tlco, souvent
seules anomalies détectées lors
du diagnostic précoce de PID.
11
12. Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et
explorations respiratoires
Imagerie médicale
Radiographie standard du thorax
TDM-HR
Radiographie du thorax
Selon Brauner:
90%: diagnostic positif Images pulmonaires
anormales diffuses dont l’évolution est
supérieure à 3 mois.
10% des cas infra-radiographiques: le
diagnostic positif de PID repose sur la TDM +
LBA + EFR.
Diagnostic correct avec haute probabilité que
dans 25% des cas
Tomodensitométrie thoracique
• Place importante à toutes les étapes de prise
en charge.
• Elle permet:
• Diagnostic positif et étiologique des PID
• Surveillance évolutive et pronostique.
• Éviter le recours aux méthodes invasives de
diagnostic de PID, telles que la biopsie, et
d’éviter de ce fait le risque non négligeable de
complications.
• Certaines études ont mis en évidence un
apport contributif de la TDM dans le choix du
site de lavage en l’orientant vers les zones à
priori les plus lésées. 12
13. Le lavage broncho-alvéolaire
Outil diagnostique peu invasif d’exploration du
poumon profond.
Informations fiables sous couvert d’une
technique rigoureuse:
Endoscopie bronchique.
Analyse dans le laboratoire d’anatomie
pathologique.
Analyse de la cytologie alvéolaire normale
Corrélation avec les données radiologiques
13
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Endoscopie bronchique et
Lavage Bronchiolo-Alvéolaire
14. • Détection :
Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …)
Du matériel acellulaire anormal (lipoprotéines)
• Mise en évidence de nombreux agents
pathogènes (Pneumocystis carinii …)
• Suivi de l’évolution du processus
pathologique
• Évaluation la réponse à un traitement
14
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Acte non invasif, rapide,
peu onéreux
Entreprendre devant tout signe de
PID avant d’envisager d’autres
moyens diagnostiques plus
invasifs
Biopsie Trans-pariétale ou Trans-
bronchique
Biopsie chirurgicale
Le lavage broncho-alvéolaire
15. Réalisation et interprétation du LBA:
15
• Endoscopie bronchique
• Instillation du liquide isotonique stérile par
fraction (40-50 ml). Récupération du liquide
dans des aliquots LBA
• Pas de contre-indication.
• Complications:
Douleurs thoraciques dues au liquide résiduel
du LBA dans les alvéoles.
Pneumothorax.
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Le lavage broncho-alvéolaire
17. 17
Orientation diagnostique selon le profil cellulaire trouvéCertitude diagnostique
Les pneumopathies infectieuses
Les hémorragies intra-alvéolaires
Les lipoprotéinoses alvéolaires
Les pneumopathies chroniques à éosinophiles
Les tumeurs
Alvéolites à polynucléaires neutrophiles
Alvéolites macrophagiques
Alvéolites lymphocytaires
Alvéolites à polynucléaires éosinophiles
Immunocytochimie Cytométrie en flux
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Lavage Broncho-Alvéolaire
18. 18
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Immunocytochimie
• Détection in situ d’un antigène à l’aide d’anticorps spécifiques
• Visualisation du complexe immun à l’aide d’un marqueur morphologique:
• Plusieurs méthodes possibles Mise en évidence d’une activité enzymatique.
la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée)
disponible en grande quantité
peu couteuse
détectable par plusieurs chromogènes
couplée de façon stable à des protéines
19. 19
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Peroxydase:
Décomposition de l’H2O2
Présente de façon endogène dans
certains tissus biologiques
Signal non spécifique
Technique immuno-peroxydasique
Immunocytochimie
20. 20
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Systèmes d’amplification:
Système d’amplification polymérique:
Conjugués polymériques-HRP
anticorps de liaison
Immunocytochimie
21. 21
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Apport de l’immunocytochimie :
Diagnostic en: Oncologie, Pneumopathies
diagnostic des PID
Immunocytochimie
Confirmation d’un diagnostic
suggéré
CD1a Histiocytose X
Orientation du diagnostic devant
un profil cellulaire lymphocytaire
Marquage anti CD3/CD4/CD8
22. 22
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cytométrie en Flux
Analyse qualitative et quantitative de
multiples paramètres à l’échelon
cellulaire dans une population
hétérogène en suspension dans un
liquide.
Analyse des signaux optiques ou
physiques émis par une particule
coupant le faisceau lumineux d’un
laser.
23. 23
Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)
Cytométrie en Flux
Champ d’application très large
Hématologie
Cancérologie
Génétique
Diagnostic et suivi clinique
Typage des leucémies
Suivi du SIDA
Traitements immunosuppresseurs
Immunophénotypage des alvéolites lymphocytaires
24. Comparaison du profil en immunocytochimie et en
Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans
le lavage bronchiolo-alvéolaire.
24
Objectif
25. 32 cas d’alvéolites lymphocytaires
Sex-ratio (H/F) = 0,44
Âge moyen = 46,5 [6-68]
Tabagisme : 2 cas de sexe masculin
25
22 femmes
10 hommes
Patients et méthodes
Patients
29. 29
Cytocentrifugation
et préparation des
lames
Cytochambres maintenues contre des lames Super Frost par des cytoclips métalliques
Volume mis selon la richesse cellulaire
Cytocentrifugeuse SHANDON CYTOSPIN4
Cytocentrifugation 650 tours/min ( 10 min)
31. 31
Inclusion du culot
dans de la paraffine
Centrifugation 1500 tours/min ( 3 min)
Fixation AFA ( 3 heures)
Cassette à inclusion
Enrobage en paraffine
32. 32
Marquage
immunocytochimique
Marquage sur des étalements cytologiques frais
Marquage sur des coupes incluses en paraffines ( Cytoblocs)
Marquage immunocytochimique sur des
étalements frais ( Anticorps anti CD4)
Marquage immunocytochimique sur des
Cytoblocs ( Anticorps anti CD4)
33. 33
Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique
Étapes particulières aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs)
Déparaffinage
• 3 bains toluène ( 5 min chacun)
• Réhydratation: 3 bains d’alcool
100°, 70°, 50° ( 5 min chacun)
• Lavage à l’eau distillée
Démasquage antigénique
• Tampon citrate (pH=6)- Four à Micro-ondes – Deux
cycles : 5’ - 90°/10’ - 97°
• Rinçage à l’eau
Rompre les liaisons moléculaires crées par le fixateur
Accessibilité des sites antigéniques
Délimitation des coupes – Crayon hydrophobe
34. 34
Blocage des peroxydases
endogènes
Incubation avec le H2O2à 3%
10 minutes
Lavage avec TBS
Trois bacs de 5 minutes chacun
Incubation avec Post Primary
Block
30 minutes
Incubation avec Polymère
Peroxydase (anticorps
secondaire)
30 minutes
Immunomarquage
Anticorps primaires : anti CD3-
CD4-CD8
Chambre humide
Température ambiante
1 heure
Révélation avec le Chromogène
DAB coloration brune
Rinçage à l’eau
Lavage avec TBS
Trois bacs de 5 minutes chacun
Lavage avec TBS
Trois bacs de 5 minutes chacun
Lavage avec TBS
Trois bacs de 5 minutes chacun
Contre coloration
Hématéine de Mayer
Montage
Étapes communes aux étalements et aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs)
Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique
35. 35
Méthodes : Protocole de marquage par Cytométrie en flux
Centrifugation
1200 tours/min
10 minutes
100-200 µl de PBS au culot
CD8-FITC, CD4-PE et
CD3-PerCP-Cy5.5
20 minutes +4° à
l’abri de la lumière
Lavage 2 ml PBS
Centrifugation
1200 tours/min
10 minutes
Fixation 300 µl de
fixateur 1X ( 3g de para-
formaldéhyde dans 100
ml de PBS 1X, dilué)
Acquisition des données et
analyse des échantillons
Contrôle
100 µl LBA
Contrôle Marquage
Contrôle
Marquage
Marquage
38. Concluants Non concluants
87,5%
12,5%
Concluants Non concluants
Problèmes d’acheminements et de
conservation ?
Problèmes de fixation ?
Résultats et Discussions
Immunocytochimie sur étalements
38
39. Concluants Non concluants
58,8%
41,2%
Concluants Non concluants
Réalisée chez 17 patients (53,1%)
Autres cas Absence du culot lors de l’inclusion en paraffine
Fixation insuffisante des lames?
Mauvais séchage?
Démasquage insuffisant secondaire à
Tampon de pH inapproprié?
Résultats et Discussions
Immunocytochimie sur cytoblocs
39
41. Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Immunocytochimie
sur cytoblocs
4 cas discordants sur 8 cas
41
Immunocytochimie sur étalements
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Immunocytochimie
sur cytoblocs
CD4/CD8<1 2 2 2 6
1<CD4/CD8<1,6 0 1 0 1
CD4/CD8>1,6 0 0 1 1
Total 2 3 3 8
Coefficient de concordance
kappa = 0,7
Bonne concordance entre les
deux techniques
Même Laboratoire
Mêmes conditions d’acheminement
et de conservation
Résultats et Discussions
42. Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en
Cytométrie en flux
9 cas discordants sur 23 cas
42
Immunocytochimie sur étalements
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Cytométrie en flux
CD4/CD8<1 5 1 0 6
1<CD4/CD8<1,6 0 2 1 3
CD4/CD8>1,6 2 5 7 14
Total 7 8 8 23
Coefficient de concordance kappa = 0,34
Reproductibilité médiocre entre les deux
techniques
Résultats et Discussions
43. Comparaison entre Immunocytochimie sur cytoblocs et en Cytométrie
en flux
2 cas discordants sur 5 cas
43
Immunocytochimie sur cytoblocs
Total
CD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6
Cytométrie en flux
CD4/CD8<1 2 0 0 2
1<CD4/CD8<1,6 1 0 0 1
CD4/CD8>1,6 1 0 1 2
Total 4 0 1 5
Coefficient de concordance kappa = 0,3
Reproductibilité médiocre entre les deux
techniques
Résultats et Discussions
44. • Mauvaise reproductibilité entre Immunocytochimie et Cytométrie en flux:
• Comparables à plusieurs études:
Comptage lymphocytaire par immunocytochimie fait sur un nombre bien limité de
cellules (maximum de 400 éléments).
Fiabilité des résultats dépend fortement de l’expérience de l’observateur.
Signal non spécifique détecté sur les PNN peut donner lieu à une fausse interprétation
Cytométrie en flux plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les
cellules.
44
Résultats et Discussions
45. Selon d’autres études
l’immunocytochimie énumère plus
de cellules que l’analyse par
cytométrie en flux même si le LBA est
hypo-cellulaire.
« La cytométrie en flux ne peut être
aussi sensible que l’œil humain avec
un microscope dans la détection
d’une cellule légèrement colorée ».
45
Résultats et Discussions
Autres études
Bonne reproductibilité entre ces deux
techniques.
Pourtant, les auteurs ont préféré la
cytométrie en flux par rapport à
l’immunocytochimie vu qu’elle nécessite
beaucoup moins de temps (4 heures
pour l’immunocytochimie vs. 40 min
pour la cytométrie en flux dans notre
étude).
46. un opérateur expérimenté
Conclusion et Perspectives
Conclusions
• Deux techniques comparées non réalisées dans les
mêmes conditions expérimentales
• Cas discordants non corrélés aux diagnostics cliniques
retenus
Perspectives
• Réaliser les 2 techniques dans
notre laboratoire
• Consulter les dossiers médicaux
pour les cas discordants afin
d’évaluer la justesse des
résultats
46
un matériel de très
bonne qualité avec
une préservation
cellulaire optimale
Fiabilité dépend de plusieurs facteurs
Madame la présidente,
Mesdames et messieurs, les membres du Jury,
Je tiens pour commencer à vous adresser mes sincères remerciements pour votre lecture, votre présence aujourd’hui et les remarques qui viendront enrichir ce travail que j’aurais plaisir à discuter avec vous.
Et j’aimerais remercier aussi tous ceux qui m’ont fait l’amitié de venir aujourd’hui, chère famille et chers amis.
Chers auditoires vous êtes les bienvenus.
L’intitulé de notre projet est la comparaison des profils des alvéolites lymphocytaires en immunocytochimie et en Cytométrie en flux dans le lavage broncho-alvéolaire.
Au cours de cet exposé, on va introduire en premier lieu les pneumopathies interstitielles diffuses, ensuite, on va entamer l’objectif de notre travail tout en précisant les méthodes utilisées ainsi que l’échantillon étudiée. Par la suite, on va aborder les résultats et les discussions et on finit cette présentation par une conclusion.
Tout d’abord et afin d’appréhender ce sujet, il fallait mettre l’accent sur les PID qui représentent un groupe hétérogène de pathologie pulmonaire diffuses dont la caractéristique histologique est l’atteinte de l’Interstitium pulmonaire c’est-à-dire, les espaces entre les cellules alvéolaires et les membranes basales endothéliales par de l’inflammation et de la fibrose. Néanmoins, d’autres structures peuvent être affectées comme les lumières alvéolaires, les bronchioles, les vaisseaux.
Les PID sont ainsi classées en :
PID de cause connue comme Collagénose, Pneumoconiose, PM
Les PID de cause inconnue mais représentant des entités bien déterminées, également les granulomatoses tels que la sarcoïdose, l’alvéolite allergique, l’Histiocytose.
Et d’autre part les PID idiopathiques qui font l’objet d’une classification multidisciplinaire par les sociétés américaine thoracique et européenne respiratoires en 2002 et ont regroupé 7 entités la plus fréquente est la fibrose pulmonaire idiopathique (UIP).
Par ailleurs, une révision de la classification de 2002 a été proposée en 2012 par l’ATS et l’ERS. Les PID idiopathiques ont désormais ainsi classé en PID idiopathiques majeures, rares et inclassables.
La prévalence des PID est estimé à 67-81/100 000 avec un incidence autour de 26-32/100 000/an et l’âge moyen est compris entre 51 et 69 ans.
En Tunisie, on ne dispose pas réellement des registres épidémiologiques sur les PID. En outre, une étude a été menée dans la plupart des services de pneumologie de la capitale de 2000 à 2005 et a raporté que les PID représentent 7.2% des motifs d’hospitalisation avec un âge moyen de 50.9 ans et un sex-ratio de 0.51.
Selon cette étude, les cas symptomatiques non diagnostiqués sont dix fois plus fréquents que les cas symptomatiques.
Ce qui s’avérait difficile concernant les PID est leurs mécanismes physiopathologiques qui demeurent méconnus.
En effet plusieurs hypothèses pathogéniques ont été proposées et généralement, c’est la conséquence d’un processus inflammatoire impliquant des éléments structuraux pulmonaires.
Certaines PID sont causées par des infections, mais la majorité est le résultat d’un mécanisme immunologique, environnemental ou toxique qui provoque des lésions de l’épithélium alvéolaire, et la présence d’une prédisposition génétique à une altération du processus de réparation incite à l’installation d’une pneumopathie interstitielle.
Malgré les différences notables concernant leurs étiologies et leur évolution, les PID partagent certains aspects cliniques, radiologiques, fonctionnels et histopathologiques rendant leur démarche diagnostique souvent laborieuse.
En effet, c’est processus dynamique qui peut prendre du temps et qui peut être révisé à plusieurs stades. C’est le résultat d’une confrontation multidisciplinaire entre pneumologues, radiologues et pathologistes.
D’une manière générale, les étapes du démarche diagnostique des PID comprend en lieu l’interrogatoire et l’histoire du patient à la recherche d’une exposition professionnelle, des antécédents respiratoires et extra-respiratoires en faveur d’une connectivite et qui peuvent être observés et doivent prises en considération afin de mieux guider le diagnostic.
En deuxième lieu, un examen clinique doit être réalisé avec une exploration respiratoire fonctionnelle qui objective un trouble ventilatoire obstructif et des examens biologiques sont demandés à la recherche par exemple d’un syndrome inflammatoire (CRP, VS, fibrinogène).
L’étape qui suive est l’imagerie médicale qui comprend la radiographie standards du thorax qui donne une vision globale de l’atteinte parenchymateuse dans 90% des cas, et la TDM-HR en coupes fines qui est considérée comme l »examen de référence pour confirmer le diagnostic d’une PID. Elle permet une description détaillée des lésions élémentaires et de leur distribution topographiques.
En dernier lieu, et selon les nouvelles recommandations de l’ATS et de l’ERS, devant toute PID confirmé radiologiquement, il est recommandé de continuer le diagnostic par un LBA au cours d’une endoscopie bronchique.
En effet, le LBA présente un Outil diagnostique peu invasif d’exploration du poumon profond. Les Informations qu’il fournit fiables sous couvert d’une technique rigoureuse tant au niveau de sa réalisation au cours de la Fibroscopie bronchique que dans son Analyse dans le laboratoire d’anatomie pathologique.
Il convient tout d’abord de noter que le LBA permet une analyse de la cytologie alvéolaire normale.
D’autre part il est important de corréler les données du LBA aux aspects radiologiques, il permet en effet d’accéder facilement à une analyse plus fine des processus pathologiques mis en cause.
A la lumière de ce critère, le LBA permet la Détection Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …) ou Du matériel acellulaire anormal (lipoprotéines) ainsi que la Mise en évidence de nombreux agents pathogènes (Pneumocystis carinii …). C’est un outil très pratique pour le Suivi de l’évolution du processus pathologique ou pour Évaluer la réponse à un traitement.
Donc, étant donné qu’il s’agit d’un Acte non invasif, rapide, peu onéreux, il est tout à fait justifié de l’Entreprendre devant tout signe de PID avant d’envisager d’autres moyens diagnostiques plus invasifs tels que Biopsie Trans-pariétale ou Trans-bronchique et la Biopsie chirurgicale qui représente beaucoup plus des complications …
En règle générale, le LBA est réalisé au cours d’une endoscopie bronchique où on instille un volume de 100 à 300 ml de sérum physiologique par des fractions. Cette technique ne présente pratiquement pas de contre-indication et les complications les plus fréquentes sont une aggravation de l’hypoxémie du au liquide résiduel du LBA dans les alvéoles et plus rarement un pneumothorax.
Par ailleurs l’analyse cytologique du LBA comprendra une description macroscopique et microscopique. Chez un sujet adulte, sain, non-fumeur, l’interprétation du LBA est comme suit : (tableau)
Pour conclure nos propos, nous tenons à souligner que le LBA possède une excellente valeur de certitude diagnostique pour Les pneumopathies infectieuses, Les hémorragies intra-alvéolaires par la coloration de PERLS, Les lipoprotéinoses alvéolaires, Les pneumopathies chroniques à éosinophiles et accessoirement Les tumeurs plus spécifiquement les adénocarcinomes.
Et le plus souvent, il n’a qu’une valeur d’orientation diagnostique selon le profil cellulaire trouvé : Alvéolites à polynucléaires éosinophiles, à polynucléaires neutrophiles, macrophagiques et les Alvéolites lymphocytaires qui font l’objet de notre travail de recherche.
Par ailleurs, il est recommandé de continuer l’analyse du LBA devant toute alvéolite lymphocytaire par un marquage CD3/CD4/CD8 soit en immunocytochimie soit en Cytométrie en flux.
Donc il convient tout d’abord de noter que l’immunocytochimie est une technique qui permet la détection in situ d’un antigène à l’aide d’un anticorps de reconnaissance spécifique.
La visualisation du complexe immun doit être réalisée à l’aide d’un marqueur morphologique. Plusieurs méthodes sont possibles et la plus utilisée en anatomie pathologique est la mise en évidence d’une activité enzymatique, La plus communément utilisée est la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée) car elle est disponible en grande quantité, peu couteuse, détectable par plusieurs chromogènes et couplée de façon stable à des protéines.
Il est intéressant donc de souligner que les peroxydases permettent la décomposition de l’eau oxygénée et cette activité peut être présente dans certains tissus biologiques et peut donc donner un signal non spécifique lors de la révélation du complexe immun. Il est nécessaire alors de l’inhiber par une incubation des étalements dans le H2O2 avant le marquage immunocytochimique.
Revenons maintenant à la technique immuno-peroxydasique qui peut être soit directe où l’AC primaire est directement couplé à la peroxydase, soit indirecte où l’AC primaire est détecté par un second anticorps couplé à la peroxydase.
Et en vue d’augmenter la sensibilité des techniques immunocytochimiques, de nombreux systèmes de détection utilise cet enzyme couplées à des molécules amplificatrices apparaissent. Parmi ces systèmes d’amplification, on distingue le système d’amplification polymérique qui utilise des conjuguées polymériques HRP- anticorps de liaison. Les polymères sont composés d’un squelette de Dextran, molécule inerte sur lequel des anticorps secondaires et des marqueurs (les peroxydases) sont fixés
Et par conséquent, plusieurs problèmes de marquage faible ou non spécifique ne se posent plus avec une amplification du signal d’où une augmentation de la sensibilité du technique immunocytochimique.
A la lumière de ce critère, l’immunocytochimie présente alors un grand apport pour le diagnostic dans des différents domaines tels qu’en oncologie, en pneumologie et plus particulièrement dans le diagnostic de certains PID soit pour confirmer un diagnostic suggéré per exemple le marquage anti CD1a en cas de suspicion d’une Histiocytose X, soit pour aider à orienter le diagnostic devant un profil cellulaire lymphocytaire par un marquage anti CD3/CD4/CD8.
La deuxième technique utilisée dans notre étude est la Cytométrie en flux qui représente une technologie permettant la mesure et l’analyse, qualitative et quantitative, de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en suspension dans un liquide. Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser
En ce concerne leur Principe, la Cytométrie en flux est composée de 3 systèmes liés entre eux :
le système fluidique : introduit et positionne les cellules à analyser,
le système optique : les lasers comme source de lumière et les filtres optiques qui séparent la lumière émise par la cellule et la dirigent vers les détecteurs
le système électronique : convertir les signaux optiques en signaux électroniques analysables par l’ordinateur
Donc d’une façon plus générale, cette technologie entame un champ d’application très larges dans des disciplines très variés telles que l’hématologie, la cancérologie et la génétique. Elle est de plus en plus utilisée dans le diagnostic et le suivi clinique de nombreuses pathologies comme le typage des leucémies suivi du sida ou des traitements immunosuppresseurs et plus particulièrement dans l’immunophénotypage des alvéolites lymphocytaires.
Ces points nous amène à l’objectif de notre travail qui est la Comparaison du profil en immunocytochimie et en Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans le lavage broncho-alvéolaire.
Pour ce faire, on colligé 32 cas d’alvéolites lymphocytaires renfermant 22 femmes et 10 hommes avec un sex-ratio de l’ordre de 0.44 et un âge moyen de 46.5 ans et on a rapporté seulement 2 cas de sexe masculin tabagique
En général, on a rapporté que 75% de nos patients ne présentaient pas d’antécédents respiratoires et que le signe clinique le plus fréquent est la toux avec 66% ainsi que le diagnostic rx clinique le plus suspecté était la sarcoïdose avec 53%.
En ce qui concerne les méthodes, on a effectué en premier lieu une analyse cytologique du LBA suivie d’un marquage immunocytochimique et un immunophénotypage par Cytométrie en flux et on a calculé le coefficient de concordance kappa afin d’évaluer la reproductibilité des différents techniques.
En premier lieu, l’analyse cytologique du LBA comprend une étude macroscopique également l’aspect du liquide et le volume récupéré et une étude microscopique incluant :
L’évaluation de la richesse ainsi que la vitalité cellulaire
suivie d’une centrifugation et préparation des lames
pour les trois colorations standards : le MGG pour évaluer la formule cellulaire, le Perls à la recherche d’une éventuelle hémorragie alvéolaire et le Papanicolaou à la recherche des cellules néoplasiques et on peut l’utiliser aussi pour évaluer la formule cellulaire.
L’étape qui suit est l’inclusion du culot dans de la paraffine et la préparation des Cytoblocs pour le marquage immunocytochimique
En deuxième lieu, la technique immunocytochimique renferme un marquage sur des Cytoblocs qui englobe des étapes particulières par rapport à la deuxième méthode qui utilise des étalements cytologiques frais.
En ce qui regarde les coupes sur Cytoblocs, un déparaffinage suivi d’un démasquage antigénique a été pratiqué avant d’attaquer les étapes de marquage immunocytochimiques.
Dans le même ordre d’idée, les coupes sur Cytoblocs et les étalements frais ont été délimité par un crayon hydrophobe
par la suite elles ont subi les étapes suivantes :
Une incubation avec le H2O2 pendant 10 minutes
Un Marquage par les anticorps primaires anti CD3/CD4/CD8 pendant 1 heure
Une incubation avec le post Primary block et le polymère peroxydase pendant 30 minutes chacun
Après une révélation par le chromogène DAB a été effectué suivie d’une contre coloration et montage.
Ainsi, le protocole de marquage par Cytométrie en flux consiste à un marquage par des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes ; CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5 du liquide de LBA suivi d’une acquisition des données par un Cytométre BD FACSCANTO et une analyse des sous populations lymphocytaires trouvées.
On va attaquer par la suite la partie résultats et discussions
Notre analyse cytologique du LBA a rapporté que :
72% des cas ont un aspect opalescent du liquide du LBA avec un volume total récupéré entre 27 et 163 ml et une vitalité cellulaire de 58% ainsi qu’une Hypercellularité a été marquée dans 69% des cas.
Quant à la formule cellulaire, elle était lymphocytaire dans toute notre série d’étude avec une moyenne de 45%.
Le marquage immunocytochimique sur étalements était non concluant dans 12.5% des cas. Ce fait pourrait être expliqué par :
Des problèmes d’acheminement et de conservation du liquide de lavage qui sont tributaires des services cliniques. D’autre part, l’étalement frais de liquide du LBA même après un séchage minimum de 3-4 heures n’est pas suffisant pour la fixation des cellules ce qui induit un marquage faible ou non concluant.
D’autre part, la technique immunocytochimique sur des Cytoblocs a été réalisée chez 17 patients en raison d’absence du culot lors de l’inclusion en paraffine pour le reste des cas, et elle était non concluante dans 41.2% des cas. Ceci pourrait être lié à une fixation insuffisante des lames ou à un démasquage insuffisant secondaire à un tampon de pH inapproprié.
En ce qui concerne la Cytométrie en flux, elle était non concluante dans 25% des cas. Ces résultats non interprétables peuvent être expliqués par une faible viabilité cellulaire ou une hypo-Cellularité du liquide de LBA. Sur ce point, la Cytométrie en flux nécessite une suspension Hypercellulaire pour avoir un nuage des cellules représentatif et concluant.
Selon nos résultats, on a trouvé une bonne reproductibilité entre l’immunocytochimie sur étalement et sur Cytoblocs dans l’analyse des sous populations lymphocytaires CD3+, CD4+ et CD8+ avec un coefficient kappa de 0.7 , cette résultat peut être expliquée par le fait que ces deux techniques ont été pratiqué dans le même laboratoire avec les mêmes conditions d’acheminements et de conservations.
En revanche, la corrélation entre l’immunocytochimie (sur Cytoblocs et sur étalements) et la Cytométrie en flux était médiocre avec un coefficient kappa de 0.3, ces résultats sont comparables à ceux rapporté par plusieurs auteurs qui ont expliqué cette reproductibilité médiocre par le fait que l’analyse immunocytochimique est fait sur un nombre bien limité des cellules et que la fiabilité des résultats dépend éventuellement de l’expérience de l’observateur, d’autre part ils ont approuvé que la Cytométrie en flux est plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les cellules, c’est pourquoi l’immunocytochimie parait avoir un grand intérêt dans la mise en évidence d’antigènes fortement exprimés au niveau cellulaire.
A l’opposé de ce qui précède, certains auteurs trouvent que l’immunocytochimie est plus sensible dans la numération cellulaire du LBA même avec une hypocellularité. Selon eux « La Cytométrie en flux ne peut être aussi sensible que l’œil humain avec un microscope dans la détection d’une cellule légèrement colorée ».
Dans un autre ordre d’idées, certaines études ont rapporté une bonne reproductibilité entre ces deux techniques et pourtant ils ont préféré la Cytométrie en flux par rapport à l’immunocytochimie vue qu’elle nécessite beaucoup moins du temps.
Avant de conclure cette présentation, on va soulever les points qui nous apparaissent comme des limites de notre travail et qui s’exposent selon nous le plus à la critique. En effet, pour notre part la reproductibilité médiocre entre les deux techniques peuvent être expliqué par le fait que ces deux procédures ont étaient pratiqués dans deux laboratoires différentes avec des différents conditions d’acheminement et de conservation. D’autre part, la discordance des résultats dans certains cas peut être expliquée en corrélant ces résultats avec les données cliniques afin d’étudier la justesse des deux techniques ainsi que leur fiabilité.
Madame la présidente, mesdames et messieurs les membres de jury, je vous remercie de votre écoute attentive. Comme je tiens également à remercier les personnes présentes dans la salle pour leur participation. Je serai ravie de répondre à vos questions et à différentes suggestions que vous voudrez bien m’adresser.