Criptococosis: Micosis causada por Cryptococcus

Definición:Definición:
Micosis de curso agudo, subagudo o crónico
causada por un hongo levaduriforme oportunista
denominado Cryptococcus neoformans.
Afecta inicialmente los pulmones y
posteriormente se disemina a piel y vísceras con
una clara predilección hacia el SNC

San
levadura encapsulada
lesión
Cutter
Establece la prioridad del
clínicos
Demuestra su asociación con
y F.Chung
1884 Felice Aisla del jugo de durazno una Saccharomyces neoformans
1884 Busse y
Buschke
Aislan el mismo hongo de una Saccharomyces hominis
1901 Vuilleman Transfiere la levadura al género
Cryptococcus
1916 Stoddan y Describen los primeros casos Torula histolitica
1935 Benham Establece las diferencias con
Blastomicosis
1952 Lodde
nombre
Cryptococcus neoformans
1955 Emmons
las excretas de palomas
1975 Kwong- Describe los estados perfectos Filobasidiella neoformans
bacillispora

Sida.- Susceptibilidad del 5-10% en países
desarrollados hasta 20- 30% en Africa y Tailandia
1991 New York > 1200 casos
meningitis.Desde 1989 Conferencia Internacional C/ 3
años. Solo en EU más de 15 grupos de trabajo.
Es la segunda micosis mas comun en personas
infectadas con VIH
Antes 1981.- Enfermedad rara. Solo casos
esporádicos.

• 45% Sistema Nervioso Central
• 39% Limita a los pulmones,
• 31% Cryptococemia,
• 4% Cryptococemia sola
• Masculino / femenino% 64:36

C.neoformans var gattii
C. gattii
C. neoformans
COMPLEJO
con 2
ESPECIES

Caracteristicas C, neoformans
var. neoformans
C. neoformans
var. gattii
Distribución
Fuente ambiental
Cápsula
Serotipos
Estado perfecto
Agar CGB
Prevalencia Sida
Asimilación D-
Prolina
Mundial
Excreta aves*
Sí
A,D, y AD
F. n. var neoformans
No crecimiento
Común
No
Tropical y Subtropical*
Eucalyptus
Sí
B y C
F. n. var bacillispora
Crecimiento
Rara
Sí

Distribución de los
Aislamientos clínicos
Frecuencia de Serotipos
(%)
A D B C
Pacientes no SIDA:
E.U.(excepto California)
California
Mundial(clima templado)
Mundial(clima tropical)
Pacientes SIDA
Mundial (excepto Francia)
Francia
>80
>40
50-95
30-45
99
80
4
<1
3-70
<1
<1
17
4
37
5
55
<1
0
2
14
1
<15
<1
0

C. neoformans es un organismo de vida libre
¿Cómo ha desarrollado sus mecanismos
de virulencia y su potencial patógeno para
sobrevivir a un parasitismo accidental?


Leucemias

Linfomas

Sarcomas

Enfermedad de Hodgkin

Tratamientos con esteroides

SIDA más del 90% de los casos en
la actualidad.

PulmonarPulmonar
MeningitisMeningitis
Del SNC MeningoencefalitisDel SNC Meningoencefalitis
CriptococomasCriptococomas
Cutánea PrimariaCutánea Primaria
SecundariaSecundaria
ÓseaÓsea
DiseminadaDiseminada

Manifestaciones cutáneas de la criptococosis
sistémica
Pápulas de tipo molusco contagioso
Pápulas acneiformes
Vesículas de aspecto herpetiforme
Pústulas
Lesiones de tipo piodermia gangrenosa
Nódulos subcutáneos con/sin ulceración
Placas eritematosas de tipo erisipeloide o celulitis
Úlceras tórpidas, fístulas (¿osteomielitis
subyacente?)
Abscesos, que no suelen ser fluctuantes
Pápulas purpúricas de aspecto vasculítico
Úlcera genital (buscar al criptococo en la orina)
Pápulas de tipo molusco contagioso
Pápulas acneiformes
Vesículas de aspecto herpetiforme
Pústulas
Lesiones de tipo piodermia gangrenosa
Nódulos subcutáneos con/sin ulceración
Placas eritematosas de tipo erisipeloide o celulitis
Úlceras tórpidas, fístulas (¿osteomielitis
subyacente?)
Abscesos, que no suelen ser fluctuantes
Pápulas purpúricas de aspecto vasculítico
Úlcera genital (buscar al criptococo en la orina)

• No es única para los receptores de trasplante
• Sospechoso en pacientes con celulitis que no
responden al tratamiento antibiótico convencional
• Sitios de participación incluyen extremidad inferior
bilateral, el muslo y la extremidad superior. Las
lesiones ulcerosas son comunes.
• El diagnóstico es sencillo:
• piel biopsia,
• antigeno de cryptococos positivo en suero

Lesiones cutáneas nodulares subcutáneas
Ausencia de adenopatía regional sugiere
criptococosis sistémica
Presencia de lesiones cutáneas múltiples
Lesiones cutáneas únicas en áreas
corporales cubiertas de ropa
Presencia de signos de afectación visceral
Datos clínicos que sugieren criptococosis
visceral

• Pulmonar:
Manifestaciones clínicas y radiológicas:Manifestaciones clínicas y radiológicas:
•Son inespecíficasSon inespecíficas
•80% no desarrollan síntomas80% no desarrollan síntomas
•Lesiones nodularesLesiones nodulares
Puerta de entradaPuerta de entrada
Etapa temprana vidaEtapa temprana vida
ReactivaciónReactivación

•
Pulmonar:
Inmunodeprimidos:
•Rápida diseminación SNCRápida diseminación SNC
•Casos fulminatesCasos fulminates
•Más frecuentes infiltradosMás frecuentes infiltrados
Alveolares e intersticialesAlveolares e intersticiales

Es la más frecuente. Se origina aEs la más frecuente. Se origina a
partir de un foco pulmonar .partir de un foco pulmonar .
• Sistema Nervioso Central:

Criptococoisis del sistema nervioso central
Los síntomas : cefalea frontal intermitente, aumenta de
intensidad
Vomito,
Vahído,
Vértigo, y
Rigidez y dolor del cuello.
Trastornos mentales con depresión, desorientación, apatía,
inquietud, irritabilidad, delirio.
Los signos físicos son: meningitis crónica que se
manifiesta con :
rigidez en la nuca y signos de kernig y Brudzinski
positivos.
La ambliopía en ocasiones aparece estrabismo, nistagmo,
ptosis, diplopía, Ataxia y hemiplejia
Neurorretinitis y edema papilar.
Perdida de peso y fuerzas

Las lesiones cutáneas , subcutáneas y glandulares suelen diagnosticarse
por biopsia y cultivos sistemáticos.
Necesario para el diagnostico diferencial con linfoblastoma
Lesiones pulmonares : tuberculosis
actinomicosis
blastomicosis
coccidioidomicosis
candidiasis
Crytococosis del sistema nervioso central – meningitis
encefalitis
tumor cerebral
absceso del cerebro
psicosis demencial
demencia paralítica

SUERO
Y LCR
ORINA
AntígenosAntígenos
AnticuerposAnticuerpos
(aglutinación de partículas de
látex)
(aglutinación de partículas de
látex)
(anticuerpos fluorescentes
indirectos)
(anticuerpos fluorescentes
indirectos)
Positivos
en 77 a
99%
Positivos
en 77 a
99%
 Fijación de complemento
 ELISA

LCR ALTERACIONE
S SON LEVES
•Incremento de la presión
•Leucocitosis predominante linfocitaria
•Aumento de proteínas
•Hipoglucorraquia
Tinta
china
Es positiva 50%
Aglutinación
en látex
Es positiva 90%

1. Toma de muestras: Depende de la variedad clínica
(esputos, LBA, LCR, exudados, biopsias).
2. Examen directo con Tinta China: El objetivo es resaltar la
cápsula. Se observan células levaduriformes redondeadas
rodeadas por una cápsula que puede variar en grosor. Es
importante buscar levaduras gemantes.

Los cambios histologicos puede ser de
dos tipos, y ambas pueden hallarse en la
misma muestra.
La reacción gelatinosa se caracteriza
por la abundancia de esporas y la escasa
reacción inflamatoria acompañante.
La reacción granulomatosa, se
caracteriza por un número escaso de
organismos distribuídos en el seno de
zonas de dermis necrótica, rodeadas de
una empalizada de células epitelioides y
multinucleadas
Granuloma con necrosis central
rodeada de células epiteloides y
linfocitos.
Granuloma con necrosis central
rodeada de células epiteloides y
linfocitos.
Las blastoconidias de C. neoformans
son redondas u ovoidales y miden entre
2 y 12 um en función del tamaño de la
cápsula celular
El grosor de la cápsula es tanto mayor
cuanto menor es la reacción
inflamatoria circundante.
Tinción PAS en la que se aprecian estructuras
redondeadas Eosinófilas correspondientes a C.

Cryptococcus en LCR
Test de tinta china

3. Cultivo: Colonias limitadas, mucoides, convexas, blanco
amarillentas.
Medios de cultivo:
ADS
Extracto de levadura
Agar BHI
nunca usar Micosel.
•Medios diferenciales con sustratos fenólicos
Agar ácido caféico
Staib
AESG
Agar semillas de Niger
Colonias
color café

 Tubo germinativo
 Filamentación
 Crecimiento a 37ºC
4. Pruebas morfolológicas y fisiológicas:

Crecimiento en agar CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol), útil para
diferenciar a los agentes etiológicos de la criptococosis: C. neoformans (Cn) y C. gattii
(Cg).

5. Identificación bioquímica:
• Producción de ureasaProducción de ureasa
• Asimilación de azúcares (lactosa e inositol)Asimilación de azúcares (lactosa e inositol)
• Fermentación de azúcaresFermentación de azúcares

 Criptococosis
 La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y
especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis criptocócica.
 Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez técnica y
especificidad de la prueba.
 Permite el diagnóstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99%
de las meningitis criptocócicas y el 67% de las criptococosis
diseminadas.
 El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios días.
 Se utilizan dos tipos de técnicas, una cualitativa y otra cuantitativa.
 La técnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de
criptococosis o para confirmar reinfección especialmente en el sida.

 La técnica consiste en la detección de antígeno capsular
criptocócico mediante anticuerpos monoespecíficos dirigidos frente
a él y unidos a partículas de látex. La aglutinación de las partículas
de látex tras la reacción antígeno-anticuerpo se detecta a simple
vista..
 La técnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimiento
 de la evolución de pacientes ya diagnosticados mediante el título de
antígeno capsular presente en la muestra clínica, que generalmente
es suero o LCR.
 Es útil para conocer la eficacia del tratamiento antifúngico aplicado.

 FUNDAMENTO
 Consiste en la precipitación de particulas de latex sensibilizadas
con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C. neoformans en
muestras de LCR, suero y orina.
 Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de
pacientes con criptococosis meníngea.
 El limite de detección es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .
 Una reaccion negativa no descarta infección.
 La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento
progresivo de titulo es de mal pronostico.
 Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o
mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.
 Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clínicos con
pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion es
separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor
reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la sensibilidad
de la prueba.

 LECTURA DE RESULTADOS
 La lectura es visual y se debe realizarse de la siguiente
manera:
 Negativo: suspensión granular muy fina con
ausencia de aglutinación
 Positivo +: suspensión con escasos grumos contra un
fondo homogeneo lechoso.
 Positivo ++: suspensión con escasos a moderados
grumos contra un fondo moderamente homogeneo.
 Positivo +++: suspensión con moderados a abundantes
grumos contra un fondo claro.
 Positivo ++++: suspensión con abundantes grumos
contra un fondo totalmente claro

CRYPTOCOCOSISCRYPTOCOCOSIS LATEXLATEX

 Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar
titulaciones para el seguimiento de tratamientos.
 Las diluciones recomendadas son:
◦ positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2;
◦ positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100
 Posteriormente para muestras seriadas del mismo
paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.
 El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion
de la aglutinación.
 Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de
tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo
equipo para evita variaciones.

La sensibilidad varía entre el 93% y el 100% con un 93-98% de
especificidad.
Puede haber falsos positivos:
Presencia de factor reumatoide
Pacientes con lupus
Pacientes con sarcoidosis,
Arrastre medio de cultivo de agar chocolate,
Asas de platino o desinfectantes.
Infección sistémica por Trichosporon ashaii
Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o
2-mercaptoetanol.

6. Serología:
• IFI (detección de Ac)IFI (detección de Ac)
• Aglutinación al Látex (detección de Ag)Aglutinación al Látex (detección de Ag)
• ELISAELISA

Es una infección micótica primaria o secundaria causada por miembros del
género Candida.
Las manifestaciones clínicas pueden ser aguda, subaguda o crónica a
episódica.
Participación puede estar localizado en la boca, garganta, piel, cuero
cabelludo, la vagina, los dedos, las uñas, los bronquios, pulmones, o el tracto
gastrointestinal, o convertirse en sistémica como en la septicemia,
endocarditis y meningitis.
Distribución: En todo el mundo.
Agentes etiológicos: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei. C.
parapsilosis, C. guilliermondii y C. pseudotropicalis.
Todos están en todas partes y se producen de forma natural en los seres
humanos.

Cutaneas:
Localizadaas: grandes pliegues, interdigitales y uñas
Difusas: amplias superficiales
Profundas: granulomas candidiasicos
Mucocutaneas:
Mucosa oral: muguet, queilitis, glositis
Mucosa genital: vaginitis, balanitis
Mucosa digestiva: esofagitis, enteritis
Mucosa respiratoria: bronquial , pulmonar

Localizadas
Sistema nervioso central
Endocarditis
Tracto urinario
Artritis y osteitis
Peritoneo, higado, bazo y vesicula biliar
Diseminadas
Candidiasis diseminada cronica o hepatoesplenica
Candidiasis diseminada aguda

CUANDO DEBE SER CONSIDERADA UNA
LEVADURA PRODUCTORA DE UNA MICOSIS
Se debe establecer si la levadura aislada está causando infección,
esta colonizando o es sola una contaminación.
Es necesario una correlación entre el examen directo y el
aislamiento de la levadura.
C. neoformans. Tinta china positiva o recuperada de cultivo es
significativo.
C. albicans aisladas de esputos o de orina (chorro del medio), rara
vez patógena.
En pacientes inmunosuprimidos las levaduras aisladas de sitios
estériles es indicativo de infección diseminada con probable
fungemía

El diagnóstico se refuerza si en el examen directo o
coloraciones se observan pseudohifas (p/micelio) o
blastosporas (b/conidias) aisladas o gemantes.
Hemocultivos positivos (25-50%) pueden indicar:
Candidemia transitoria debida a colonización de
catéteres.
Candidemia profunda o una invasiva
Hemocultivos negativos no descarta fungemia

Aumento de pacientes imunocomprometidos
Mayor utilizacion de procedimientos medicos
invasivos
Mayor uso de fluconazol
Sobrevida de pacientes críticos
Mejoramiento de recursos diagnósticos

RICHARDS et al.
(EUA)
1993
1o
S. coag. neg.
2º
Enterobacterias
3o
S. aureus
4o
Candida sp
5o
Enterococcus sp.
6º
Outras
Variáveis
AUTOR
Ano
AGENTES
Séries
VINCENT et al.
(EUROPA)
1995
1ºE
nterobacterias
2o
S. aureus
3o
P. aeruginosa
4o
S. coag. neg.
5o
Candida sp.
6o
Outras
PFALLER et al.
(EUA)
1999
1o
S. coag. neg.
2o
S. aureus
3o
Enterococcus sp
4o
Candida sp
5o
Outras

Leucemia agLeucemia ag
TransplantesTransplantes
QuemadosQuemados
Cirugia GICirugia GI
PrematurosPrematuros
Alto riesgoAlto riesgo
Total - admisiones
Factor de riesgoFactor de riesgo
Antibioticos 1.7Antibioticos 1.7
Cateter IVCateter IV 7.27.2
ColonizacionColonizacion
CandidaCandida 10.410.4
HemodialisisHemodialisis 10.410.4
Óbito p/Óbito p/
candidíasiscandidíasis
Óbito p/Óbito p/
enfermedaenfermeda
de basede base
Candidemia
Candidemia hospitalariaCandidemia hospitalaria
Indicadores de gravedadIndicadores de gravedad
Wenzel.Wenzel. Clin Infect Dis 1995;20:1531-4Clin Infect Dis 1995;20:1531-4.
SobrevivenSobreviven

Etiologia de la candidemia:
relevancia de las espécies “no-
albicans”

Europa (170)
53
21
12
6
4
1
3
Espécie
C. albicans
C. parapsilosis
C. glabrata
C. tropicalis
C. guilliermondii
C. krusei
Candida spp
USA (203)
56
6
19
7
1
2
6
Canadá (61)
53
23
11
8
--
2
3

• Espécies Número (%)
C. albicans 43 (42)
C. parapsilosis 22 (21,3)
C. tropicalis 25 (24,2)
C. glabrata 8 (7,7)
Outras 5 (4,8)

Predomina en candidiasis genital, oral y cutánea
(>90%).
En candidemias y enfermedad invasora continúa
siendo la causa más frecuente, pero se ha
observado una disminución del 7%-10% (1997-2005)
en su prevalencia.
También se ha notado disminución de acuerdo con el
incremento en la edad, después de la exposición a
los azoles y en las UCI

Se ha incrementado desde 1993, su frecuencia como causa
de candidemia en Norte América.
Se ubica como la segunda especie más frecuente.
La cataloga como un importante oportunista emergente con
gran potencial para desarrollar resistencia a los
antimicóticos, especialmente al fluconazol.
Se la asocia a pacientes mayores de 60 años, trasplantados
de órganos sólidos o con cáncer.
La profilaxis con fluconazol es un factor predisponente.
En latinoamerica esta especie tiene una baja incidencia (4-
6%).

Está conformado por tres especies: C. parapsilosis, C.
orthopsilosis y C. metapsilosis.
El complejo es considerado patógeno exógeno y se encuentra
como colonizador transitorio de piel-uñas y, ocasionalmente, de
mucosas.
Se asocia a infecciones adquiridas a través de las manos y de
los ambientes hospitalarios e, igualmente, también con nutrición
parenteral, cirugías recientes que requieran catéteres
intravenosos y uso de caspofungina en pacientes con trasplante
de células madre.
En Latinoamérica esta especie está distribuida en todos los
rangos de edad, incluyendo neonatos, grupo que es el más
frecuentemente afectado por esta especie en Norteamérica y
otras regiones del mundo

Es considerada una causa importante de candidiasis
invasora en pacientes con cáncer, especialmente con
leucemia, neutropenia y en trasplante de células madre.
Se ha observado disminución de candidemias por esta
especie con el uso profiláctico de fluconazol en pacientes
con cáncer.
Esta especie disminuyó como agente de las candidemias en
Norteamérica del 10%-12% en los años noventa a 7%-8%
en el año 2000.
En América Latina y Asia, su incidencia en candidemia es
mayor del 15%.

Es una especie considerada emergente debido al uso
profiláctico con fluconazol
Está asociada a pacientes con neutropenia.
La colonización por esta especie es un predictor de
candidemia.
Se trata de un microorganismo multidrogo-resistente debido
a que tiene una resistencia intrínseca al fluconazol,
Tiene una susceptibilidad disminuida a la anfotericina y la
fluocitosina que está además, asociada a alta mortalidad
(80%-40%)

Genero Candida: mas de 163 espécies - 15 patógenas
Relevancia epidemiológica
Diversidad de susceptibilidad los antifúngicos
Base para definicion de la terapeutica
Necesidad de identificacion correcta y rápida
Importancia de la definicion de la espécie

Para un diagnóstico correcto es necesario seleccionar,
obtener y enviar la muestra adecuada.
Existen condiciones importantes para tener en cuenta, como
sigue: las muestras deben ser recolectadas asépticamente en
frasco estéril con tapa rosca y se deben enviar al laboratorio
a la menor brevedad posible.
Su recolección y transporte varían de acuerdo con el
espécimen y sitio de la infección.
Además, cada espécimen debe estar bien rotulado, debe ir
acompañado de los datos del paciente (nombre completo,
sexo, edad) y datos clínicos (factores de riesgo, tratamiento
con antibióticos o antimicóticos, sospecha clínica), examen
solicitado y nombre, dirección y otra información de contacto
del médico que lo solicita

Los aislamientos de Candida spp.
provenientes de sitios corporales no
estériles (orina, secreciones respiratorias)
presentan dificultades en su valoración
pues no permiten establecer un diagnóstico
de candidiasis invasora y aun los cultivos
cuantitativos no logran diferenciar entre
colonización e infección; no obstante,
tienen importancia como factor de riesgo.

Criterios morfológicos:
Macroscópicos:
morfología de la colonia
Microscópicos:
Presentación de las levaduras (Blastoconidias,
artrosporas y de pseudomicelios)
Producción de Clamidosporas (Bilis Agar, Agar harina
de maiz)
Tubo germinal

• Método clássico
• Métodos comerciales
Métodos disponíbles

Kreger-van Rij, 1984Kreger-van Rij, 1984

En medio líquido: Formación de sedimento, anillo o película.
En medio sólido:
Textura: cremosa, mucosa.
Color: blanco a beige; con pigmento carotenoide , naranja a rojo
(Rhodotorula sp., Sporobolomyces sp.), sin pigmento carotenoide
(Metschnikowia pulcherrima).
Superficie : lisa, rugosa, cerebriforme, etc.
Con filamentos o pseudofilamentos :
in vitro : en función del medio utilizado.
in vivo : Cándida spp. (de saprófito a patógeno).
Pseudofilamentos :
los brotes se alargan y producen cadenas ramificadas, sin separación.
Filamentos verdaderos : el brote crece continuamente.

Examen microscópico directoExamen microscópico directo
frescofresco

Artrosporas: Esporas formadas por ciertos tipos
levaduras con filamentos verdaderos. Trichosporon.
Clamidosporas: C. albicans, esporas grandes, redondas,
de pared gruesa.
Balistosporas: Sporobolomyces esporas producidas de
una protuberancia de la célula madre, son
expulsados a gran distancia.

ColoniaColonia
RugosaRugosa MucoideMucoide AnaranjadaAnaranjada
Blanca/BiegeBlanca/Biege
CremosaCremosa
SecaSeca
AchatadaAchatada
Macromorfologia en SGAMacromorfologia en SGA
CandidaCandida TrichosporonTrichosporon
GeotrichumGeotrichum
C. rugosaC. rugosa
CryptococcusCryptococcus RhodotorulaRhodotorula C. kruseiC. krusei

Aspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextroseAspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextrose

Tubo germinativoTubo germinativo
C. albicans: Formacion de tubo germinativo en blastoconídios expuestos a suero
humano o animal, luego de 2-3 h de incubacion a 37o
C

Tubo germinativoTubo germinativo
NegativoNegativo PositivoPositivo
Outras espécies deOutras espécies de
leveduralevedura
C. albicansC. albicans
C. DubliniensisC. Dubliniensis
Crece a 42ºCCrece a 42ºC

MicrocultivoMicrocultivo
Técnica de cultivo en lamina o placa de Petri sobre medio
ágar-harina de maiz con Tween 80
Estímula la formacion de pseudohifas a baja tension de O2
Visualizacion de: artroconídios, blastoconídios,
clamidoconídios, pseudohifas e hifas verdaderas
Presencia y disposicion entre 48 a 96 horas de incubacion

Examen microscópico directoExamen microscópico directo
HemocultivoHemocultivo
GiemsaGiemsa

Examen microscópico deExamen microscópico de
colonias levaduriformescolonias levaduriformes

Cryptococcus sp
Saccharomyces cerevisiae
Pichia membranifaciens Candida globosa

Saccharomyces cerevisiae

Candida krusei
Examen microscópico de
colonias levaduriformes

Trichosporon spp
Trichosporon cutaneum
Blasto-artroconidios

25ºC por25ºC por
2 a 7 días2 a 7 días
 en agar harina de maíz - Tween 80
 agar arroz - Tween 80
MicrocultivoMicrocultivo ( Dalmau, 1929 ) Estudio micromorfológico de levaduras

Pseudohifas + BlastoconídiosPseudohifas + Blastoconídios
Sin clamidoconídiosSin clamidoconídios Con clamidoconídiosCon clamidoconídios
Otras espécies deOtras espécies de
levaduralevadura
C. dubliniensisC. dubliniensis
Microcultivo:Microcultivo:

Pseudohifas, blastoconídios, Clamidoconídios
C. dubliniensisC. dubliniensis


Termotolerancia (42 - 45Termotolerancia (42 - 45oo
C)C)
C. albicansC. albicans (+)(+) C. dubliniensisC. dubliniensis (-)(-)
Caldo NaCl hipertonicoCaldo NaCl hipertonico
C. albicans (+)C. albicans (+) C. dubliniensisC. dubliniensis (-)(-)
C. albicansC. albicans C. dubliniensisC. dubliniensis
Alves SH, Milan EP et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 43:85-86, 2002.

Pseudohifas BlastoconídiosPseudohifas Blastoconídios
Sin clamidoconidiosSin clamidoconidios
CandidaCandida sppspp
Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas

Blastoconídios sin pseudohifas o c/
pseudohifas rudimentares

Microcultivo: ausencia de pseudohifa
Sin cápsula y urease (-)Sin cápsula y urease (-) Con cápsula y urease (+)Con cápsula y urease (+)
C/ ascosporasC/ ascosporas S/ ascosporasS/ ascosporas
CryptococcusCryptococcus
RhodotorulaRhodotorula
Candida glabrataCandida glabrata
PichiaPichia
HansenulaHansenula
SaccharomycesSaccharomyces

Busqueda de cápsula
Cryptococcus spp

Produccion de ureasa
Uréa de Christensen  lectura de
24-48h
Interpretacion:
Trichosporon spp  variáble
Cryptococcus spp  positivo
Candida spp  negativo (exceto C.
lipolytica e eventualmente C. krusei)

Reproduccion sexuada
Estruturas de reproduccion sexuada = ascosporos
Medios que estimulan la produccion de ascosporos
V8: 7-10 dias
Ágar extrato de malte,
ágar acetato de sódio
Inoculacion de levadura en medio de cultivo apropriado
Frotis de cultivo teñido por la técnica de ácido-
resistencia visualizacion de los ascos que se colorean de
verde
Generos: Saccharomyces, Pichia, Hansenula, etc.

ArtroconídiosArtroconídios
C/ blastoconídiosC/ blastoconídios
y ureasa (+)y ureasa (+)
S/ blastoconídiosS/ blastoconídios
y ureasa (-)y ureasa (-)
GeotrichumGeotrichumTrichosporonTrichosporon

Esquema de IdentificacionEsquema de Identificacion
Leveduras
Crescimento rápido no estimulado por lipídios
Colônias alaranjadas
Malassezia spp.
Crescimento lento estimulado por lipídios
Colônias blancas
Rhodotorula spp. Blastoconídios Artroconídios
Ascosporas (-)
Cápsula (+)
Ascosporas (+)
Urease (+) Urease (-)
Cápsula (-)
Leveduras sexuadas
Saccharomyces spp.
Pichia spp.
Candida spp.
Identificação baseada em
Assimilação
Fermentação
Cryptococcus spp
Trichosporon spp. Geotrichum spp.

Caracteres bioquímicosCaracteres bioquímicos
Permite la diferenciaccion el nível de espécie
Características metabólicas inherentes a cada
espécie de levadura
Cryptococcus
Rhodotorula
Trichosporon Geotrichum Sacharomyces
Pichia
HansenulaCandida

Asimilacion de carbohidratos (Auxanograma)
Capacidad de asimilar determinado carbohidrato como
única fuente de carbono para mantener la viabilidad celular
Medio sólido sin fuentes de carbono, con inóculo a ser
testado
Adicionarse el azúcar que se desea testar  15 azúcares
Despues incubacion (24 - 72h), la presencia de crecimento
visíble (turvidez) indica asimilacion (+)

Capacidad de utilizar determinado
azúcar para producion de energia
en baja tension de O2 con
producion de etanol y gás (CO2)
Medio basal líquido conteniendo
solucion de un azúcar + inóculo  6
azúcares
Visualizacion de la formacion de
CO2 en tubos de Durham invertidos
Lectura: 24h - 14 dias

Asimilacion de nitrogeno
Algunas levaduras poseen capacidad de asimilar nitrogeno
inorganico a forma de nitrato (lectura: 24-48h)
Medio sólido basal conteniendo fuente de C, mas sin fuente
de N + inóculo
Agreguese nitrato de potássio en el campo y peptona (control
positivo) en otro campo - presencia de crecimiento visíble
(turbidez) indica asimilacion (+)

Identificacion de las principales levaduras de interes clínico
Ph=pseudo-hifa; Gli=glicose; Sac=sacarose; Gal=D-galactose; Raf=rafnose; Xil=D-xilose;
Cel=celobiose; Tre=trealose; Dul=dulcitol; Mal=maltose; V=variáble
-
-
+
+
+
+
Mal
-+-----+Ph (-)C.glabrata
-------+
Ph/blastoc.
alongadosC. krusei
++++++++
Ph finas
Blastocon.C. guilliermondii
-+-+-+++
Ph curvas/
células
gigantes
C. parapsilosis
-+V+-+++
Ph/Blastoc
en cadenasC. tropicalis
-+-+-+V+Clamidoc.C. albicans
DulTreCelXilRafGalSacGli
Assimilacion
MorfologiaLevaduras

Limitaciones del método clásicoLimitaciones del método clásico
Técnica laboriosa
Consumo de tiempo
Requiere profesional experimentado

Requisitos
• Padronizados
• Simples
• Rápidos
• Fácil lectura e interpretacion
• Bibliografía
• C0sto-beneficio
Métodos comercialesMétodos comerciales
Objetivos
• Facilitar el trabajo
de laboratório
• Ampliar el espectro
de diagnóstico
• Mejorar el
diagnóstico
• Identificacion precoz
• Apoyar al clínico

Crecimiento en CHROMAgar
Candida :
C. albicans (verde)
C. tropicalis (azul)
C. krusei (rosa y rugosa)
C. parapsilosis (rosácea-lisa)
Prototheca wickerhamii (crema)
CHROMAgar CandidaCHROMAgar Candida

1.Enzimáticos
Medios cromogénicos:
CHROMagar Candida®
Cromogen Albicans ®
Candida ID ®
Albicans ID2 ®
CandiSelect ®
Fluoroplate Candida ®
Agar SDCA-MUAG ®

MétodosMétodos
Vantajas
Rapidez en la identificacion de espécie o
espécies mas freduentes en la rutina
Posibilidad de aislamiento en cultivos mixtos
Facilidad de lectura y simplicidad de
procedimiento
Limitaciones
Especificidad (variáble conforme o método)
Costo (kit e leitura UV)
Necessidad de identificacion de espécies no
albicans

 Galerias API:Galerias API:
ID 32CID 32C
API 20C AUXAPI 20C AUX
 RapID Yeast PlusRapID Yeast Plus
SystemSystem
 AuxacolorAuxacolor
 Fungifast I TwinFungifast I Twin
 CandifastCandifast
Métodos manuales de identificacionMétodos manuales de identificacion::
J Med Microbiol,50:1105-10,2001; Med Mycol,37(2):11-7,1999;
J Clin Pathol,52(4):271-3,1999

ID32C
Métodos ManuaisMétodos Manuais

AUXACOLOR®
C.Neg GLU MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO.
CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. ACT. POX.

Pruebas adicionalesPruebas adicionales
CápsulaCápsula
PigmentaçãoPigmentação

Sistemas semi-
automáticos:
API 20C AUX®
Galería ID 32C®
Sistema Vitek ®

Asimilación de azúcares ID 32C (API)Asimilación de azúcares ID 32C (API)

MicroscanMicroscan
WalkAway - 40WalkAway - 40
WalkAway - 96WalkAway - 96
Vitek YBCVitek YBC
Vitek 2 ID-YSTVitek 2 ID-YST
Clin Microbiol Rev, 5(3):302-27,1992; JCM,34(10):2408-
10,1996; JCM,36(5):1197-200,1998; J Clin Pathol,52(4):271-
3,1999; JCM,37(6):1967-70,1999
Métodos automatizados deMétodos automatizados de
identificacionidentificacion

• Sistemas automáticos:
• Sistema Vitek 2 ID-YST Sistem
® (Identificación y sensibilidad)
• Sistema Biolog YT Microplate®
• Rapid Yeast Identification Panel
Micro Scan®

VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)

 Pruebas Rápidas
RapID Yeast Plus
System®Fongiscreen 4H®

 Criterios Inmunológicos:
Bichro-latex albicans® Krusei-color®

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales
manuales y automatizados para la identificacion de
levaduras
Evaluar costo x benefício antes de adotar el
método comercial
Evaluar la correlacion del sistema comercial con el
método clásico
Guardar los kits a temperatura adequada,
respetando su plazo de validez
Realizar adecuado mantenimiento del equipo
Familiarizarse com los procedimientos y patrones

Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales
manuales y automatizados para la identificacion de
leveduras
Certificarse sobre cuales espécies son identificadas por cada
método
Cuidado para obtener inóculos puros e viábles
Utilizar siempre microcultivo y otros testes adicionales.
Realizar control de calidad con organismos controle.
Conocer las espécies problema.

SUCEPTIBILIDADSUCEPTIBILIDAD
ANTIFUNGICAANTIFUNGICA
METODO DE DIFUSION EN AGAR CONMETODO DE DIFUSION EN AGAR CON
LECTURA AUTOMATIZADALECTURA AUTOMATIZADA

Presionar el hisopo contra el
borde interno del tubo para
remover el exceso de líquido
antes de inocular
Asegurese de usar hisopos de
algodón y no de dacrón.

Después de 15 mínutos de haber ajustado el inoculo cubrir el agar
completamente con el hisopo en 3 diferentes direcciones. No
presione el hisopo sobre el agar.

Deje desaparecer la humedad de la superficie del
agar antes de colocar los discos. Asegurese que cada
disco quede firme sobre el agar. Use un dispensador
de discos si es posible.

Incube los placas por 18 horas a 35°C. El crecimiento sobre el agar
debe ser uniforme, formando una capa confluente. Para C neoformans
incubación por 72 horas.

TECNOLOGIATECNOLOGIA
Sistema lector de placas mediante análisisSistema lector de placas mediante análisis
digital de imagendigital de imagen
CámaraCámara
Tarjeta de VídeoTarjeta de Vídeo
ComputadorComputador
BIOMIC®

Como realizar y leer pruebas de
difusión en Agar con BIOMIC®

 Método M27-A de los NCCLS
 Método propuesto por el EUCAST
 Métodos alternativos y comercializados
◦ Sensititre YeastOne
◦ Etest
◦ Fungitest
◦ Difusión de disco

No hay tecnología y no hay máquina que substituyan
al conocimiento, la experiencia y la sensibilidad
del ser humano.
Solo él es capaz de interpretar, analizar y juzgar
correctamente.
Armando Fonseca
Presidente - SBPC/ML

Malasseziosis: Afecciones
producidas por Malassezia

Zona del Palmar
Dermatitis seborreica Chaco- Zona del palmar

Dermatitis seborreica
la relación entre DS y Malassezia fue ya sugerida por Saboraud en 1932
Malassez en 1874 fue el primero en asociar a Malassezia con
descamaciones del cuero cabelludo
• observación del alto numero de estos agentes en los materiales obtenidos de
DS
• efectividad de los tratamientos antimicóticos
• la recolonización en los casos de recurrencia
Malassezia
considerado importante en la etiología de la DS
Actualmente

Clínicamente se presenta como descamación e
inflamación en áreas del cuerpo ricas en glándulas
sebáseas
Frente y surcos nasolabiales
pecho
espalda
oídos
también en axilas e ingle
cuero cabelludo

Las lesiones son rojizas y cubiertas de
escamas aspecto grasoso

mecanismo por el cual Malassezia puede
generar una inflamación
el debate sobre el verdadero rol patogénico continua en estudio
Malassezia
Produce fosfolipasas
Liberación de ac. araquidónico
Metabolitos involucrados en la inflamación en la piel
Individuos con DS
Mayor cantidad de
lípidos sobre la piel
DERMATITIS

CARA:
Frente, surco nasolabial,
zona de la barba

Incidencia
en inmuno-competentes
después de la pubertad
crónica con exacerbaciones frecuentes
Estados inmunológicos deprimidos
stress físico o mental
La DS infantil
generalmente remite espontáneamente
después de los 6 meses.
Raramente persiste pasado el año de vida
BAJA en personas normales

Es una forma descamativa no inflamatoria de la DS confinada al cuero
cabelludo
Caspa

La etiología de la DA es considerada como una reactividad cutánea
anormal a alergenos, con una predisposición genética
Dermatitis atópica
en lesiones de DA en zonas seborreicas
Malassezia
factor exacervador
Alergeno
barrera cutánea afectada
contacto con sistema inmune
Inflamación crónica de la piel, de etiología a veces discutida.

Dermatitis atópica
Lesiones de DA donde Malassezia se encuentra gralmente involucrada
Lesiones eczematosas, inflamativas,
descamativas y pruriginosas
en lesiones de DA en zonas seborreicas
• Cuero cabelludo
• Cara
• Cuello
• Espalda

Dermatitis atópica
Y
Malassezia
Cara y cuello
Cuello y axila
Cara y Cuero cabelludo

Produce oclusión folicular
Malassezia
Sobrecrecimiento en
el folículo piloso
Favorecido por factores externos y/o a la
reducida resistencia por parte del hospedador
productos de la levadura y a los ác.grasos libres producidos como resultado
de la actividad lipasa
Inflamación

pápulas foliculares y pequeñas pústulas (granos)
pruriginosas (erupciones tipo acné)
Presentación clínica

Pecho
Foliculitis
Espalda
Ocurre principalmente en
Pecho
Espalda
Brazos
Cara

• Calor y humedad ambiente
• Aplicación de sustancias grasas, emolientes
oleosos (aceites)
• Oclusión (impide la aireación) Uso de ropas
sintéticas
Factores favorecedores
FACTORES EXÓGENOS:
favorecen la proliferación de Malassezia
• Piel grasa
• Stress y fatiga
• Diabetes
• Tratamientos con esteriodes orales (Ej: prednisona)
• Tratamientos inmunosupresivos
• Anticonceptivos
• Elevado peso, que resulta en más sudoración y zona ocluidas.
• Antibioticoterapia oral, como tetraciclinas, eliminan la capacidad de
competición entre bacteria y levaduras saprofitas de la piel, favoreciendo el
desarrollo de estas últimas
FACTORES ENDOGENOS:

Malassezia contribuye a la inflamación
presente en las lesiones de acné.
Otras asociaciones
Acné vulgaris
La foliculitis por Malassezia puede coexistir
con casos de acné
Favorecido por el incremento
de aceite en la piel

Pacientes con acné verdadero pueden estar acompañados de Malassezia
En estos casos hay un sobrecrecimiento tanto de bacteria como de
levaduras
Se ha comprobado que la foliculitis por Malassezia a veces resulta ser la
razón de los casos de acné que no mejoran con tratamientos antibióticos
prolongados ya que ambas pueden coexistir

Asociaciones con otras afecciones superficiales
• Psoriasis
• Acne vulgaris
• Dacriocistitis
• Blefaritis seborreica
• Pustulosis neonatal
• Papilomatosis confluente y reticulada
• Onicomicosis
Ha sido comprobada la asociación de Malassezia con otras
afecciones superficiales, entre ellas:

Psoriasis
La sobre infección por Malassezia de la psoriasis pueden causar una
exacerbación
el tratamiento de ella resulta
en un
mejoramiento de la afección
Probablemente contribuye con la
inflamación asociada con esta
enfermedad.

Diagnóstico
Chaco -Zona del Palmar

Toma de muestra
KOH - NaOH
20 – 40X
+
Tinta Parker
RASPADO
Diagnóstico
Examen directo
anco de Calcofluor como método más selectivo (mejor visualización),
specialmente en DS y otras afecciones de piel

Elementos levaduriformes y micelios
Abundantes elementos levaduriformes
M. globosa
DS - DA

Abundantes elementos levaduriformes
DS - DA
M. restricta
M. obtusa

Los exámenes microscópicos directos y la histopatología muestra la presencia
de abundante Malassezia en el folículo pilosebaseo.
Malassezia en folículo piloso
Foliculitis - acne vulgaris

Cultivo
No de rutina
Requiere de ácidos grasos para su desarrollo
Medios de cultivos especiales
Medio de Dixon modificado
Medio de Leeming y Notman
Medio de Sabouraud + aceite de oliva
• poco rendimiento
• no desarrollan todas las especies
Temp: 31º y 35º, ideal 32ºC.

Estudio Macro y
Micro-morfológico
Cultivo
Métodos convencionales
Tipificación
Pruebas bioquímicas
y fisiológicas
No satisfactorio

Crecimiento a diferentes temperaturas
Test de catalasa
Producción de pigmento (Triptofano)
Hidrólisis de la esculina
Asimilación de Tween 20,40,60,80
M. pachydermatis
Pruebas bioquímicas
y fisiológicas
Identificación

M. obtusa puede distinguirse por su morfología
M. obtusa
M. restricta
M. restricta: catalasa negativa

M. dermatis y M. furfur
solo difieren en el mol %
G+C
Las nuevas especies tienen
características fisiológicas similares
a las ya estudiadas
Patrones de asimilación semejantes

 Colonias no diferenciables – variación en las colonias
 Micromorfología: difícil observación
 Identificación por cultivo en medios adicionados con Tween para ver
asimilación :
◦ Necesita experiencia en la interpretación de las zonas de crecimiento
(asimilación) Resultados poco claros e inespecíficos.
◦ M. furfur – M. sympodialis – M slooffiae son fisiológicamente similares,
por lo tanto tienen patrones de asimilación semejantes
◦ Lo mismo ocurre con M. globosa – M. obtusa y M. restricta.
M. obtusa puede distinguirse por su diferente morfología y M. restricta por
ser la única especie catalasa negativa.
◦ Las nuevas especies tienen características fisiológicas semejantes
M. dermatis y M. furfur solo difieren en el mol % G+C
◦ NO permite detectar asociaciones
Desventajas

Identificación
Métodos de Biología molecular
PFGE (Electroforesis de campo pulsante)
RAPD (Amplificación randomizada del DNA nuclear)
PCR – RFLP (PCR – fragmentos de restricción de largo polimórfico)
PCR – REA (PCR – análisis de restricción enzimática)
Caracterización genotípica
PCR - REA
• Es precisa. Analiza solo 1 región genómica
LSU rRNA.
• Es práctica y por lo tanto rápida.
• Menor costo
• Detección de asociaciones

Epidemiología
Incidencia y frecuencia de especies de Malassezia
 Diferentes regiones geográficas
 Distintas patologías
 Sitios anatómicos de las lesiones
Metodología de
 Recolección de muestra
 Aislamiento y cultivo
 Tipificación

Pitiriasis versicolor
Foliculitis
Dermatitis Seborreica
Dermatitis Atópica
M. globosa, M. sympodialis y M.
furfur
Infecciones sistémicas
Papilomatosis Psoriasis
2ria a otras afecciones de piel

50%
25%
16,6%
8,4%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
M
.globosa
M
.sym
podialis
M
.furfur
M
.slooffiae
Pitiriasis versicolor
n= 126
n
58
36
27
5

46%
12%
19%
7% 14%
2%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
M
.globosa
.sym
podialisM
.furfur
M
.slooffiaeM
.restrictaM
.obtusa
Dermatitis seborreica
43%
33%
14% 10%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50M
.globosa
M
.sym
podialis
M
.slooffiae
M
.furfur
Foliculitis 50%
25% 21%
4%
0
10
20
30
40
50
60
M
.globosaM
.sym
podialis
M
.furfur
M
.restricta
Dermatitis
atópica
n= 24
n= 21
n= 57

AUTOR Y AÑOAUTOR Y AÑO
Kuchenmeister & RabenhorstKuchenmeister & Rabenhorst
(1867)(1867)
Behrend (1890)Behrend (1890)
Unna (1896)Unna (1896)
Unna (1896)Unna (1896)
(Kuchenm. & Rabenh.) Vuillemin(Kuchenm. & Rabenh.) Vuillemin
(1902)(1902)
Castellani (1908)Castellani (1908)
Castellani (1908)Castellani (1908)
de Beurmann et al. (1909)de Beurmann et al. (1909)
Kambavashi (1922)Kambavashi (1922)
Kambavashi (1922)Kambavashi (1922)
Lambachi (1926)Lambachi (1926)
(de Beurmann et al.)(de Beurmann et al.) Ota (1926)Ota (1926)
(Kambayashi) Ota (1928)(Kambayashi) Ota (1928)
(Kambayashi) Ota (1928)(Kambayashi) Ota (1928)
Mazza & Nino (1933)Mazza & Nino (1933)
de Arêa Leão (1940de Arêa Leão (1940))
NOMBRENOMBRE
Pleurococcus beigeliiPleurococcus beigelii
T. ovaleT. ovale
T. ovaleT. ovale
T. giganteumT. giganteum
T. beigeliiT. beigelii
T. foxiT. foxi
T. krusiT. krusi
Oidium cutaneumOidium cutaneum
Oospora granulosaOospora granulosa
O. cerebriformisO. cerebriformis
T. equinumT. equinum
T. cutaneumT. cutaneum
T. granulesumT. granulesum
T. cerebriformeT. cerebriforme
T. humahuaquenseT. humahuaquense
T. minusT. minus
CUADRO CLÍNICOCUADRO CLÍNICO
Piedra humanaPiedra humana
Ferida de peleFerida de pele
Piedra animalPiedra animal


 T asahii
 T mucoides
 T asteroides
 T cutaneum
 T inkin
 T ovoides
 Desde 1992 no se
acepta màs la
especie Trichosporon
beigelii

Levaduras con micelio que se desarticula en
artroconidios
Gemación ausente o presente.
Colonias inicialmente levaduriformes, secas.
Forman a menudo apresorios o células
meristemáticas.
Fermentación ausente. Asimilan diversos H de C.
Nitrato (-), Ureasa (+), Doliporos.
Dg diferencial: Geotrichum ureasa negativo.
Filogenia molecular: género relacionado con
Cryptococcus.
Algunas especies psicrofílicas. Varias especies
crecen a 37ºC y son consideradas como posibles
patógenos.
Seis especies de interés clínico

Localizaciones más
frecuentes:
Pulmón
Hígado
Bazo
Piel
Menos frecuentes:
Hueso
Médula ósea
Aparato digestivo

T asahii (sol naciente)
T mucoides
T asteroides
T cutaneum
T inkin
T ovoides

T.
asteroides
T. cutaneum
T. inkin

1 Colonizacion de la piel - region perigenital.
2 Contaminacion en ambiente hospitalario.
3 Infeccion superficial - pelo, piel u uñas.
4 Infecciones sistemicas --> localizada -->
diseminada

 Septicemias,
 meningitis crónica,
 infección diseminada en SIDA,
 fungemia en quemados, infección relacionada a catéter o en
pacientes onco-hematológicos.
•T asahii y T mucoides: Infecciones sistémicas diseminadas o localizadas,
especialmente en leucémicos.

ArtroconídiosArtroconídios
C/ blastoconídios
e urease (+)
S/ blastoconídios
e urease (-)
GeotrichumTrichosporon

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