Cromatografía de gases

Instrumentación y Análisis Cromatografía.- Introducción

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFIA

El método más general para tratar una interferencia, consisten en la separación física del
analito. Hoy en día el método más utilizado con este fin es la cromatografía.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA CROMATOGRAFIA

Abarca un grupo variado e importante de métodos de separación, que permiten al
químico separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados presentes en
mezclas complejas; muchas de estas separaciones son imposibles por otros medios.
En todos estos métodos, se emplea una fase estacionaria y una fase móvil. Los
componentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria por medio de una
fase móvil que fluye; las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración
entre los componentes de la muestra.

Tipos de fases estacionarias

En la cromatografía los componentes que se desea separar deben ser solubles en la fase
móvil. Deben ser también capaces de interaccionar con la fase estacionaria ya sea disolviéndose
en ella, adsorbiéndose, o reaccionando con ella en forma química. Como consecuencia, durante
la separación los componentes se distribuyen entre ambas fases.

a) Cromatografía en columna

La fase estacionaria es un sólido finamente dividido sostenido en un estrecho tubo de
vidrio o un metal. La fase móvil, que puede ser un líquido o un gas, se obliga a pasar a través del
sólido bajo presión o bien se deja percolar por efecto de la gravedad.

b) Cromatografía plana

La fase estacionaria puede ser un papel poroso o un sólido finamente dividido que se
aplica sobre una placa de vidrio. En este caso la fase móvil se desplaza a través del sólido ya sea
por acción capilar o bajo la influencia de la gravedad.

La fase estacionaria puede también ser un líquido inmovilizado inmiscible con la fase
móvil. Se emplean diferentes procedimientos para fijar en su lugar la fase estacionaria líquida.
Por ejemplo, un sólido finamente dividido recubierto por una delgada capa de líquido puede
colocarse en un tubo de vidrio o metal, y a través de este se deja fluir o percolar la fase móvil.
Por lo general, el sólido no tiene una función directa en la separación y actúa sólo para sostener
en su lugar la fase estacionaria por medio de la adsorción. Otro procedimiento, consiste en
recubrir las paredes internas de un tubo capilar con una delgada capa de líquido y hacer pasar
entonces, una fase móvil gaseosa a través del tubo. Finalmente, la fase estacionaria puede
sostenerse en su lugar sobre fibras de papel o sobre la superficie de partículas muy finas
aplicadas sobre una placa de vidrio.

Cromatografía lineal

Todos los procedimientos cromatográficos, se basan en las diferencias en el grado con el
cual los solutos sufren partición entre la fase móvil y la fase estacionaria. Los equilibrios

UNT M.Sc. Segundo M. Miranda Leyva Fac. Farmacia y Bioquímca


relacionados pueden describirse en forma cuantitativa por medio de una constante dependiente
de la temperatura, el coeficiente de partición K:

donde Cs es la concentración analítica total de un soluto en la fase estacionaria y CM es su
concentración en la fase móvil. En el caso ideal, la razón de partición es constante en una amplia
gama de concentraciones de soluto; es decir, Cs es directamente proporcional a CM. Pero, con
mayor frecuencia no hay relaciones lineales.

Las concentraciones en una columna cromatográfica son por lo general bajas. «La
cromatografía que se lleva a cabo bajo condiciones tales que K es constante, se denomina
cromatografía lineal». Aquí se considera sólo este tipo de cromatografía.

Cromatografía de elución lineal

En la cromatografía de elución, una única porción de la muestra disuelta en la fase móvil
se introduce en la parte superior de una columna, después de lo cual los componentes de la
muestra se distribuyen entre ambas fases. El agregado de una cantidad adicional de fase móvil
(el eluyente) hace avanzar columna abajo al disolvente que contiene una parte de la muestra,
donde se produce un nuevo proceso de partición entre la fase móvil y las porciones nuevas de la
fase estacionaria. Simultáneamente, la partición entre el nuevo disolvente y la fase estacionaria
tiene lugar en el sitio de colocación inicial de la muestra. Las continuas adiciones de disolvente
desplazan a las moléculas del soluto a lo largo de la columna en una serie de transiciones entre la
fase móvil y estacionaria. Debido a que el movimiento del soluto puede tener lugar sólo en la
fase móvil, la velocidad media a la que migra el soluto, depende de la fracción de tiempo en el
que permanece en esa fase. Esta fracción es pequeña para los solutos con relaciones de partición
que favorecen la retención en la fase estacionaria y grande para aquellos en los que la retención
en la fase móvil es más importante. En condiciones ideales las diferencias resultantes en estas
velocidades hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas localizadas a lo
largo de la columna. El aislamiento puede lograrse entonces haciendo pasar suficiente fase
móvil por la columna para hacer que estas distintas bandas sobrepasen el extremo, donde pueden
recogerse; alternativamente, el contenido de la columna puede ser extraído y dividido en
porciones que contienen los distintos componentes de la mezcla.

El proceso por el cual el soluto es lavado en la columna añadiendo nuevo disolvente se
llama elución. Si se coloca al final de la columna un detector que responda a los solutos y se
representa gráficamente su señal como una función del tiempo (o del volumen de la fase móvil
agregada), se obtiene una serie de picos, a lo que se llama cromatograma y útil para el análisis
cualitativo y cuantitativo. La posición de los picos sirve para identificar los componentes de la
muestra. Las áreas de los picos pueden relacionarse con la concentración.

Teorías de la elución cromatográfica

Es evidente que el movimiento de los solutos a través de la columna aumenta la distancia
entre las zonas ocupadas por un tipo de sustancia en particular, pero al mismo tiempo tiene lugar
un ensanchamiento de las zonas ocupadas (bandas), lo que disminuye la eficiencia de la
columna como dispositivo de separación. El ensanchamiento de la zona es inevitable; sin


embargo, afortunadamente este proceso es más lento que la separación de la zona. De esta forma
es posible la separación neta de ambas especies, siempre que la columna posea una longitud
suficiente.

Una teoría útil de la cromatografía debe ser capaz de explicar no sólo la velocidad a la
cual migran los solutos, sino también la velocidad de ensanchamiento de la zona durante la
migración, dado que la limpieza de una separación depende igualmente de ambos fenómenos.

a) Teoría de los platos

Teoría original de la cromatografía, fue capaz de describir las velocidades de la
migración en forma cuantitativa; pero no logró describir los efectos de las numerosas variables
que dan lugar al ensanchamiento de las zonas.
La teoría de los platos, desarrollada originalmente por Martin y Synge considera que una
columna cromatográfica está compuesta por una serie de estrechas capas horizontales y
contiguas separadas, denominadas platos teóricos. Se supone que en cada plato tiene lugar el
equilibrio del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento del soluto y del
disolvente, ocurre como una transferencia de un plato al siguiente.

La eficiencia de una columna cromatográfica como dispositivo de separación mejora a
medida que aumenta el número de equilibrios es decir, a medida que se incrementa el número de
platos teóricos. En consecuencia el número de platos teóricos N, se utiliza como una medida de
la eficiencia de la columna. Un segundo término, la altura equivalente de un plato teórico H,
también sirve para este fin. La relación entre ambos parámetros es
L
N
H

donde L es la longitud del empaque de la columna. Esta ecuación se sigue aplicando, sin
embargo un plato como una entidad física no existe en una columna. En consecuencia, el plato y
su altura deben ser considerados como criterios de eficiencia de una columna.

b) TEORIA CINETICA DE LA CROMATOGRAFIA

La teoría cinética de la cromatografía describe con éxito los efectos de las variables que
afectan el ancho de una banda de elución así también su momento de aparición en el extremo de
una columna.
Formas de las zonas
La forma gaussiana típica de un cromatograma puede atribuirse a la combinación aditiva
de los movimientos al azar de los miles de partículas del soluto en la banda o zona
cromatográfica. Ciertas partículas individuales, viajan rápidamente en virtud de su inclusión
accidental en la fase móvil durante la mayor parte del tiempo. Otras por el contrario, pueden
retardarse debido a que se incorporan en la fase estacionaria durante un tiempo mayor que el
promedio. La consecuencia de estos procesos individuales al azar, es la distribución simétrica de
las velocidades alrededor del valor medio, que representa el comportamiento de la partícula
media más común.
El ancho de la zona aumenta a medida que ésta se desplaza por la columna debido a que
ha existido más tiempo para la migración. En consecuencia, el ancho de la zona está
directamente relacionado con el tiempo de residencia de la columna e inversamente relacionado



con la velocidad a la cual fluye la fase móvil.

Fig. 4.1. Determinación de la desviación estándar de un pico cromatográfico. En este
caso, W = 4 ; tR es el tiempo de retención para un soluto retenido por el empaque de la
columna, y tM es el tiempo para uno que no lo es. En consecuencia tM es aproximadamente
igual al tiempo necesario para que una molécula de la fase móvil pase a lo largo de la
columna.

Desviación estándar como una medida del ancho de zona. El ancho de una zona
gaussiana se relaciona en forma conveniente con un único parámetro llamado desviación
estándar ; aproximadamente el 96% del área bajo esta curva se encuentra dentro de un
intervalo de más menos dos desviaciones estándar (± ) de su máximo. Entonces, una desviación
estándar deducida de un cromatograma sirve como una medida cuantitativa adecuada del
ensanchamiento de la zona.

Es útil emplear un símbolo para indicar que unidades se emplean; de esta forma se usará
para una desviación estándar en unidades de longitud, y t cuando se trata de unidades de
tiempo.
En la figura 4-1 se ilustra una forma simple para obtener un valor aproximado de y
en un cromatograma experimental. Se trazan las tangentes a ambos lados de la curva de Gauss y
se extienden para formar un triángulo con la abscisa. Las intersecciones se producen
aproximadamente a ±2 del máximo; es decir, W = 4 .

Cálculo de H y N a partir del ancho de la zona. El ensanchamiento de la zona
cromatográfica se expresa adecuadamente en términos del cuadrado de la desviación estándar (la
varianza) por unidad de longitud de la columna. Por definición,
2
H
L

donde H representa la altura del plato teórico en centímetros, es la medida de la eficiencia y L es
la longitud de la columna, expresada también en centímetros ( debe estar en cm). Otra forma
de escribir características de separación de una columna, es reemplazando el valor H dado por la
ecuación del número de platos teóricos, en la última ecuación y despejar para N,
L2
N 2



donde N es el número de platos contenidos en una columna de longitud L. Evidentemente, la
eficiencia de una columna aumenta a medida que aumenta el número de platos y disminuye la
altura de cada uno de ellos.

Causas del ensanchamiento de la zona. Los picos cromatográficos se ensanchan por lo
general, debido a tres procesos bajo control cinético, la difusión en remolino, la difusión
longitudinal, y la transferencia de masa fuera del equilibrio. Las magnitudes de estos efectos
están determinadas por variables controlables tales como la velocidad de flujo, el tamaño de la
partícula del material de empaque, las velocidades de difusión y el grosor de la fase estacionaria.
La relación entre la eficiencia de las columnas cromatográficas y la magnitud de estos tres
factores es la ecuación de van Deemter (izquierda) y su versión moderna (derecha), que
relaciona la velocidad de flujo u y la altura del plato.

B B
H A Cu ; H CS u CM u
u u

En este caso, la magnitud A se relaciona con la difusión en remolino, B con la difusión
longitudinal y C con la transferencia de masa fuera del equilibrio.

ANALISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO POR MEDIOS
CROMATOGRAFICOS

La cromatografía se ha desarrollado como el principal método de separación para
especies químicas estrechamente relacionadas. Además, puede utilizarse para la identificación
cualitativa y la cuantificación de las especies separadas.

Análisis cualitativo

Un cromatograma proporciona sólo una única pieza de información cualitativa acerca de
cada especie en una muestra, es decir, su tiempo de retención o su posición en la fase
estacionaria después de un cierto período de elución. Sin embargo la información cualitativa
obtenible por medio de la cromatografía es pequeña en comparación con los espectros IR,
además la precisión de la abscisa en un espectro es mejor que la del equivalente cromatográfico
(tR).
Sin embargo constituye una herramienta muy utilizada para identificar los componentes
de mezclas que contienen un número limitado de especies posibles cuyas identidades se
conocen. Por ejemplo se puede comprobar la presencia o ausencia de 30 o más aminoácidos en
un hidrolizado proteínico con un grado de certeza relativamente grande en base a las posiciones
de estas especies después de separarlas sobre una placa de cromatografía en capa delgada.
Además la identificación espectroscópica positiva, es por lo general imposible sobre una
mezcla tan compleja como la del ejemplo anterior sin una separación cromatográfica preliminar.
Así, muchas veces, la cromatografía constituye un precursor esencial de los análisis
espectroscópicos cualitativos.



ANALISIS CUANTITATIVO

La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación ya sea de la altura o del área
de los picos cromatográficos producidos por los analitos en comparación con uno o más
patrones. Si las condiciones están perfectamente controladas, ambos parámetros varían
linealmente con la concentración.

Análisis basado en la altura de los picos. La altura de un pico cromatográfico se obtiene
conectando la línea de base de cada lado del pico por medio de una línea recta y midiendo la
distancia perpendicular entre esta línea y el pico. Esta medida puede tomarse generalmente con
una precisión razonablemente grande y proporciona buenos resultados siempre que las
variaciones en las condiciones de la columna no alteren el ancho de los picos durante el período
necesario para obtener los cromatogramas de la muestra y los patrones. Las variables que se
deben controlar cuidadosamente son la temperatura de la columna, la velocidad de flujo del
eluyente y la velocidad de inyección de la muestra. Además, es necesario tener cuidado en evitar
la sobrecarga de la columna. El efecto de la velocidad de inyección de la muestra es
particularmente crítico para los picos iniciales de un cromatograma. En estos casos, en que se
utiliza una jeringa, los errores relativos van de 5 a 10%.

Calibración con patrones

Un método más directo para los análisis cromatográficos cuantitativos consiste en la
preparación de una serie de soluciones patrón cuya composición se aproxima a la del problema.
Se realizan los cromatogramas para los patrones y se grafican las alturas de las áreas de los picos
en función de la concentración. Una gráfica de estos datos debe proporcionar una línea recta que
pasa a través del origen; los análisis se basan en esta gráfica. Para lograr la máxima precisión es
necesario repetir con frecuencia las calibraciones.

Obtenido el cromatograma, se puede medir la altura o el área del pico cromatográfico:

ALTURA. Cuando el pico es bien definido.

AREA. Para lo cual se debe realizar los trazos que se indican en la figura, el área se determina
con la fórmula:
bh
AREA
2
Análisis basados en el área de los picos

Las áreas de los picos son independientes de los ensanchamientos debidos a la
temperatura, velocidad de inyección o de flujo. Por lo tanto, desde este punto de vista, las áreas
de los picos constituyen un parámetro analítico mucho más satisfactorio que sus alturas. Por otra
parte, la altura de los picos se mide con mucho más facilidad y en el caso de los picos estrechos
se obtiene una mayor precisión.
Muchos instrumentos cromatográficos modernos, están equipados con integradores
electrónicos, que permiten una estimación precisa del área de los picos, con una desviación
estándar de 0.44%.



Figura 4.2. Análisis cromatográfico cuantitativo

Procedimiento de calibración

a) Calibración directa.- Se prepara patrones y obtiene los cromatogramas.

Inconvenientes:

1 La seguridad de la cantidad de muestra inyectada.
2 La sensibilidad del detector, debe permanecer constante en cada prueba.

b) Método del estándar interno (estandarización directa).

Usado en análisis biomédico: etanol en sangre y esteroides en suero u orina. Se tiene que
disponer de una norma o patrón interno; que debe cumplir con los requisitos:

1 tR cercano al componente de interés.
2 Resolución: R > 1.25; si R = 1, están separados.

Si se cumple con tales, el análisis es muy útil.

Figura 4.3. Procedimientos de calibración.



Ejemplos:
1) Determinar testosterona (T) en orina, usando androstano (A) como referencia interna o
norma. Los datos aparecen en la siguiente tabla:

Se gráfica la relación de área del componente a ser cuantificado al área de la norma Vs. la
relación de peso del componente al peso de la norma. Así aparece en la figura 2.b. La
relación de áreas de la alícuota de muestra a la norma, permite determinar una relación peso
de muestra (pTx) a peso de norma; igual a 0.5

(pTx/pA) = 0.5

De allí, al utilizar los 50 g de norma se obtiene:

pTx = 0.5 x 50 g = 25 g de Testosterona.

2) Determinar Alcohol Etílico, con Detector de Ignición de Flama (FID) y usando como
patrón interno la metiletilcetona. Se usa este compuesto porque nos se encuentra en
bebidas alcohólicas y sale junto al etanol.

No interesa el volumen, tampoco la fluctuación del detector.

c) Normalización interna
Se usa cuando se necesita información aproximada y se asume que todos los componentes
han sido eluidos y que el porcentaje (%) de composición de un componente es:
Area Pico
%
Area Total

Figura 4.4. Método de Normalización interna


Se asume también que:

% Area = % en peso

En la práctica, la anterior es una ecuación muy útil. Además cada componente tiene una
respuesta característica; primero se debe corregir mediante:

Factor de corrección = (área/peso)

Ejemplo:

A la muestra desconocida se le añadió 5 mililitros de una solución conteniendo la norma
cuya concentración es de 100 g/mL. Al cromatografiar la mezcla se encontró que la razón
de área era 8, por lo tanto la razón de peso es 7; calcular la concentración del desconocido.

(Peso componente/peso norma) = 7 (1)

Peso norma = 5 mL x 100 g/mL = 500 g (2)
Despejando de (1):

Peso componente = 7 x peso norma

Peso componente = 7 x 500 g = 3,500 g o 3.5 mg.


Instrumentación y Análisis Cromatografía gas-líquido

CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

En la cromatografía gaseosa los componentes de una muestra vaporizada se fraccionan
como consecuencia de la partición entre una fase móvil y una fase estacionaria mantenida en una
columna. La cromatografía gas-sólido (CGS) representa una subclasificación en la que la fase
fija es un sólido; el proceso de partición supone entonces equilibrios de adsorción gaseosa. En la
cromatografía gas - líquido(CGL) la fase estacionaria es un líquido sostenido sobre una matriz
sólida inerte; aquí son importantes los equilibrios gas-líquido.

PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO

El concepto de cromatografía gas-líquido fue descrito en 1941 por Martin y Synge, a
quienes se debe también la cromatografía de partición entre líquidos.
El principio de la cromatografía de partición gas-líquido y líquido- líquido difieren sólo
en el detalle de que la fase móvil de la primera es un gas, en vez de un líquido. La muestra se
introduce como un gas en la cabeza de la columna; los componentes que tienen una solubilidad
finita en la fase líquida estacionaria se distribuyen entre esta fase y la fase gaseosa, según la ley
del equilibrio. Se logra entonces la elución forzando un gas inerte, como nitrógeno o helio a
través de la columna. La velocidad de los distintos componentes a lo largo de la columna
depende de su tendencia a disolverse en la fase líquida estacionaria. Un coeficiente de
distribución que favorezca al disolvente da por resultado una baja velocidad; por el contrario,
aquellos componentes cuya solubilidad en la fase líquida es despreciable se desplazan
rápidamente por la columna. Teóricamente, se obtienen curvas de elución en forma de campana
de Gauss.

APARATOS

Existen diferentes cromatógrafos de gases de diferente grado de complejidad.

Fuente de gas transportador
Los gases transportadores deben ser químicamente inertes: helio, argón, nitrógeno e
hidrógeno. El helio es el más utilizado.
Las velocidades de flujo se controlan por medio de un regulador de presión. Las
presiones de entrada varían entre 0,7 a 3,5 Kg/cm2 (por encima de la presión ambiental), lo que
da lugar a velocidades de flujo de 25 a 50 mL/min. Se pueden establecer las velocidades de flujo
por medio de un rotámetro en la cabeza de la columna; pero es más preciso un medidor de
burbujas.

Sistema de inyección de la muestra
La eficiencia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño adecuado y se
introduzca como un "tapón" de vapor; la inyección lenta o las muestras de excesivo tamaño
producen ensanchamiento de las bandas y empobrecen la resolución. Se utiliza una microjeringa
para inyectar las muestras a través de un diafragma de caucho o de silicona dentro de una
entrada para muestras previamente calentada (50 C por encima del punto de ebullición del
analito), en la cabeza de la columna. En columnas analíticas comunes el volumen va de unas
pocas décimas de L hasta 10 L. En las columnas capilares el volumen aproximadamente es
10-3 L en este caso se utiliza un sistema divisor de la muestra, para liberar hacia la cabeza de la
columna, sólo una pequeña fracción de la muestra es inyectada, el resto se desecha.



Las muestras de gas se introducen mejor por medio de una válvula de muestreo. Las
muestras sólidas se introducen como soluciones.

Columnas

En este tipo de cromatografía se utilizan dos tipos de columnas:

a) Capilares.
Fabricadas de tubos capilares con diámetro interno entre 0,3 a 0,5 nm, cuya superficie
interna está cubierta con una película muy delgada ( 1 m) de fase líquida. Presentan una
caída de presión despreciable, por lo que pueden tener de 10 a 100 m o más; la relación
VS/VM varía de 100 a 300, lo que explica en parte sus elevadas eficiencias. Se han descrito
columnas de varios cientos de miles de platos teóricos. La capacidad para la muestra es baja
(<0,01 L), lo que se puede aumentar recubriendo la superficie interior del tubo con un
material poroso como el grafito, un óxido metálico o un silicato. Así se aumenta la
superficie interna para soportar mayor cantidad de fase estacionaria (líquido); como también
la capacidad de la columna.

b) Empacadas.
Se construyen de tubos metálicos o de vidrio de 1 a 8 mm de diámetro interno, diseñadas
para sostener empaques sólidos desde 2 hasta 20 m de longitud. Los tubos están plegados o
enrollados de modo que se puedan acomodar en forma adecuada dentro de un termostato del
instrumento. Son comunes las columnas que poseen relaciones de VS/VM de 15 a 20 y
contienen de 30 a 300 platos teóricos por decímetro. Las mejor empacadas poseen un total
de 20000 platos teóricos o más.

Soporte sólido para las columnas empacadas.

El soporte sólido ideal consistiría en partículas esféricas, pequeñas y uniformes, con buena
resistencia mecánica y un área superficial específica de por lo menos 1 m 2/g. Además, el
material deberá ser inerte a temperaturas elevadas y humedecerse con facilidad con la fase
líquida para producir un recubrimiento uniforme. Los soportes más comunes provienen de
las tierras de infusorios. Existen dos tipos de materiales de esta clase, el polvo de ladrillo
refractario, comercializado como Chromosorb P, C 22, Sterchamol; posee la mejor
resistencia mecánica y la mayor superficie específica ( 4 m2/g); con la desventaja de ser
muy reactivo lo que impide ser utilizado para compuestos polares. La tierra silícea
(Kieselgur) es más frágil y con menor superficie específica ( 1 m2/g) pero es menos
reactiva; se comercializa como Chromosorb W, Celite, Embasel y Celatom.

Fase líquida.

Las propiedades deseables para la fase líquida en una columna cromatográfica gas-líquido
son 1) baja volatilidad: idealmente, su punto de ebullición debe ser por lo menos 200
superior a la temperatura máxima de operación para la columna; 2) estabilidad térmica; 3)
inercia química y 4) características de disolvente de tal naturaleza que los valores de y k',
para los solutos que han de resolverse, se encuentren dentro de límites apropiados.



Termostatización de la columna.

La temperatura de la columna es una variable importante por lo que para el trabajo de
precisión debe ser controlada dentro de las décimas de grado. Por tal motivo está dentro de un
horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de
la muestra y del grado de separación requerido.

En general, la resolución óptima se asocia con la temperatura mínima; pero esto
incrementa el tiempo de elución y de término de un análisis.

Sistema de detección

Los aparatos de detección de un cromatógrafo gas -líquido deben responder rápida y
reproduciblemente a las bajas concentraciones de los solutos emitidos por la columna. Dado que
la concentración del soluto en el gas portador en cualquier instante es sólo unas pocas partes por
mil, el detector debe responder a concentraciones uno o dos órdenes de magnitud menores (o
más); además el paso de un pico por el detector puede durar un segundo o menos, el detector
debe en tal breve período responder adecuadamente.

Conviene además que el detector tenga respuesta lineal, buena estabilidad en períodos
prolongados y respuesta uniforme a una variedad de compuestos.

Detectores de conductividad térmica.

Catarómetro.

Se basa en los cambios de conductividad térmica de la corriente de gas; el sensor consiste en
un elemento calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante,
depende de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un
hilo fino de platino, oro o tungsteno, o tambien, un termistor semiconductor. La resistencia del
hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas; a diferencia del detector
de hilo, el termistor tiene un coeficiente de temperatura negativo

En los instrumentos para cromatografía se utilizan dos detectores gemelos uno delante
(entrada) de la columna y otro detrás (salida); así sus resistencias incorporadas en un puente de
Wheatstone se comparan para eliminar la conductividad del gas portador y reducir al mínimo los
efectos de la variación de la velocidad de flujo y la presión en la columna, así como de la energía
eléctrica.

Las conductividades térmicas del hidrógeno y del helio son seis a diez veces mayores que
las de la mayoría de compuestos orgánicos. Así la presencia de pequeñas cantidades de tales
materiales reducen la conductividad térmica del gas efluente y el detector registra una elevación
de la temperatura.

Estos son sencillos, fuertes, baratos, no selectivos, precisos y no destruyen la muestra pero
no son tan sensibles comparados al detector de ionización de flama (DIF), o al detector de
captura de electrones (DCE).



AVANCES EN CG
LA NOMENCLATURA EN CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía de gases se clasifica primero por el tipo de columnas que se emplean y
después por las categorías de fases estacionarias.
En la cromatografía de gases con columna empacada, la fase estacionaria de partículas
empacadas dentro de una columna de acero inoxidable y de vidrio que generalmente tiene un
diámetro interno (DI) de 2 a 4 mm. La fase estacionaria puede estar formada de diversos
materiales sólidos porosos –cromatografía gas-sólido (GSC, gas-solid chromatography)- y
el retraso de los analitos se debe a un equilibrio que incluye adsorción sobre la superficie y
desorción de la misma. Otra alternativa es que las partículas de la fase estacionaria estén
recubiertas de algunos de los diversos líquidos de alto punto de ebullición –cromatografía
gas-líquido (LGC, liquid-gas chromatography)- La separación de los analitos depende de las
distintas fracciones de tiempo que pasen disueltos en la fase líquida estacionaria. Los
componentes más solubles son retenidos mas tiempo ya que tardan menos viajando en el gas
de arrastre.
Los métodos de cromatografía de gases con columna empacada se emplean menos en la
actualidad que la cromatografía de gases capilar. Las columnas capilares tienen diámetros
internos (DI) de menos de 1 mm y las paredes internas de las columnas suelen estar
recubiertas con una película de fase estacionaria. Las columnas con DI de 530 μm se llaman
de megaporo; y las más pequeñas, con DI de 100 μm se llaman de microporo. La razón más
evidente por la cual la cromatografía de gases capilar ha reemplazado a la cromatografía de
geases en columna es porque la eficiencia cromatográfica característica de la primera es de
hasta 200 000 platos teóricos en comparación con sólo 10 000 o menos para columnas
empacadas. Como el número de platos teóricos se traduce a una mejor resolución, las
columnas capilares permiten separar los componentes con más rapidez y correr más muestras
en el instrumento, o sea, aumentan la velocidad de proceso de la muestra.
Las columnas capilares se clasifican, a su vez, dependiendo de la fase estacionaria con
que están rellenas. Cuando la fase estacionaria es una película de material en la superficie
interna de la columna, se dice que es una columna tipo tubular abierta con recubrimiento
de paredes (WCOT, wall-coated open tubular). Para aumentar la capacidad de la columna,
el área superficial se aumenta uniendo material de empaque a la pared. Actualmente, hay dos
formas de llevar a cabo esto. La columna tubular abierta recubierta con soporte (SCOT,
support-coated open tubular) tiene partículas de soporte en la pared. Asu vez, éstas están
recubiertas de la fase líquida. La columna tubular abierta de capa porosa (PLOT, porous-
layer open tubular) tiene una delgada capa de polímero poroso depositado sobre la superficie
interna. Las columnas WCOT y SCOT se emplean para cromatografía gas-líquido. Las
columnas SCOT se emplean con más frecuencia que las WCOT por su mayor capacidad. Las
columnas PLOT se emplean para cromatografía gas-sólido.
La cromatografía de gases capilar es una de las técnicas de separación más poderosas que
existen actualmente para resolver los componentes de mezclas complicadas.

Análisis de muestras
La cromatografía de gases es el método de elección para separar y analizar compuestos
orgánicos con puntos de ebullición inferiores a 250°C y los gases fijos; ambos grupos tienen
presión de vapor suficientemente altas de manera que pueden ser transportados por la fase
móvil gaseosa. Sin embargo, no es la presión de vapor baja lo que impide el uso de la
cromatografía de gases, sino la descomposición. Cuando se separan materiales de alto punto



de ebullición, los compuestos pueden descomponerse en la columna a las temperaturas
necesarias para obtener el cromatograma en un tiempo razonable.
Por otra parte la descomposición térmica antes de la cromatografía puede ser de utilidad.
En la CG con pirólisis, el analito se descompone deliberadamente a altas temperaturas y se
efectúa la cromatografía de los productos de descomposición. Los picos que aparecen en el
cromatograma de gas por pirólisis constituye una “huella digital” del analito. Es difícil
realizar análisis cuantitativos con CG por pirólisis, pero este método se emplea de manera
rutinaria para comprobar lotes de materiales complejos como pinturas, fracciones pesadas de
petróleo o plásticos.
En el otro extremo de temperaturas, las columnas de CG pueden enfriarse para efectuar
separaciones de materiales de bajo punto de ebullición, como metano o H2. Se efectúa la
cromatografía de gases de estos materiales en condiciones que van desde la temperatura
ambiente hasta la del hielo seco, -80° C.
También es posible realizar análisis cromatográficos de ciertos grupos de compuestos
tanto por CG como por CL. Algunos ejemplos son azúcares, ácidos grasos y aminoácidos.
Como para realizar cromatografía de gases se requieren muestras volátiles es necesario
derivatizar este tipo de compuestos. Esto se lleva a cabo mediante una reacción con los
grupos químicos que ocasionan presión de vapor baja (punto de ebullición alto) para producir
compuestos que se vaporicen más fácilmente. Un ejemplo sencillo de derivatización es la
transformación de un ácido carboxílico en su éter metílico: por ejemplo, el ácido hexanoico,
C5H11COOCH3 (p.eb. 127,3° C). También se emplea la derivatización haciendo reaccionar
los componentes para dar grupos químicos que producen respuestas fuertes en el detector del
instrumento. Un ejemplo es agregar cloros (como el grupo CCl 3) al emplear un detector de
captura de electrones que es altamente sensible a los halógenos.
Tanto la CL como la CG se pueden emplear para separar productos orgánicos de punto
de ebullición moderadamente alto (<200° C). Para compuestos con punto de ebullición
superior a 200° C, es más probable que se elija la cromatografía de líquidos.

Muestras e introducción de muestras
Las muestras para cromatografía de gases pueden ser gases, líquidos o sólidos. Las
muestras sólidas y líquidas deben vaporizarse de alguna forma. Cuando las muestras sólidas
se vaporizan con facilidad se efectúa la cromatografía de los componentes moleculares. Sin
embargo, si los sólidos se descomponen, sólo será posible analizar los productos de
descomposición para caracterizar la muestra.
Para lograr mejores separaciones las muestras deben inyectarse en el menor tiempo
posible. Un tiempo de inyección mayor provoca bandas más anchas al inicio de la separación.
El tiempo de inyección para una muestra líquida o sólida también incluye todo el periodo que
tarde la muestra en vaporizarse. El tiempo de vaporización se reduce inyectando las muestras
en una región que está más caliente que la columna, y lo suficientemente caliente para
vaporizar las muestras líquidas con rapidez sin pirólisis. Esta región más caliente y las partes
asociadas en la cabeza de la columna se llaman el inyector y la evaporación rápida de la
muestra se llama evaporación instantánea. La temperatura óptima para el inyector se
determina experimentalmente, pero en general es igual o mayor que la temperatura máxima
que la columna alcanza durante la separación. Usualmente las muestras se inyectan con una
jeringa. El émbolo de ésta se empuja a mano (inyección manual) o empleando un impulsor
eléctrico o neumático (inyección automática). La inyección automática suele ser más precisa
y permite desviaciones estándar relativas de tan sólo 0,1 por ciento.
La mezcla se introduce con la jeringa al inyector, o bien otra alternativa es introducirla



directamente a la parte superior de la columna (inyección directa en columna). La elección
entre estos dos métodos a menudo depende del diámetro de la columna. Cualquiera de ellos
es eficaz para columnas empacadas, pero la introducción de la muestra es un proceso
delicado en columnas capilares de menos de 1 mm de diámetro por dos motivos: primero, el
corte transversal abierto del capilar es muy pequeño y, segundo, la muestra debe ser pequeña
para no sobrecargar la fase estacionaria y provocar distorsión en la banda. Debe haber
presente suficiente fase estacionaria para interaccionar con todos los componentes de la
mezcla de analitos a la vez.
Para mantener la cantidad de muestra dentro del nivel correcto, se emplea un tipo
especial de inyector que reduce la cantidad de muestra que llega a la cabeza de la columna
capilar: el inyector divisor o sin división (split/splitless inyector). Las muestras con
concentración de analito adecuadamente baja se inyectan en el modo no divisor (splitless), y
son transportadas a la columna por el gas de arrastre como en un inyector normal. Cuando se
emplea el modo de división (split), el gas de arrastre fluye continuamente por la entrada a
razón de 50 a 1000 veces la velocidad con la que fluye por la columna. El exceso de flujo se
deja escapar y sólo penetra una fracción de la muestra a la columna.

Columnas
La elección de diámetro, longitud y fase estacionaria dependen en un principio de que se
realice cromatografía en columna o capilar. En la tabla 4.1 se mencionan algunas cifras de
mérito para columnas empacadas y columnas capilares. La elección de fase estacionaria para
la mayor parte de las muestras se realiza basándose en información específica (por ejemplo,
la polaridad) de cada tipo de fases estacionaria y en las condiciones específicas para diversos
tipos de muestras, que se encuentran en los catálogos de los fabricantes y en manuales.

Tabla 4.1 Comparación de las características de una columna empacada típica y una columna
capilar
Empacada WCOT y SCOT PLOT
DI de la columna 3 – 6 mm 0,10 – 0,53 mm 0,32 – 0,53 mm
Longitud de la columna 1–3m 30 – 50 m 30 – 50 m
Diámetro de partícula (dp) 120 – 185μm -- --
Grosor del recubrimiento -- 0,1 – 0,5 μm 12 – 25 μm
Platos teóricos/m 1 000 – 5 000 1 000 – 8 000 1 000 – 8 000
Número típico de platos teóricos 1 000 – 5 000 25 000 – 200 000 25 000 – 200 000
totales (N)
Capacidad total (μg/componente) 100 0,05 – 5 0,05 – 5
Área superficial de la fase 0,2 10-6 – 10-7 10-6 – 10-7
estacionaria (m2)
Gasto volumétrico (mL/min) 20 – 100 0,5 – 5 5 – 10
Gasto lineal (cm/s) 10 – 50 20 - 50 50 - 100
En CGL otro factor que se puede modificar es la cantidad de fase líquida presente. Así, el
hecho de usar más fase líquida tiene un efecto doble: primero, la capacidad aumenta, de
modo que se pueden usar cantidades de muestra más grandes. Una mayor cantidad de
muestra conduce en general a mejor cuantificación, mejor límite de detección y mayor
intervalo medible de las concentraciones de analito en la muestra. Sin embargo, a medida que
se dispone de más fase estacionaria y los analitos pasan más tiempo disueltos en ella, el
tiempo de retención aumenta, de modo que es necesario balancear la capacidad con el tiempo
de análisis. En columnas capilares, el diámetro de la columna y el espesor de la capa de fase
estacionaria son críticos para determinar que tan bien se establece el equilibrio entre la fase
estacionaria y la fase móvil y, por tanto, la calidad de la separación. La fase líquida de las
columnas empacadas se mide por el porcentaje de carga, que es la medida en peso/peso de
fase estacionaria comparado con el peso total del empaque. La cantidad de fase estacionaria


disponible también está en función del diámetro de las partículas. Los diámetros de las
partículas se expresan en términos de tamaño de malla del empaque. Este número define el
tamaño de los huecos de mallas estándar que se emplean para filtración de polvos. A medida
que el número es más alto, hay más líneas en la malla y las partículas de empaque serán más
pequeñas. Por ejemplo, las partículas de “malla 80/100” pueden atravesar la malla “80”, pero
quedan atrapadas en la malla “100”, y tienen un diámetro aproximado de 150 a 175 μm.

Temperatura
La temperatura es crucial para las separaciones en cromatografía de gases, por lo cual es
conveniente lograr un control de ±0,5° C. La temperatura afecta las posiciones de los
equilibrios de distribución de los analitos entre el gas de arrastre móvil y la fase estacionaria
y así como la rapidez con que se establecen los equilibrios. Cuando se aumenta la
temperatura de la columna se acelera la elusión y se alcanza más rápido el equilibrio entre la
fase móvil y la estacionaria. La temperatura óptima se determina teniendo en cuenta la
resolución necesaria y el deseo de reducir el tiempo de separación. Para lograr resultados
óptimos, la separación se verifica a temperatura constante (separación isotérmica) o con
programación de aumento de temperatura. El aumento de temperatura en el curso de la
separación se llama gradiente de temperatura. En cromatografía de gases un gradiente de
elución implica un gradiente de temperatura. El gradiente puede tener diversas formas. Hay
rampas lineales de temperatura o se puede proceder por diversas rampas o mesetas. Este
aumento de temperatura permite analizar con puntos de ebullición y características muy
variables en periodos más breves. Observe que el gradiente de temperatura es una variación
de temperatura con el tiempo, dT/dt; no es un gradiente de temperatura a lo largo de la
columna. La temperatura más alta en el curso de la separación no sólo depende de la
descomposición de la muestra que se mencionó con anterioridad, sino que también hay que
tener la estabilidad y la presión de vapor de las fases estacionarias líquidas. La fase
estacionaria líquida en sí puede vaporizarse, descomponerse, o ambas cosas, y el material
será expulsado de la columna. Esto se llama sangrado de la columna, lo cual constituye una
descripción gráfica. Para efectuar una separación específica, el extremo inferior del intervalo
de temperatura se determina por las propiedades de la fase estacionaria y los analitos
componentes. En el caso extremo, a temperaturas excesivamente bajas, todos los compuestos
inyectados se quedan simplemente en la entrada de la columna o en la parte superior de la
fase estacionaria y dejan de desplazarse. A temperaturas un poco más altas, pero aun
demasiado bajas el proceso de adsorción y deserción es lento y los picos se ensanchan.

Gasto de la fase móvil
En la tabla 4.1 se indican los gastos característicos de diversas columnas de
cromatografía de gases. Mientras que las columnas empacadas generalmente se operan con
gastos de décimas de mililitros por minuto (en algunos casos de hasta 200 mL/min), las
columnas capilares normalmente operan con gastos desde menos de 1mL/min hasta un pico
de aproximadamente 5 mL/min. El incremento del gasto a menudo acelera la elusión sin
ejercer ningún efecto importante en la resolución.
Detectores
En cromatografía de gases se dispone de diversos detectores que indican los cambios en
la composición del eluyente. En la tabla 4.2 se mencionan los más empleados, junto con una
breve sinopsis de sus cifras de mérito, que incluyen sus límites de detección y sus intervalos
lineales. Inclusive en CGL capilar y con columnas de baja capacidad que requieren de
muestras pequeñas, es posible efectuar determinaciones de ppm que requieren
cuantificaciones de 10-10 g de los componentes de muestras reales. Esta masa de 10 -10 g es la



que se integra en toda la banda. En cualquier momento la cantidad presente en el transductor
es menor y el límite de detección se indica en g s -1 o en unidades más pequeñas, como pg s-1.
Como es de imaginar, los detectores no son igualmente sensibles a todos los compuestos. Por
ejemplo, dos de los más comunes, el detector de ionización de llama y el de captura de
electrones, tienen selectividades bastante distintas. Otro detector menos complicado, el de
conductividad térmica, responde a un número muy amplio de compuestos pero es el menos
sensible de los que se emplean en la actualidad.
Al combinar el poder de separación cromatográfica con la capacidad de identificación de
la espectrometría de infrarrojo o la espectrometría de masas se obtienen herramientas
poderosas para el análisis de muestras complicadas. Las respuestas del espectrómetro de
infrarrojo y del espectrómetro de masas son específicas para cada componente aunque se
eluyan en una misma banda. Si el componente es un compuesto conocido es muy probable
que los algoritmos de búsqueda de patrones ayuden a identificarlo y también se podrá
efectuar un análisis cuantitativo mediante técnicas de combinación o híbridas. Las
combinaciones son, respectivamente, cromatografía de gases con detección de infrarrojo con
transformada de Fourier, que se abrevia CG/FTIR (Fourier-transform infrared detection), y
cromatografía de gases con espectrometría de masas, que se abrevia CG/EM.

Tabla 4.2 Propiedades de algunos detectores para cromatografía de gases
Tipo Límite de Intervalo Comentarios
detección lineal
aproximado (g aproximado
s-1)
Conductividad 10 – 10-6
-5
103 – 104 Detector universal.
térmica Mide cambios en la
(DCT) conductividad del calor.
Ionización de 10-12 106 – 107 Detector universal.
llama Mide corrientes iónicas
(DIF) de pirólisis
Captura de 10-14 102 – 103 Detector selectivo para
electrones compuestos con átomos de
(CE o DCE) afinidades electrónicas
altas.
Fotometría de 10-13 102 Detector selectivo para
llama compuestos que contienen
(DFF) S, P.
Nitrógeno-fósforo 10-8 – 10-14 105 – 107 Selectivo para
compuestos que contienen
N, P.
Fotoionización 10-8 – 10-12 105 Universal (con cierta
(DFI) selectividad debida a la
identidad del gas en la
lámpara.
Detector Hall 10-11 105 Detector específico para
compuestos que contienen
halógenos, S o N.
Espectrómetro de 10-12 a Detector universal.
masas
(EM)
Infrarrojo de 10-10 102 Moléculas polares
transformadas de
Fourier
(IRTF)
a. Variable y dependiente del tipo de espectrómetro de masas y también del tipo de compuestos que se
analizan.


Instrumentación y Análisis Resumen: Cromatografía
b.
RESUMEN: LA CROMATOGRAFIA

Con el término cromatografía se engloba una serie de técnicas en las que los
componentes de una muestra son transportados por una fase móvil (gas ó líquido), a través de
una fase estacionaria (líquida ó sólida) que los retiene selectivamente haciendo que eluyan a
tiempos distintos, permitiendo su detección individual.

La cromatografía se puede clasificar en dos grandes ramas, según la fase móvil que se
emplee, sub-dividiéndose éstas a su vez de acuerdo al medio en que se realiza la separación. Una
clasificación general de los distintos tipos se muestra en el siguiente cuadro:

El campo de la aplicación de cada tipo de cromatografía está fijado por sus
características principales, debiendo compatibilizarse estas con las de los compuestos a analizar,
para determinar cuál es la técnica más adecuada a emplear en el análisis.

Esto origina que pese a ser técnicas parecidas, sean útiles en la solución de problemas
distintos, convirtiéndose más bien en técnicas complementarias. Así, mientras que por
Cromatografía de gases (CG) analizamos compuestos volátiles, con la cromatografía líquida
separamos aquellos compuestos polares y no polares de baja volatilidad.

El advenimiento de la cromatografía líquida de alta performance ó HPLC, por sus siglas
en inglés, basada en el empleo de columnas de pequeño diámetro rellenas con micropartículas y
de altas presiones para el flujo de solventes; amplía enormemente los campos de aplicación de
esta técnica analítica.

Como una primera orientación presentamos una comparación de los dos grupos
principales de las técnicas cromatográficas, en función de las principales características de la
muestra que tienen un carácter limitante para el uso de cada una de estas técnicas


Instrumentación y Análisis Resumen: Cromatografía
Tabla. Comparación de CG con HPLC
CG HPLC
. Volatilidad de la muestra. . Solubilidad de la muestra.
. Es crítica la estabilidad molecular de . No es crítica la estabilidad de la
la muestra. muestra molecular, por no usarse
- Por proceso térmico. altas temperaturas.
- Contra catalizadores.
. Sólo para compuestos de peso molecular . No hay limitación en el peso
menor a 500. molecular de los compuestos.
. No se recupera la muestra generalmente. . Fácil recuperación de la muestra.

De aquí podemos concluir que la cromatografía de gases es la vía más adecuada cuando
se desea analizar compuestos volátiles, siempre que sean estables térmicamente; mientras que si
se trata de compuestos polares, la cromatografía líquida nos brinda una mejor solución, al no ser
su baja volatilidad un factor limitante.

Estas diferencias y limitaciones se relacionan con las diferentes variables que controlan
el proceso en cada uno de los instrumentos empleados por estas técnicas. Cada tipo de
cromatógrafo es gobernado por un conjunto diferente de variables, esto se comprueba fácilmente
al comparar esquemáticamente las partes principales que debe tener un sistema CG y el HPLC.

En un primer análisis encontramos que en el cromatógrafo de gases será necesario
controlar la presión y temperatura del gas de arrastre; mientras que en el de líquidos se deberá
controlar la composición y flujo del solvente.


Cromatografía de gases

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