Producción de estreptavidina*1 monomérica soluble con capacidad de unión reversible                                       ...
La estrept-avidina es una molécula homotetramerica con un sitio de unión a                    biotina en cada sub-unidad. ...
Tabla        1.      Cebadores mutagénicos para          la   construcción      de mutantes        de estreptavidina.Codon...
Producción y purificación de estreptavidina. La estreptavidina tipo salvaje fueproducida por B. subtilis WB800 (pSSAV-Tcry...
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Fig. 1. Estructura de tetrámeros de estreptavidina y residuos de interfase críticos seleccionadospara mutagénesis. A. inte...
Efecto de mutaciones simples en la monomerización de estreptavidina- Muteínas deestreptavidina que llevan un cambio de ami...
Purificación de muteínas de estreptavidinas – Purificación de M4 fue usada comoun ejemplo para ilustrar el proceso (Fig. 4...
ambos M2 y M4 en la ausencia de biotina indico que estaban en su estado monomérico.La adición de biotina solo causo un lig...
tratamiento de sulfo-EGS se mostro que muchas de estas subunidades fueron reticuladasa dímeros y oligomeros superiores con...
Fig.4 Purificación de muteínas de estreptavidina M4                                       usando      agarosa-biotina.    ...
DISCUSIÓNAunque la estreptavidina y la avidina tienen similares estructuras tridimensionales ypropiedades de unión a bioti...
con alto pI son conocidas por tener interacciones no-específicas por interaccioneselectrostáticas. El pI calculado para M2...
potencial impedimento estérico para las subunidades B, C y D. Tanto para Val-55 en lasubunidad A, su área de superficie ac...
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  1. 1. Producción de estreptavidina*1 monomérica soluble con capacidad de unión reversible de biotina*2. Estreptavidina monomérica con capacidad de unión reversible de biotina tiene muchas potenciales aplicaciones. Debido a que un sitio de unión completo de biotina en cada subunidad de estreptavidina requiere la contribución de triptófano 120 de una subunidad aledaña, la monomerización de la estreptavidina tetramérica natural puede generar estreptavidina con una reducida afinidad de unión con biotina. Tres residuos, valina 55, treonina 76 y valina 125, se cambiaron por cualquier arginina o treonina para crear repulsión electroestática e impedimento estérico en las interfases. La mutación doble (T76R, V125R) fue altamente efectiva para monomerizar la estreptavidina. Debido a que los residuos hidrofóbicos interfaciales están expuestos al solvente una vez que la estreptavidina es convertida a un estado monomérico, una muteína* 3 cuádruple (T76R, V125R, V55T, L109T), fue desarrollada. Las primeras dos mutaciones son para monomerización, mientras que las últimas dos mutaciones tienen como propósito mejorar la hidrofilicidad en la interfase para minimizar la agregación. La monomerización fue confirmada por 4 métodos diferentes, incluyendo filtración en gel*4, dispersión dinámica de la luz*5, sensibilidad a la proteasa k*6, y reticulación química*7. La muteína cuádruple permaneció en estado tetramérica a concentraciones mayores que 2 mg/ml. Sus parámetros cinéticos con la interacción de biotina sugieren una excelente capacidad de unión con la biotina, lo que permite que la muteína sea fácilmente purificada en una matriz biotina-agarosa. Otra muteína (D61A, W120K) fue desarrollada basada en dos mutaciones que se han visto efectivas en la monomerización de avidina*8. Esta muteína de la estreptavidina fue oligomerica en la naturaleza. Esto ilustra la importancia en seleccionar los residuos y el enfoque apropiado para una efectiva monomerización de estreptavidina. Strept-avidina con capacidad de unión de biotina reversible puede extender las aplicaciones de la tecnología de biotin-(strept) avidina. Estas moléculas pueden ser aplicadas para purificación por afinidad de biomoléculas biotiniladas, detección de ligandos ultratight (ultra “apretados”) a biomoléculas biotiniladas mostradas en el sistema de visualización de fago, desarrollo de chips como biosensores reutilizables, micro arrays de proteína/anticuerpo y biorreactores enzimáticos. 1* Estreptavidina: proteína tetramérica que se caracteriza por su elevada afinidad por la biotina. El complejo biotina-estreptavidina la muestra como una delas interacciones no-covalentes más fuertes que se conoce. Esta capacidad de unión se mantiene en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventesorgánicos, desnaturalizantes, detergentes y peptidasas. 2* Biotina: Vitamina estable al calor, soluble en agua y alcohol, y susceptible a la oxidación que interviene en el metabolismo de los hidratos decarbono, grasas, aminoácidos y purinas. Es esencial para la síntesis y degradación de grasas y la degradación de ciertos aminoácidos. 3* Muteína: Molécula proteica que resulta de una mutación. 4* Filtración en gel: Cromatografía de exclusión molecular. 5* Dispersión dinámica de la luz : Sirve para medir el tamaño (y la forma) de una molécula. 6* Proteasa K: Enzima capaz de digerir proteínas. 7* Reticulación Química: formación de una red tridimensional formada por la unión de las diferentes cadenas poliméricas. 8* Avidina: Glicoproteína tetramérica de unión a biotina producida en el oviducto de aves, reptiles y anfibios y depositada en la clara de sus huevos
  2. 2. La estrept-avidina es una molécula homotetramerica con un sitio de unión a biotina en cada sub-unidad. La estructura tridimensional de la estrept-avidina sugiere que cada sitio de unión de biotina completo requiere la contribución de un residuo de triptófano por una subunidad adyacente. Estudios dirigidos a mutagénesis también han demostrado la importancia de estos residuos para la estrecha unión de la biotina y la comunicación de subunidades. Por lo tanto, el desarrollo de monómeros de estrep- tavidina puede ser un atractivo enfoque para la ingeniera de estreptavidina con capacidad de unión reversible de biotina. La producción de estrep-tavidina a su forma monomérica es técnicamente desafiante. En el caso de la avidina la primera generación de monómeros de avidina producidos, pueden existir en estado monomérico solo en ausencia de biotina. Este problema ha sido resuelto por el reciente desarrollo de la segunda generación de monómeros de avidina, los que poseen dos mutaciones (N54A, W110K). El alineamiento estructural de avidina y estreptavidina indican que esos dos residuos corresponden a Asp- 61 y Trp-120 en estreptavidina. Sin embargo, una muteína de la estreptavidina designada AK, que posee las dos correspondientes mutaciones (N54A, W110K), no se convierte en monómeros como demuestra el presenta estudio. Esto ilustra la necesidad de identificar un nuevo grupo crítico de residuos, en combinación con enfoques efectivos para generar monómeros de estreptavidina con el mínimo de cambios mutacionales. El desarrollo de monómeros de estreptavidina ha sido reportado previamente a través de mutaciones de tres residuos de alanina. Sin embargo, la baja afinidad de esta muteína hacia la biotina (K d = 1.7 x 10-6 m) hace que sea menos que ideal para muchas aplicaciones. Para el desarrollo de mejores versiones de monómeros de estreptavidina, tres residuos (Val-55, Thr-76 y Val-125), fueron seleccionados para una mutagénesis dirigida al sitio. En combinación con la mutación L109T, una serie de simples, dobles, y cuádruples muteínas de estreptavidinas fueron creadas y producidas por el Bacillus subtilis por secreción. A medida que se va produciendo en su forma soluble sin el requerimiento de re plegamiento, su estado oligomerico puede ser rápidamente analizado por SDS-PAGE*9 usando sobrenadantes de la producción de cultivos de muteínas de estreptavidina. Las muteínas fueron purificadas y además, caracterizadas por diferentes enfoques para confirmar su estado monomérico. Los parámetros cinéticos para la unión de biotina fueron determinados por biosensores de resonancia de plasmones superficiales* 10*1 SDS-PAGE : acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Electrophoresis (Electroforesis en gel de poliacrilamida condodecilsulfato sódico) 2* Biosensores de resonancia de plasmones superficiales: fenómeno que ocurre cuando la luz se refleja de las finas películas metálicas.Una fracción de la energía de luz incidente en un ángulo definido puede interactuar con los electrones de la película metálica (plasmon) dicha interacciónreduce la intensidad de luz reflejada.
  3. 3. Tabla 1. Cebadores mutagénicos para la construcción de mutantes de estreptavidina.Codones mutados están en negrita y subrayado. Las enzimas de restricción entre paréntesis después de los mutantes serefieren al conjunto de enzimas utilizadas para la clonación. Procedimientos experimentales Construcción de estreptavidinas mutantes- diferentes mutaciones puntualesfueron introducidas en la secuencia codificante del gen sintético de estreptavidina en laexpresión del vector PSSAV-Tcry de B. subtilis por PCR basada en mutagénesis directa deoligonucleótidos. Cinco mutantes (V125R, V125T, V55R, V55T y T76R), cada una con unamutación simple que resulta en el cambio de un residuo de aminoácido como el nombresugiere, fueron construidas usando pSSAV-Tcry como la plantilla y el primer listado en laTabla 1. Los productos amplificados fueron digeridos por el par de enzimas listadas en laTabla 1, y clonados en pSSAV-Tcry. Cinco plasmidios (pV125R, pV125T, Pv55R, Pv55T yPt76R) resultaron. Dos mutaciones dobles (M2 y AK), también fueron construidas, para M2 (T76R,V125R), un fragmento digerido de ScaI/NheI de Pv125r fue usado para remplazar losfragmentos correspondientes en pT76R. Para AK (D61A, W120K), el fragmento que llevalas dos mutaciones fue amplificado por OCR usando los primers SAVD61AF y SAVW120KB(Tabla 1) y la plantilla pSSAV-Trcy. El fragmento amplificado fue digerido por XbaI(ScaI yusado para remplazar el fragmento correspondiente en pSSAV-Tcry. La construcción de M4 (T76R, V125R, V55T, L109T) involucra dos etapas (ver figurasuplementaria 1. Primero, a 164-bp el fragmento que tiene las dos mutaciones (T76R,L109T) fue amplificado usando SAVT76RF y SAVL109TB (Tabla 1), como primers y pSSAV-Tcry como plantilla. El producto amplificado fue digerido por BamHI/ScaI y usado pararemplazar el fragmento correspondiente en pV55T-T76R-L109T. En la segunda etapa unfragmento digerido de ScaI/NheI del pV125R fue usado para remplazar el fragmentocorrespondiente en pV55T-T76R-L109T para generar pV55T-T76R-L109T-V125R.
  4. 4. Producción y purificación de estreptavidina. La estreptavidina tipo salvaje fueproducida por B. subtilis WB800 (pSSAV-Tcry) cultivadas en un medio definido. La proteínasecretada fue purificada hasta homogeneidad usando intercambio catiónico seguido porcromatografía de afinidad a iminobiotina. Producción y purificación de muteína deestreptavidina sigue un esquema similar pero con dos grandes modificaciones: un mediosúper nutritivo fue usado en ves de un medio definido, y agarosa-biotina (Sigma) fueutilizada en ves de agarosa-iminobiotina como matriz de afinidad. Muestras dializadas quecontienes muteínas parcialmente purificadas fueron cargadas a una columna de 1-ml deagarosa-biotina. Muteínas de estreptavidina fueron eludidas de la columna usando 20 mMD-biotina en tampón fosfato salino (PBS; 50 mM fosfato de sodio, 100 mM NaCl, pH 7.2).La concentración de estreptavidina purificada fue determinada espectrofotométricamenteusando el coeficiente de extinción molar ya conocido a 280 nm para cada muteína. Determinación del tamaño molecular de la estreptavidina- la masa molecular de laestreptavidina purificada y sus muteínas fueron ambas estimadas por filtración en gel yestudios de dispersión dinámica de la luz. La filtración en gel fue realizada en la estaciónde trabajo Bio-Rad equipada con una columna Bio-PrepSE 100/17 que ha sido calibradacon masas moleculares de marcadores proteicos (Bio-Rad). La masa molecular tambiénfue estimada a partir del radio hidrodinámico de la muteína, siendo obtenido con undispersor dinámico de luz DynaPro MS (Soluciones proteicas), que ha sido calibrado conlisozimas. Las muestras de proteínas (2 – 3 mg/ml en PBS) fueron pasadas a través de unfiltro a 0,02 µm (Whatman Anodisc 13) inmediatamente antes de la medición. El perfil dela distribución del tamaño fue analizado usando el software Dynamics V6. Proteinasa K, digestión de estreptavidina y sus muteínas – estreptavidinas ymuteínas purificadas (monómeros de 30 µm), fueron tratadas con Proteinasa K(invitrogen, 5 µm) por 15 min a 30°C en 50 mM Tris-HCl conteniendo 5 mM CaCl2 a pH 8.0.La reacción fue detenida por precipitación con ácido tricloroacetico. Muestras hervidas deproteínas precipitadas fueron resultas mediante la reducción SDS-PAGE. El mismo análisisfue realizado con muestras de estreptavidina tratadas con biotina (1 mM deconcentración final) anterior a la digestión por Proteinasa K. Reacciones de reticulación química – reticulación química de estreptavidina y susmuteínas se llevaron a cabo usando bi-etilenglicol (succinato de succinamida)(Sulfo-EGS)(Pierce) como el agente de reticulación. Una mezcla típica de reacción (20 µl)contiene la muteína purificada (0.25 mg/ml) fue incluida en el estudio para ayudar aestablecer las condiciones optimas de reacción.
  5. 5. Análisis cinético de muteínas de estreptavidina – Los parámetros cinéticos (con ysin interacción con biotina) de muteínas de estreptavidina fueron determinados entiempo real usando biosensores BIAcoreX de resonancia de plasmones superficiales.Biotina conjugada de suero de albumina de bovino inmovilizada en un chip sensorial CM5fue usado para estudiar la reversibilidad de la unión de la biotina. Programas computaciones para el análisis de estreptavidina –Swiss-pdb fueusado para visualizar la estreptavidina (banco de códigos con información de proteínas,1SWE), analiza los residuos interfaciales, mide la distancia entre residuos y alinea laestructura de estreptavidina y avidina. Las áreas de contacto interfacial fueron calculadasusando servidores de interacción proteína - proteína y el modulo de formiga de StingMillennium suite. Los diagramas de área superficial accesible de residuos individuales enestreptavidina en tanto los estados monoméricos y tetraméricos fueron generadosusando el modulo de Dossier Protein en el Sting Millennium Suite. Resultados Selección de los principales residuos de estreptavidina por mutagénesis de sitiodirecto – Estreptavidinas tetraméricas dispuestas como un dímero de dímeros (fig. 1A). Lainterfase entre la subunidad A y B (y entre la C y la D) tiene la interacción de subunidadesmas extensa. El área de contacto interfacial entre A y B es ~ 1557 Å 2 con 17 interaccionespuente hidrógenos (H-bonding), dos salt bridges (conjunto de interacciones electrostáticase interacciones hidrogeno), y numerosas interacciones van der Waals. La interfase decontacto entre A y D también es extensiva con un área de contacto de 525 Å 2 y dosinteracciones interfaciales de puentes de hidrogeno. La interfase de interacción mas débile entre la subunidad A y C con una superficie de contacto de 171 Å 2. Para la producciónmonomérica de estreptavidina con un limitado numero de residuos mutados. Un enfoqueatractivo es introducir ambas repulsiones de carga e impedimentos estéricos a estasinterfases. Como la proteína tiene una elasticidad estructural, es vital seleccionar residuosinterfaciales locales en una superficie rígida para maximizar el efecto de repulsión decargas e impedimento estérico. Debido a que la subunidad de estreptavidina forma 8hebras antiparalelas con estructura lámina β, los residuos seleccionados deberíanlocalizarse más en las hebras β que en las regiones en lazo. Además, el residuoseleccionado en una subunidad debería localizarse muy cercano al residuo equivalente oa un residuo cargado en otra subunidad en la interfase. La examinación de residuosinterfaciales, muestran que Thr-76, Val-125 y Val-55 cumplen los criterios. Por lo tantofueron seleccionados para mutagénesis.
  6. 6. Fig. 1. Estructura de tetrámeros de estreptavidina y residuos de interfase críticos seleccionadospara mutagénesis. A. interfases de tetrámeros de estreptavidina. La subunidad A forma tresinterfases de contacto de subunidades con otras subunidades. Estas interfases incluyen A/B, A/C, yA/D. subunidades A, B, C y D están destacadas en rojo, naranjo, amarillo y verde, respectivamente.B. el entorno local del Thr-76 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre lassubunidades A y B. Thr-76 y Arg.59 en la subunidad A están destacadas en rojo y rosado,respectivamente.Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B están en negro y amarillo brillante,respectivamente. Thr-76 en la subunidad A esta a 4 Å de Thr-76 y a 3,75 Å de Arg-59 en lasubunidad B. el remplazo de Thr-76 por una arginina crearía tanto la repulsión electrostática (Arg-76 (subunidad A)-Arg-76 (subunidad B), Arg-76 (subunidad A)-Arg-59 (subunidad B), y Arg-76(subunidad B)-Arg-69 (subunidad A)) e impedimento estérico en la interfase para las subunidadesA y B. Un efecto equivalente también se genera en la interfase entre las subunidades C, y D. C. elentorno local de Val-125 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre lassubunidades A y D. Val-125 (rojo), en la subunidad A esta a 3,97 Å de Va-125 (verde) de lasubunidad D. Se encaja en una cavidad formada por Val-125 (verde) y Thr-123 (verde) de lasubunidad D. Un cambio de Val-125 por arginina creara tanto la repulsión electrostática y elimpedimento estérico en la interfase de la subunidad A/D. Lo mismo es aplicable para lainteracción de interfase de B/C. D. Entorno local de Val-55 en la subunidad A. Val 55 (Rojo)en lasubunidad A esta a 3,97 Å de Arg-59 (amarillo) en la subunidad B.
  7. 7. Efecto de mutaciones simples en la monomerización de estreptavidina- Muteínas deestreptavidina que llevan un cambio de aminoácido en el sitio seleccionado fueronproducidas en su forma soluble por B. subtilis por secreción. El Análisis del sobrenadantede los cultivos no hervidos por SDS-PAGE ofrece una rápida visión para el efecto de lamutación. Las interacciones de las subunidades más débiles resultaran en un mayorporcentaje de la muestra en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS. Debido aque la biotina puede fortalecer la interacción de las subunidades, las muestras fueronanalizadas en presencia y ausencia de biotina. El impacto de las mutaciones en lasinteracciones de las subunidades débiles siguen el siguiente orden: T76R > V125R >V125T V55R > V55T (fig.2 y tabla 2). La muteína T76R (designada M1), permaneció100% en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS, incluso en la presencia debiotina. En contraste, la mutación V55T tuvo el menor impacto con la mayoría de lasmoléculas en estado tetramérico, incluso en la ausencia de biotina. La presencia debiotina desplaza a la mayoría de las muteínas restantes (V125R, V125T, y V55R), a suestado tetramérico. Como es esperado cambiando valina por arginina ejerce un mayorimpacto que cambiando por treonina. Esto es valido tanto para Val-125 y Val-55. Efectos de múltiples mutaciones en la monomerización de estreptavidina – paradesarrollar monómero de muteínas de estreptavidina ideales que tiendan a permaneceren estado monómero a altas concentraciones de estreptavidina, y que tengan unaexcelente capacidad de unión de biotina reversible, dos muteínas mas fueron creadas. M2es la mutación doble que lleva tanto las mutaciones T76R y V125R. M4 es una mutacióncuádruple que lleva las mutaciones T76R, V125R, V55T, L109T. En estas combinaciones,los tres residuos interfaciales hidrofóbicos Val-125, Val-55 y Leu-109 fueron cambiadas apor unos hidrofílicos. La última construida es la AK, una mutación doble (D61A, W120K)que lleva dos mutaciones (equivalentes a aquellas realizadas en avidina), que handemostrado convertir tetrámeros de avidina a su estado monomérico. Como se muestraen la Fig 3. Y tabla 2, al igual que M1, todas estas muteínas existen en estado monoméricoen el gel de poliacrilamida SDS aun en presencia de biotina. Fig 2. Analisis Western Blot de sobrenadante de un cultivo de cepas de B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina llevando una sola mutación. 15 µl de muestras no hervidas de sobrenadante del cultivo fue cargado en cada banda. Las muestras en el conjunto del lado izquierdo fueron recolectadas de un cultivo de cepas de B. subtilis en un medio súper nutritivo sin la adición de biotina. El conjunto de muestras del lado derecho son de un cultivo crecido con la presencia de biotina (20 µM). La mancha fue probada con anticuerpos policlonales contra estreptavidina; -ve control, sobrenadante del cultivo de WB800 (pWB705HM) no produjeron ninguna estreptavidina
  8. 8. Purificación de muteínas de estreptavidinas – Purificación de M4 fue usada comoun ejemplo para ilustrar el proceso (Fig. 4). Proteínas parcialmente purificadas porcromatografía de intercambio iónico (banda 2) se aplicaron a una columna de agarosa-biotina. M4 puede ser rápidamente eluida afuera de la columna usando un tampón debiotina como eluyente (bandas 5 -7). Muteína de estreptavidina pura obtenida por estesimple procedimiento, después de la eliminación de la biotina por diálisis, puede ser usadopara caracterizaciones bioquímicas. Para demostrar que la diálisis puede removerefectivamente cualquier biotina unida a la muteína M4, la muestra dializada se vuelve acargar a la matriz de agarosa-biotina. Más del 95% de la muestra puede ser retenida en lacolumna y eludida afuera de la columna usando biotina (Información no mostrada). Detodas las muteínas, M1 tiende a tener una cola muy larga de tiempo durante la elución.Esto indica que M1 puede no tener la propiedad deseada de unión con biotina reversible.Por lo tanto, no se caracterizó más. Determinación del aparente peso molecular de muteínas de estreptavidina porfiltración en gel (cromatografía de exclusión molecular) – La observación de muteínas deestreptavidina 100% monomerizada usando muestras no hervidas de SDS-PAGE nosiempre reflejan fidedignamente la existencia en estado monomérico en la solucióndebido a que SDS puede promover la disociación de las subunidades. La aparente masamolecular de la estreptavidina salvaje y la tres muteínas (M2, M4, y AK), fueron estimadaspor filtración en gel (Fig. suplementaria 2A y tabla 3). La masa molecular esperada demonómeros de estreptavidina es de 16.5 kDa. M2 y M4 en la ausencia de biotinamuestran un aparente masa molecular de 19.95 y 21.87 kDa, respectivamente. Estasmasas incrementan ligeramente con la presencia de biotina. Esta información sugiere quelas muteínas son monómeros en la naturaleza por que sus masas son más pequeñas quelos dímeros de estreptavidina (33 kDa). En contraste, la muteína AK muestra una aparentemasa molecular de 56,66 kDa aun en la ausencia de biotina. Esto indica la naturalezaoligomerica de esta muteína. Fig. 2B suplementaria muestra el perfil de elución de la M4purificada (en ausencia de biotina) desde la columna de filtración en gel. La muestra(cargada a 2 mg/ml) fue eludida como un solo pico. No hay evidencias de la presencia detetrámeros de estreptavidina, que se eluyó a 30.5 min. Determinación de la masa molecular aparente de muteínas de estreptavidina pordispersión de luz dinámica. – Debido a que la aparente masa molecular de laestreptavidina tipo salvaje en ausencia de biotina es 10 kDa menos que lo esperado (56en ves de 66 kDa) fue determinada por filtración en gel, la dispersión dinámica de la luzfue usada como un segundo método para estimar la masa molecular aparente. La masamolecular aparente de la estreptavidina tipo salvaje obtenida mediante esta forma (69kDa) fue mas cercana a la esperada (66 kDa) (tabla 3). La masa molecular aparente para
  9. 9. ambos M2 y M4 en la ausencia de biotina indico que estaban en su estado monomérico.La adición de biotina solo causo un ligero incremento de su masa molecular aparente. Lamuteína AK fue se encontró que era nuevamente oligomerica, independiente de lapresencia o ausencia de biotina. Sensibilidad de la muteína de estreptavidina a la Proteinasa K - Se espera que laestreptavidina monomérica sea más susceptible a la digestión de Proteinasa K. Por lotanto, estreptavidina tipo salvaje y sus muteínas fueron tratadas con Proteinasa K (Fig.5A). La estreptavidina tipo salvaje fue convertida a su forma natural independiente de lapresencia o ausencia de biotina. Bajo las condiciones usadas, la estreptavidina natural fueademás, resistente a la degradación por Proteinasa K. En contraste, las tres muteínasincluyendo AK, M2 y M4 fueron mucho más susceptibles a la digestión por Proteinasa K.La sensibilidad a la proteasa K es mas aparente para M2 y M4, que fueron completamentedigeridas independiente de la ausencia o presencia de biotina. Esta propiedad esconsistente con la naturaleza monomérica de estas muteínas. La muteína AK se comportode manera diferente. Aunque la mayoría de estas fue digerida por la Proteinasa K en laausencia de biotina, llegaron a ser mucho mas resistentes a la proteasa K cuando labiotina estuvo presente. La reticulación de la estreptavidina y sus muteínas – Para fortalecer la idea quetanto la M2 y M4 son monoméricas mientras AK es oligomerica en la naturaleza. Lareticulación proteica fue llevada a cabo usando sulfo-EGS como agente reticulador. Sulfo-EGS reacciona con tanto el grupo α-amino accesible en los extremos N y los grupos εamino expuestos en la superficie de las cadenas laterales de lisina en la proteína. Laestreptavidina salvaje secretada tiene 8 residuos de lisina en casa subunidad. El modeloestructural tridimensional de la estreptavidina sugiere que la lisina 121 en la subunidad Aesta a 14.1 Å de la lisina 121 en la subunidad D. Como el radio espaciador en la sulfo-EGSes de 16.1 Å, subunidades A y D (las mismas que para las unidades B y C), debieran serfácilmente reticuladas por la sulfo-EGS. También es posible tener reticulación entre lassubunidades A y B como la región terminal N desde la subunidad A, la que contiene 2residuos de lisina, es probable que se posicione cerca de la lisina 80 en la subunidad B. Lomismo es valido para las subunidades C y D. Por lo tanto, uno debiera ser capaz dediferenciar la estreptavidina tetramérica de la forma monomérica con la observación de lareticulación de la estreptavidina tetramérica usando sulfo-EGS. Lisozima, bien conocida deser monomérica en solución, sirvió como control negativo. La Fig. 5B muestra que lacantidad de lisozima dimérica se incremento ligeramente con la presencia del agentereticulantes. Esto ayudo a establecer el límite superior de la concentración de sulfo-EGSpara ser usado bajo condiciones experimentales. La subunidad de estreptavidina tiposalvaje tuvo una aparente masa molecular de 19 kDa sobre el gel SDS. Después con el
  10. 10. tratamiento de sulfo-EGS se mostro que muchas de estas subunidades fueron reticuladasa dímeros y oligomeros superiores con pequeñas cantidades remanentes en estadomonomérico. Las muteínas M2 y M4 se comportaron muy similarmente (los datos paraM2 no son mostrados). La mayoría de las muteínas M2 y M4 después del tratamiento dereticulación migraron como monómeros con pequeñas cantidades en la forma dimérica.Estos dímeros pueden representar las subunidades monoméricas reticuladas que fueronartificialmente generadas de la misma forma que con lisozima. AK mostro un perfil dereticulación muy similar a aquella de la estreptavidina tipo salvaje. Estos datos sostienenfuertemente la idea que las muteínas M2 y M4 son monoméricas, mientras que lamuteína AK es oligomerica en solución.Tabla 2. Resumen de los efectos mutagénicos sobre el debilitamiento de las interaccionesde las subunidades en las muteínas de estreptavidina como reflejo del gradode monomerización de muteínas estreptavidina después de SDS-PAGE. La Estimación delporcentaje de la estreptavidina en estados monoméricos y tetraméricos esta basada en lasmanchas que muestras los patrones de migración de las muestras no hervidas en lasfiguras 2 y 3. Fig.3 Análisis de sobrenadantes de cultivos de cepas de B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina que llevan diferentes combinaciones de mutaciones. Todas estas cepas fueron cultivadas en un medio súper nutritivo suplementado con biotina (20 µM). 15 µl de sobrenadantes de un cultivo de muestras no hervidas fue cargado. A, Coomassie Blue-stained SDS- polyacrylamide gel. Las bandas correspondientes a estreptavidina monomérica y tetramérica fueron marcadas con un asterisco y una cabeza de flecha, respectivamente. B, el Western blot probo los anticuerpos policlonales contra la estreptavidina.M, marcadores de la masa molecular ;wt, estreptavidina tipo salvaje; C, control negativo
  11. 11. Fig.4 Purificación de muteínas de estreptavidina M4 usando agarosa-biotina. La muteína M4 parcialmente purificada Por cromatografía en columna Macro S (PPF), fue cargada sobre una columna de biotina-agarosa. M, marcadores de masa molecular; FT, columna de flujo;W, agrupación de fracciones de lavado; EF1-EF3, fracciones eludidas. Interacción reversible entre las muteínas de estreptavidina y la biotina – Lasvariaciones de las interacciones entre las muteínas de estreptavidina y la biotina fuerondeterminadas por biosensores BIacore de resonancia de plasmones superficiales. Comose muestra en la tabla 4 (diagramas gráficos para M4 son mostrados en la figurasuplementaria s3), M2, M4, y AK tuvieron sus constantes de disociación (K d), en el rangode 10-7M. Los rangos menores (kd) para estas muteínas, fueron casi los mismos, mientrasque el rango superior (ka) para la muteína AK fue ligeramente mas baja que la del resto.Uno de los factores que afectan el rango superior es el coeficiente de difusión (o masamolecular), de la molécula de estreptavidina. Debido a que AK es oligomerica en lanaturaleza, esto puede influir en el menor rango para esta interacción de muteína-biotina.Tabla 3. Determinación de la masa molecular de la estreptavidina tipo salvaje (wt) y susmuteínas por filtración en gel y dispersión dinámica de la luz.En la dispersión dinámica de la luz, la masa molecular estimada (M) fue calculada a travésdel radio hidrodinámico medido (R H), usando la curva de calibración de una proteína. Elpico tiene una polidispersidad menor a 15%. Teóricamente la masa molecular estaestimada a partir de la composición aminoacidica de una proteína madura.
  12. 12. DISCUSIÓNAunque la estreptavidina y la avidina tienen similares estructuras tridimensionales ypropiedades de unión a biotina, el desarrollo de estreptavidina monomérica es muchomás difícil por dos razones. Primero, la estreptavidina tiene interacciones interfaciales desubunidades más fuertes que la avidina. Son requeridas mutaciones más fuertes paradebilitar estas fuertes interacciones interfaciales. Segundo, la monomerización deestreptavidina puede resultar en la exposición de residuos hidrofóbicos en la superficieque normalmente serian sepultados en la interfase de la estreptavidina tetramérica. Estopuede afectar potencialmente la solubilidad de la estreptavidina monomérica y llevar a lareasociación de los monómeros. El problema podría ser menos dramático para la avidina,la cual es una proteína glicosilada con una cadena carbohidratada en cada una de lassubunidades de la avidina. A pesar de la dificultad, nuestro estudio ilustra que, seleccionando residuos críticoslocalizados en la superficie rígida para un estudio mutagénicos y la introducción derepulsión de cargas y el impedimento estérico en la interfase, una mutación simple (T76R)podría ser muy efectiva en el desarrollo de estreptavidina monomérica. A pesar de losugerido desde el análisis SDS-PAGE, estudios de filtraciones en gel de la muteína M1también indico que la mayoría de M1 fue eludida a una posición correspondiente a laforma monomérica (datos no mostrados).El principal inconveniente para esta muteína essu comportamiento elusivo en la columna de agarosa-biotina. El perfil de elusión tuvotípicos residuos a largo tiempo. Además, más M1 podría ser recuperada empapando lacolumna durante la noche con un buffer que contenga biotina. Esto sugiere que partes dela población de M1 tengan alta afinidad a la matriz. Para incrementar la eficiencia de la monomerización de estreptavidina, lasmuteínas M2 fueron desarrolladas combinando 2 potentes mutaciones (T65R, V125R). lainformación desde el gel de filtración, dispersión dinámica de la luz, sensibilidad a laProteinasa K, y reticulación química confirmo el estado monomérico de M2. El perfil deelusión de esta muteína desde la matriz de agarosa-biotina tuvo una mejora considerablesobre la de M1. Cuando un periodo de 30 min de incubación en columna fue permitidopara el eluyente entre la acumulación de fragmentos, cerca del 90% de M2 puede serrecuperado dentro de tres volúmenes de eluyente en la columna. Para asegurar que la muteína de estreptavidina permanezca estable en su estadomonomérico, más mutaciones fueron introducidas a M2. La interfase expuesta de AB (oCD) presentara tres residuos hidrofóbicos: Val-55, Leu-109 y Val-125. En la muteína M2,Val-125 fue cambiada por arginina. Elegimos además convertir Val-55 y Leu-109 ATreonina. Es preferible la conversión a treonina en ves de arginina debido a que proteínas
  13. 13. con alto pI son conocidas por tener interacciones no-específicas por interaccioneselectrostáticas. El pI calculado para M2 es 8.1. Si tanto, Val-55 y Leu-109 son convertidas aarginina, la muteína resultante tendrá un pI de 9.2. Esto podría incrementar probabilidadde interacciones no-especificas relacionadas con carga. La conversión de estos residuos aresiduos con carga negativa no fueron considerados porque tanto Val-55 y Leu-109 estánlocalizadas en las cadenas β, y los residuos con carga negativa son relativamente pobresen formación de cadenas β. Las muteínas M4 comparten con las muteínas M2 muchas características deseablesde un monómero de estreptavidina ideal. Ambos existen en estado monomérico a unaalta razonable concentración de proteína (2 mg/ml o más si es para estudios de dispersióndinámica de la luz). Ambos tienen excelente capacidad de unión reversible de biotina,como se reflejo en las variaciones de la interacción con biotina. Ambas tienen un pImoderado valuado en 8.1 por lo que sus interacciones no-especificas relacionadas concarga serian mínimas. Sumando a esto, M4 tiene dos características que lo hacen aun másatractivo en la práctica. Moléculas de muteína de M2 tienden a agregarse en solución. Lafiltración de M2 a través de un filtro de 0,02 µm fue esencial para obtener una buenaseñal de la muteína por estudios de la dispersión dinámica de la luz debido a la pobreseñal de detección causada por la presencia de pequeñas cantidades de grandesagregados en una muestra no filtrada. Por otra parte, una señal decente podría ser almenos obtenida con una muestra no filtrada con preparaciones similares a M4. Así, laconversión de los dos residuos hidrofóbicos (Val-55 y Leu-109) al residuo mas hidrofílicode treonina ayudo a minimizar la agregación de la muteína. Otra característica atractiva esque M4 tiene un perfil de elución notablemente agudo con su purificación usando biotina-agarosa. Sobre del 95% de la muteína puede ser rápidamente eludida fuera de la columnausando solo dos volúmenes de eluyente en la columna, dejando una alta tasa de proteínarecuperada. En el estudio de mutagénesis de sitio directo, no es difícil entender el impacto delas mutaciones en el siguiente orden: T76R > V125R > V55R. El análisis de la accesibilidaddel solvente de residuos aminoacidicos individuales con estreptavidina tetramérica indicaque área accesible al solvente de Thr-76 en la subunidad A es 0. Su distancia cercana aambos Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B y localizadas en una superficie rígida de unaestructura larga de lamina β construye un residuo ideal para ser cambiado por argininapara lograr el efecto de máxima repulsión electrostática e impedimento estérico en lainterfase de la subunidad (Fig. 1B). El área de la superficie accesible de Val-125 en lasubunidad A es de 1,78%. Tiene una extensiva interacción con Leu-109, Trp-120, Thr-123 yVal-125 en la subunidad D (Fig. 1C); Leu-109 en la subunidad B; y Gln-107 en la subunidadC. La conversión a arginina resulta en una repulsión de cargas en la subunidad D y un
  14. 14. potencial impedimento estérico para las subunidades B, C y D. Tanto para Val-55 en lasubunidad A, su área de superficie accesible es de 29,7%; y solo se acerca a Arg-59 en lasubunidad B en la interfase (Fig. 1D). Así, V55R tienen el menor impacto en lamonomerización. Aunque la muteína AK muestra propiedades de unión reversible de biotina ycomportamiento monomérico sobre el gel de poliacrilamida SDS, ciertamente existe ensolución en estado oligomerico como fue sugerido por estudios de filtración en gel,dispersión dinámica de la luz, y patrones de reticulación. Estos estudios ilustran laimportancia de seleccionar residuos críticos y enfoques efectivos para alcanzar el efectomáximo de monomerización sobre la estreptavidina tetramérica.

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