deben haber algunos errores, pero son los minimos, si no les gusta la wea, chupenla

1. Producción de estreptavidina*1 monomérica soluble con capacidad de unión reversible
de biotina*2.
Estreptavidina monomérica con capacidad de unión reversible de biotina tiene
muchas potenciales aplicaciones. Debido a que un sitio de unión completo de biotina en
cada subunidad de estreptavidina requiere la contribución de triptófano 120 de una
subunidad aledaña, la monomerización de la estreptavidina tetramérica natural puede
generar estreptavidina con una reducida afinidad de unión con biotina. Tres residuos,
valina 55, treonina 76 y valina 125, se cambiaron por cualquier arginina o treonina para
crear repulsión electroestática e impedimento estérico en las interfases. La mutación
doble (T76R, V125R) fue altamente efectiva para monomerizar la estreptavidina. Debido a
que los residuos hidrofóbicos interfaciales están expuestos al solvente una vez que la
estreptavidina es convertida a un estado monomérico, una muteína* 3 cuádruple (T76R,
V125R, V55T, L109T), fue desarrollada. Las primeras dos mutaciones son
para monomerización, mientras que las últimas dos mutaciones tienen como propósito
mejorar la hidrofilicidad en la interfase para minimizar la agregación. La monomerización
fue confirmada por 4 métodos diferentes, incluyendo filtración en gel*4, dispersión
dinámica de la luz*5, sensibilidad a la proteasa k*6, y reticulación química*7. La muteína
cuádruple permaneció en estado tetramérica a concentraciones mayores que 2 mg/ml.
Sus parámetros cinéticos con la interacción de biotina sugieren una excelente capacidad
de unión con la biotina, lo que permite que la muteína sea fácilmente purificada en una
matriz biotina-agarosa. Otra muteína (D61A, W120K) fue desarrollada basada en dos
mutaciones que se han visto efectivas en la monomerización de avidina*8. Esta muteína
de la estreptavidina fue oligomerica en la naturaleza. Esto ilustra la importancia en
seleccionar los residuos y el enfoque apropiado para una efectiva monomerización de
estreptavidina.
Strept-avidina con capacidad de unión de biotina reversible puede extender las
aplicaciones de la tecnología de biotin-(strept) avidina. Estas moléculas pueden ser
aplicadas para purificación por afinidad de biomoléculas biotiniladas, detección de
ligandos ultratight (ultra “apretados”) a biomoléculas biotiniladas mostradas en el sistema
de visualización de fago, desarrollo de chips como biosensores reutilizables, micro arrays
de proteína/anticuerpo y biorreactores enzimáticos.
1
* Estreptavidina: proteína tetramérica que se caracteriza por su elevada afinidad por la biotina. El complejo biotina-estreptavidina la muestra como una de
las interacciones no-covalentes más fuertes que se conoce. Esta capacidad de unión se mantiene en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventes
orgánicos, desnaturalizantes, detergentes y peptidasas.
2
* Biotina: Vitamina estable al calor, soluble en agua y alcohol, y susceptible a la oxidación que interviene en el metabolismo de los hidratos de
carbono, grasas, aminoácidos y purinas. Es esencial para la síntesis y degradación de grasas y la degradación de ciertos aminoácidos.
3
* Muteína: Molécula proteica que resulta de una mutación.
4
* Filtración en gel: Cromatografía de exclusión molecular.
5
* Dispersión dinámica de la luz : Sirve para medir el tamaño (y la forma) de una molécula.
6
* Proteasa K: Enzima capaz de digerir proteínas.
7
* Reticulación Química: formación de una red tridimensional formada por la unión de las diferentes cadenas poliméricas.
8
* Avidina: Glicoproteína tetramérica de unión a biotina producida en el oviducto de aves, reptiles y anfibios y depositada en la clara de sus huevos

2. La estrept-avidina es una molécula homotetramerica con un sitio de unión a
biotina en cada sub-unidad. La estructura tridimensional de la estrept-avidina sugiere que
cada sitio de unión de biotina completo requiere la contribución de un residuo de
triptófano por una subunidad adyacente. Estudios dirigidos a mutagénesis también han
demostrado la importancia de estos residuos para la estrecha unión de la biotina y la
comunicación de subunidades. Por lo tanto, el desarrollo de monómeros de estrep-
tavidina puede ser un atractivo enfoque para la ingeniera de estreptavidina con capacidad
de unión reversible de biotina.
La producción de estrep-tavidina a su forma monomérica es técnicamente
desafiante. En el caso de la avidina la primera generación de monómeros de avidina
producidos, pueden existir en estado monomérico solo en ausencia de biotina. Este
problema ha sido resuelto por el reciente desarrollo de la segunda generación de
monómeros de avidina, los que poseen dos mutaciones (N54A, W110K). El alineamiento
estructural de avidina y estreptavidina indican que esos dos residuos corresponden a Asp-
61 y Trp-120 en estreptavidina. Sin embargo, una muteína de la estreptavidina designada
AK, que posee las dos correspondientes mutaciones (N54A, W110K), no se convierte en
monómeros como demuestra el presenta estudio. Esto ilustra la necesidad de identificar
un nuevo grupo crítico de residuos, en combinación con enfoques efectivos para generar
monómeros de estreptavidina con el mínimo de cambios mutacionales. El desarrollo de
monómeros de estreptavidina ha sido reportado previamente a través de mutaciones de
tres residuos de alanina. Sin embargo, la baja afinidad de esta muteína hacia la biotina (K d
= 1.7 x 10-6 m) hace que sea menos que ideal para muchas aplicaciones.
Para el desarrollo de mejores versiones de monómeros de estreptavidina, tres
residuos (Val-55, Thr-76 y Val-125), fueron seleccionados para una mutagénesis dirigida al
sitio. En combinación con la mutación L109T, una serie de simples, dobles, y cuádruples
muteínas de estreptavidinas fueron creadas y producidas por el Bacillus subtilis por
secreción.
A medida que se va produciendo en su forma soluble sin el requerimiento de re
plegamiento, su estado oligomerico puede ser rápidamente analizado por SDS-PAGE*9
usando sobrenadantes de la producción de cultivos de muteínas de estreptavidina. Las
muteínas fueron purificadas y además, caracterizadas por diferentes enfoques para
confirmar su estado monomérico. Los parámetros cinéticos para la unión de biotina
fueron determinados por biosensores de resonancia de plasmones superficiales* 10
*1 SDS-PAGE : acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Electrophoresis (Electroforesis en gel de poliacrilamida condodecilsulfato sódico)
2
* Biosensores de resonancia de plasmones superficiales: fenómeno que ocurre cuando la luz se refleja de las finas películas metálicas.
Una fracción de la energía de luz incidente en un ángulo definido puede interactuar con los electrones de la película metálica (plasmon) dicha interacción
reduce la intensidad de luz reflejada.

3. Tabla 1. Cebadores mutagénicos para la construcción de mutantes de estreptavidina.
Codones mutados están en negrita y subrayado. Las enzimas de restricción entre paréntesis después de los mutantes se
refieren al conjunto de enzimas utilizadas para la clonación.
Procedimientos experimentales
Construcción de estreptavidinas mutantes- diferentes mutaciones puntuales
fueron introducidas en la secuencia codificante del gen sintético de estreptavidina en la
expresión del vector PSSAV-Tcry de B. subtilis por PCR basada en mutagénesis directa de
oligonucleótidos. Cinco mutantes (V125R, V125T, V55R, V55T y T76R), cada una con una
mutación simple que resulta en el cambio de un residuo de aminoácido como el nombre
sugiere, fueron construidas usando pSSAV-Tcry como la plantilla y el primer listado en la
Tabla 1. Los productos amplificados fueron digeridos por el par de enzimas listadas en la
Tabla 1, y clonados en pSSAV-Tcry. Cinco plasmidios (pV125R, pV125T, Pv55R, Pv55T y
Pt76R) resultaron.
Dos mutaciones dobles (M2 y AK), también fueron construidas, para M2 (T76R,
V125R), un fragmento digerido de ScaI/NheI de Pv125r fue usado para remplazar los
fragmentos correspondientes en pT76R. Para AK (D61A, W120K), el fragmento que lleva
las dos mutaciones fue amplificado por OCR usando los primers SAVD61AF y SAVW120KB
(Tabla 1) y la plantilla pSSAV-Trcy. El fragmento amplificado fue digerido por XbaI(ScaI y
usado para remplazar el fragmento correspondiente en pSSAV-Tcry.
La construcción de M4 (T76R, V125R, V55T, L109T) involucra dos etapas (ver figura
suplementaria 1. Primero, a 164-bp el fragmento que tiene las dos mutaciones (T76R,
L109T) fue amplificado usando SAVT76RF y SAVL109TB (Tabla 1), como primers y pSSAV-
Tcry como plantilla. El producto amplificado fue digerido por BamHI/ScaI y usado para
remplazar el fragmento correspondiente en pV55T-T76R-L109T. En la segunda etapa un
fragmento digerido de ScaI/NheI del pV125R fue usado para remplazar el fragmento
correspondiente en pV55T-T76R-L109T para generar pV55T-T76R-L109T-V125R.

4. Producción y purificación de estreptavidina. La estreptavidina tipo salvaje fue
producida por B. subtilis WB800 (pSSAV-Tcry) cultivadas en un medio definido. La proteína
secretada fue purificada hasta homogeneidad usando intercambio catiónico seguido por
cromatografía de afinidad a iminobiotina. Producción y purificación de muteína de
estreptavidina sigue un esquema similar pero con dos grandes modificaciones: un medio
súper nutritivo fue usado en ves de un medio definido, y agarosa-biotina (Sigma) fue
utilizada en ves de agarosa-iminobiotina como matriz de afinidad. Muestras dializadas que
contienes muteínas parcialmente purificadas fueron cargadas a una columna de 1-ml de
agarosa-biotina. Muteínas de estreptavidina fueron eludidas de la columna usando 20 mM
D-biotina en tampón fosfato salino (PBS; 50 mM fosfato de sodio, 100 mM NaCl, pH 7.2).
La concentración de estreptavidina purificada fue determinada espectrofotométricamente
usando el coeficiente de extinción molar ya conocido a 280 nm para cada muteína.
Determinación del tamaño molecular de la estreptavidina- la masa molecular de la
estreptavidina purificada y sus muteínas fueron ambas estimadas por filtración en gel y
estudios de dispersión dinámica de la luz. La filtración en gel fue realizada en la estación
de trabajo Bio-Rad equipada con una columna Bio-PrepSE 100/17 que ha sido calibrada
con masas moleculares de marcadores proteicos (Bio-Rad). La masa molecular también
fue estimada a partir del radio hidrodinámico de la muteína, siendo obtenido con un
dispersor dinámico de luz DynaPro MS (Soluciones proteicas), que ha sido calibrado con
lisozimas. Las muestras de proteínas (2 – 3 mg/ml en PBS) fueron pasadas a través de un
filtro a 0,02 µm (Whatman Anodisc 13) inmediatamente antes de la medición. El perfil de
la distribución del tamaño fue analizado usando el software Dynamics V6.
Proteinasa K, digestión de estreptavidina y sus muteínas – estreptavidinas y
muteínas purificadas (monómeros de 30 µm), fueron tratadas con Proteinasa K
(invitrogen, 5 µm) por 15 min a 30°C en 50 mM Tris-HCl conteniendo 5 mM CaCl2 a pH 8.0.
La reacción fue detenida por precipitación con ácido tricloroacetico. Muestras hervidas de
proteínas precipitadas fueron resultas mediante la reducción SDS-PAGE. El mismo análisis
fue realizado con muestras de estreptavidina tratadas con biotina (1 mM de
concentración final) anterior a la digestión por Proteinasa K.
Reacciones de reticulación química – reticulación química de estreptavidina y sus
muteínas se llevaron a cabo usando bi-etilenglicol (succinato de succinamida)(Sulfo-
EGS)(Pierce) como el agente de reticulación. Una mezcla típica de reacción (20 µl)
contiene la muteína purificada (0.25 mg/ml) fue incluida en el estudio para ayudar a
establecer las condiciones optimas de reacción.

5. Análisis cinético de muteínas de estreptavidina – Los parámetros cinéticos (con y
sin interacción con biotina) de muteínas de estreptavidina fueron determinados en
tiempo real usando biosensores BIAcoreX de resonancia de plasmones superficiales.
Biotina conjugada de suero de albumina de bovino inmovilizada en un chip sensorial CM5
fue usado para estudiar la reversibilidad de la unión de la biotina.
Programas computaciones para el análisis de estreptavidina –Swiss-pdb fue
usado para visualizar la estreptavidina (banco de códigos con información de proteínas,
1SWE), analiza los residuos interfaciales, mide la distancia entre residuos y alinea la
estructura de estreptavidina y avidina. Las áreas de contacto interfacial fueron calculadas
usando servidores de interacción proteína - proteína y el modulo de formiga de Sting
Millennium suite. Los diagramas de área superficial accesible de residuos individuales en
estreptavidina en tanto los estados monoméricos y tetraméricos fueron generados
usando el modulo de Dossier Protein en el Sting Millennium Suite.
Resultados
Selección de los principales residuos de estreptavidina por mutagénesis de sitio
directo – Estreptavidinas tetraméricas dispuestas como un dímero de dímeros (fig. 1A). La
interfase entre la subunidad A y B (y entre la C y la D) tiene la interacción de subunidades
mas extensa. El área de contacto interfacial entre A y B es ~ 1557 Å 2 con 17 interacciones
puente hidrógenos (H-bonding), dos salt bridges (conjunto de interacciones electrostáticas
e interacciones hidrogeno), y numerosas interacciones van der Waals. La interfase de
contacto entre A y D también es extensiva con un área de contacto de 525 Å 2 y dos
interacciones interfaciales de puentes de hidrogeno. La interfase de interacción mas débil
e entre la subunidad A y C con una superficie de contacto de 171 Å 2. Para la producción
monomérica de estreptavidina con un limitado numero de residuos mutados. Un enfoque
atractivo es introducir ambas repulsiones de carga e impedimentos estéricos a estas
interfases. Como la proteína tiene una elasticidad estructural, es vital seleccionar residuos
interfaciales locales en una superficie rígida para maximizar el efecto de repulsión de
cargas e impedimento estérico. Debido a que la subunidad de estreptavidina forma 8
hebras antiparalelas con estructura lámina β, los residuos seleccionados deberían
localizarse más en las hebras β que en las regiones en lazo. Además, el residuo
seleccionado en una subunidad debería localizarse muy cercano al residuo equivalente o
a un residuo cargado en otra subunidad en la interfase. La examinación de residuos
interfaciales, muestran que Thr-76, Val-125 y Val-55 cumplen los criterios. Por lo tanto
fueron seleccionados para mutagénesis.

6. Fig. 1. Estructura de tetrámeros de estreptavidina y residuos de interfase críticos seleccionados
para mutagénesis. A. interfases de tetrámeros de estreptavidina. La subunidad A forma tres
interfases de contacto de subunidades con otras subunidades. Estas interfases incluyen A/B, A/C, y
A/D. subunidades A, B, C y D están destacadas en rojo, naranjo, amarillo y verde, respectivamente.
B. el entorno local del Thr-76 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre las
subunidades A y B. Thr-76 y Arg.59 en la subunidad A están destacadas en rojo y rosado,
respectivamente.Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B están en negro y amarillo brillante,
respectivamente. Thr-76 en la subunidad A esta a 4 Å de Thr-76 y a 3,75 Å de Arg-59 en la
subunidad B. el remplazo de Thr-76 por una arginina crearía tanto la repulsión electrostática (Arg-
76 (subunidad A)-Arg-76 (subunidad B), Arg-76 (subunidad A)-Arg-59 (subunidad B), y Arg-76
(subunidad B)-Arg-69 (subunidad A)) e impedimento estérico en la interfase para las subunidades
A y B. Un efecto equivalente también se genera en la interfase entre las subunidades C, y D. C. el
entorno local de Val-125 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre las
subunidades A y D. Val-125 (rojo), en la subunidad A esta a 3,97 Å de Va-125 (verde) de la
subunidad D. Se encaja en una cavidad formada por Val-125 (verde) y Thr-123 (verde) de la
subunidad D. Un cambio de Val-125 por arginina creara tanto la repulsión electrostática y el
impedimento estérico en la interfase de la subunidad A/D. Lo mismo es aplicable para la
interacción de interfase de B/C. D. Entorno local de Val-55 en la subunidad A. Val 55 (Rojo)en la
subunidad A esta a 3,97 Å de Arg-59 (amarillo) en la subunidad B.

7. Efecto de mutaciones simples en la monomerización de estreptavidina- Muteínas de
estreptavidina que llevan un cambio de aminoácido en el sitio seleccionado fueron
producidas en su forma soluble por B. subtilis por secreción. El Análisis del sobrenadante
de los cultivos no hervidos por SDS-PAGE ofrece una rápida visión para el efecto de la
mutación. Las interacciones de las subunidades más débiles resultaran en un mayor
porcentaje de la muestra en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS. Debido a
que la biotina puede fortalecer la interacción de las subunidades, las muestras fueron
analizadas en presencia y ausencia de biotina. El impacto de las mutaciones en las
interacciones de las subunidades débiles siguen el siguiente orden: T76R > V125R >
V125T V55R > V55T (fig.2 y tabla 2). La muteína T76R (designada M1), permaneció
100% en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS, incluso en la presencia de
biotina. En contraste, la mutación V55T tuvo el menor impacto con la mayoría de las
moléculas en estado tetramérico, incluso en la ausencia de biotina. La presencia de
biotina desplaza a la mayoría de las muteínas restantes (V125R, V125T, y V55R), a su
estado tetramérico. Como es esperado cambiando valina por arginina ejerce un mayor
impacto que cambiando por treonina. Esto es valido tanto para Val-125 y Val-55.
Efectos de múltiples mutaciones en la monomerización de estreptavidina – para
desarrollar monómero de muteínas de estreptavidina ideales que tiendan a permanecer
en estado monómero a altas concentraciones de estreptavidina, y que tengan una
excelente capacidad de unión de biotina reversible, dos muteínas mas fueron creadas. M2
es la mutación doble que lleva tanto las mutaciones T76R y V125R. M4 es una mutación
cuádruple que lleva las mutaciones T76R, V125R, V55T, L109T. En estas combinaciones,
los tres residuos interfaciales hidrofóbicos Val-125, Val-55 y Leu-109 fueron cambiadas a
por unos hidrofílicos. La última construida es la AK, una mutación doble (D61A, W120K)
que lleva dos mutaciones (equivalentes a aquellas realizadas en avidina), que han
demostrado convertir tetrámeros de avidina a su estado monomérico. Como se muestra
en la Fig 3. Y tabla 2, al igual que M1, todas estas muteínas existen en estado monomérico
en el gel de poliacrilamida SDS aun en presencia de biotina.
Fig 2. Analisis Western Blot de sobrenadante de un cultivo de
cepas de B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina
llevando una sola mutación. 15 µl de muestras no hervidas de
sobrenadante del cultivo fue cargado en cada banda. Las
muestras en el conjunto del lado izquierdo fueron recolectadas
de un cultivo de cepas de B. subtilis en un medio súper nutritivo
sin la adición de biotina. El conjunto de muestras del lado
derecho son de un cultivo crecido con la presencia de biotina (20
µM). La mancha fue probada con anticuerpos policlonales contra
estreptavidina; -ve control, sobrenadante del cultivo de WB800
(pWB705HM) no produjeron ninguna estreptavidina

8. Purificación de muteínas de estreptavidinas – Purificación de M4 fue usada como
un ejemplo para ilustrar el proceso (Fig. 4). Proteínas parcialmente purificadas por
cromatografía de intercambio iónico (banda 2) se aplicaron a una columna de agarosa-
biotina. M4 puede ser rápidamente eluida afuera de la columna usando un tampón de
biotina como eluyente (bandas 5 -7). Muteína de estreptavidina pura obtenida por este
simple procedimiento, después de la eliminación de la biotina por diálisis, puede ser usado
para caracterizaciones bioquímicas. Para demostrar que la diálisis puede remover
efectivamente cualquier biotina unida a la muteína M4, la muestra dializada se vuelve a
cargar a la matriz de agarosa-biotina. Más del 95% de la muestra puede ser retenida en la
columna y eludida afuera de la columna usando biotina (Información no mostrada). De
todas las muteínas, M1 tiende a tener una cola muy larga de tiempo durante la elución.
Esto indica que M1 puede no tener la propiedad deseada de unión con biotina reversible.
Por lo tanto, no se caracterizó más.
Determinación del aparente peso molecular de muteínas de estreptavidina por
filtración en gel (cromatografía de exclusión molecular) – La observación de muteínas de
estreptavidina 100% monomerizada usando muestras no hervidas de SDS-PAGE no
siempre reflejan fidedignamente la existencia en estado monomérico en la solución
debido a que SDS puede promover la disociación de las subunidades. La aparente masa
molecular de la estreptavidina salvaje y la tres muteínas (M2, M4, y AK), fueron estimadas
por filtración en gel (Fig. suplementaria 2A y tabla 3). La masa molecular esperada de
monómeros de estreptavidina es de 16.5 kDa. M2 y M4 en la ausencia de biotina
muestran un aparente masa molecular de 19.95 y 21.87 kDa, respectivamente. Estas
masas incrementan ligeramente con la presencia de biotina. Esta información sugiere que
las muteínas son monómeros en la naturaleza por que sus masas son más pequeñas que
los dímeros de estreptavidina (33 kDa). En contraste, la muteína AK muestra una aparente
masa molecular de 56,66 kDa aun en la ausencia de biotina. Esto indica la naturaleza
oligomerica de esta muteína. Fig. 2B suplementaria muestra el perfil de elución de la M4
purificada (en ausencia de biotina) desde la columna de filtración en gel. La muestra
(cargada a 2 mg/ml) fue eludida como un solo pico. No hay evidencias de la presencia de
tetrámeros de estreptavidina, que se eluyó a 30.5 min.
Determinación de la masa molecular aparente de muteínas de estreptavidina por
dispersión de luz dinámica. – Debido a que la aparente masa molecular de la
estreptavidina tipo salvaje en ausencia de biotina es 10 kDa menos que lo esperado (56
en ves de 66 kDa) fue determinada por filtración en gel, la dispersión dinámica de la luz
fue usada como un segundo método para estimar la masa molecular aparente. La masa
molecular aparente de la estreptavidina tipo salvaje obtenida mediante esta forma (69
kDa) fue mas cercana a la esperada (66 kDa) (tabla 3). La masa molecular aparente para

9. ambos M2 y M4 en la ausencia de biotina indico que estaban en su estado monomérico.
La adición de biotina solo causo un ligero incremento de su masa molecular aparente. La
muteína AK fue se encontró que era nuevamente oligomerica, independiente de la
presencia o ausencia de biotina.
Sensibilidad de la muteína de estreptavidina a la Proteinasa K - Se espera que la
estreptavidina monomérica sea más susceptible a la digestión de Proteinasa K. Por lo
tanto, estreptavidina tipo salvaje y sus muteínas fueron tratadas con Proteinasa K (Fig.
5A). La estreptavidina tipo salvaje fue convertida a su forma natural independiente de la
presencia o ausencia de biotina. Bajo las condiciones usadas, la estreptavidina natural fue
además, resistente a la degradación por Proteinasa K. En contraste, las tres muteínas
incluyendo AK, M2 y M4 fueron mucho más susceptibles a la digestión por Proteinasa K.
La sensibilidad a la proteasa K es mas aparente para M2 y M4, que fueron completamente
digeridas independiente de la ausencia o presencia de biotina. Esta propiedad es
consistente con la naturaleza monomérica de estas muteínas. La muteína AK se comporto
de manera diferente. Aunque la mayoría de estas fue digerida por la Proteinasa K en la
ausencia de biotina, llegaron a ser mucho mas resistentes a la proteasa K cuando la
biotina estuvo presente.
La reticulación de la estreptavidina y sus muteínas – Para fortalecer la idea que
tanto la M2 y M4 son monoméricas mientras AK es oligomerica en la naturaleza. La
reticulación proteica fue llevada a cabo usando sulfo-EGS como agente reticulador. Sulfo-
EGS reacciona con tanto el grupo α-amino accesible en los extremos N y los grupos ε
amino expuestos en la superficie de las cadenas laterales de lisina en la proteína. La
estreptavidina salvaje secretada tiene 8 residuos de lisina en casa subunidad. El modelo
estructural tridimensional de la estreptavidina sugiere que la lisina 121 en la subunidad A
esta a 14.1 Å de la lisina 121 en la subunidad D. Como el radio espaciador en la sulfo-EGS
es de 16.1 Å, subunidades A y D (las mismas que para las unidades B y C), debieran ser
fácilmente reticuladas por la sulfo-EGS. También es posible tener reticulación entre las
subunidades A y B como la región terminal N desde la subunidad A, la que contiene 2
residuos de lisina, es probable que se posicione cerca de la lisina 80 en la subunidad B. Lo
mismo es valido para las subunidades C y D. Por lo tanto, uno debiera ser capaz de
diferenciar la estreptavidina tetramérica de la forma monomérica con la observación de la
reticulación de la estreptavidina tetramérica usando sulfo-EGS. Lisozima, bien conocida de
ser monomérica en solución, sirvió como control negativo. La Fig. 5B muestra que la
cantidad de lisozima dimérica se incremento ligeramente con la presencia del agente
reticulantes. Esto ayudo a establecer el límite superior de la concentración de sulfo-EGS
para ser usado bajo condiciones experimentales. La subunidad de estreptavidina tipo
salvaje tuvo una aparente masa molecular de 19 kDa sobre el gel SDS. Después con el

10. tratamiento de sulfo-EGS se mostro que muchas de estas subunidades fueron reticuladas
a dímeros y oligomeros superiores con pequeñas cantidades remanentes en estado
monomérico. Las muteínas M2 y M4 se comportaron muy similarmente (los datos para
M2 no son mostrados). La mayoría de las muteínas M2 y M4 después del tratamiento de
reticulación migraron como monómeros con pequeñas cantidades en la forma dimérica.
Estos dímeros pueden representar las subunidades monoméricas reticuladas que fueron
artificialmente generadas de la misma forma que con lisozima. AK mostro un perfil de
reticulación muy similar a aquella de la estreptavidina tipo salvaje. Estos datos sostienen
fuertemente la idea que las muteínas M2 y M4 son monoméricas, mientras que la
muteína AK es oligomerica en solución.
Tabla 2. Resumen de los efectos mutagénicos sobre el debilitamiento de las interacciones
de las subunidades en las muteínas de estreptavidina como reflejo del grado
de monomerización de muteínas estreptavidina después de SDS-PAGE. La Estimación del
porcentaje de la estreptavidina en estados monoméricos y tetraméricos esta basada en las
manchas que muestras los patrones de migración de las muestras no hervidas en las
figuras 2 y 3.
Fig.3 Análisis de sobrenadantes de cultivos de cepas de
B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina que
llevan diferentes combinaciones de mutaciones. Todas
estas cepas fueron cultivadas en un medio súper
nutritivo suplementado con biotina (20 µM). 15 µl de
sobrenadantes de un cultivo de muestras no hervidas
fue cargado. A, Coomassie Blue-stained SDS-
polyacrylamide gel. Las bandas correspondientes a
estreptavidina monomérica y tetramérica fueron
marcadas con un asterisco y una cabeza de flecha,
respectivamente. B, el Western blot probo los
anticuerpos policlonales contra la
estreptavidina.M, marcadores de la masa
molecular ;wt, estreptavidina tipo salvaje; C,
control negativo

11. Fig.4 Purificación de muteínas de estreptavidina M4
usando agarosa-biotina. La muteína M4
parcialmente purificada Por cromatografía en
columna Macro S (PPF), fue cargada sobre una
columna de biotina-agarosa. M, marcadores de masa
molecular; FT, columna de flujo;W, agrupación de
fracciones de lavado; EF1-EF3, fracciones eludidas.
Interacción reversible entre las muteínas de estreptavidina y la biotina – Las
variaciones de las interacciones entre las muteínas de estreptavidina y la biotina fueron
determinadas por biosensores BIacore de resonancia de plasmones superficiales. Como
se muestra en la tabla 4 (diagramas gráficos para M4 son mostrados en la figura
suplementaria s3), M2, M4, y AK tuvieron sus constantes de disociación (K d), en el rango
de 10-7M. Los rangos menores (kd) para estas muteínas, fueron casi los mismos, mientras
que el rango superior (ka) para la muteína AK fue ligeramente mas baja que la del resto.
Uno de los factores que afectan el rango superior es el coeficiente de difusión (o masa
molecular), de la molécula de estreptavidina. Debido a que AK es oligomerica en la
naturaleza, esto puede influir en el menor rango para esta interacción de muteína-biotina.
Tabla 3. Determinación de la masa molecular de la estreptavidina tipo salvaje (wt) y sus
muteínas por filtración en gel y dispersión dinámica de la luz.
En la dispersión dinámica de la luz, la masa molecular estimada (M) fue calculada a través
del radio hidrodinámico medido (R H), usando la curva de calibración de una proteína. El
pico tiene una polidispersidad menor a 15%. Teóricamente la masa molecular esta
estimada a partir de la composición aminoacidica de una proteína madura.

12. DISCUSIÓN
Aunque la estreptavidina y la avidina tienen similares estructuras tridimensionales y
propiedades de unión a biotina, el desarrollo de estreptavidina monomérica es mucho
más difícil por dos razones. Primero, la estreptavidina tiene interacciones interfaciales de
subunidades más fuertes que la avidina. Son requeridas mutaciones más fuertes para
debilitar estas fuertes interacciones interfaciales. Segundo, la monomerización de
estreptavidina puede resultar en la exposición de residuos hidrofóbicos en la superficie
que normalmente serian sepultados en la interfase de la estreptavidina tetramérica. Esto
puede afectar potencialmente la solubilidad de la estreptavidina monomérica y llevar a la
reasociación de los monómeros. El problema podría ser menos dramático para la avidina,
la cual es una proteína glicosilada con una cadena carbohidratada en cada una de las
subunidades de la avidina.
A pesar de la dificultad, nuestro estudio ilustra que, seleccionando residuos críticos
localizados en la superficie rígida para un estudio mutagénicos y la introducción de
repulsión de cargas y el impedimento estérico en la interfase, una mutación simple (T76R)
podría ser muy efectiva en el desarrollo de estreptavidina monomérica. A pesar de lo
sugerido desde el análisis SDS-PAGE, estudios de filtraciones en gel de la muteína M1
también indico que la mayoría de M1 fue eludida a una posición correspondiente a la
forma monomérica (datos no mostrados).El principal inconveniente para esta muteína es
su comportamiento elusivo en la columna de agarosa-biotina. El perfil de elusión tuvo
típicos residuos a largo tiempo. Además, más M1 podría ser recuperada empapando la
columna durante la noche con un buffer que contenga biotina. Esto sugiere que partes de
la población de M1 tengan alta afinidad a la matriz.
Para incrementar la eficiencia de la monomerización de estreptavidina, las
muteínas M2 fueron desarrolladas combinando 2 potentes mutaciones (T65R, V125R). la
información desde el gel de filtración, dispersión dinámica de la luz, sensibilidad a la
Proteinasa K, y reticulación química confirmo el estado monomérico de M2. El perfil de
elusión de esta muteína desde la matriz de agarosa-biotina tuvo una mejora considerable
sobre la de M1. Cuando un periodo de 30 min de incubación en columna fue permitido
para el eluyente entre la acumulación de fragmentos, cerca del 90% de M2 puede ser
recuperado dentro de tres volúmenes de eluyente en la columna.
Para asegurar que la muteína de estreptavidina permanezca estable en su estado
monomérico, más mutaciones fueron introducidas a M2. La interfase expuesta de AB (o
CD) presentara tres residuos hidrofóbicos: Val-55, Leu-109 y Val-125. En la muteína M2,
Val-125 fue cambiada por arginina. Elegimos además convertir Val-55 y Leu-109 A
Treonina. Es preferible la conversión a treonina en ves de arginina debido a que proteínas

13. con alto pI son conocidas por tener interacciones no-específicas por interacciones
electrostáticas. El pI calculado para M2 es 8.1. Si tanto, Val-55 y Leu-109 son convertidas a
arginina, la muteína resultante tendrá un pI de 9.2. Esto podría incrementar probabilidad
de interacciones no-especificas relacionadas con carga. La conversión de estos residuos a
residuos con carga negativa no fueron considerados porque tanto Val-55 y Leu-109 están
localizadas en las cadenas β, y los residuos con carga negativa son relativamente pobres
en formación de cadenas β.
Las muteínas M4 comparten con las muteínas M2 muchas características deseables
de un monómero de estreptavidina ideal. Ambos existen en estado monomérico a una
alta razonable concentración de proteína (2 mg/ml o más si es para estudios de dispersión
dinámica de la luz). Ambos tienen excelente capacidad de unión reversible de biotina,
como se reflejo en las variaciones de la interacción con biotina. Ambas tienen un pI
moderado valuado en 8.1 por lo que sus interacciones no-especificas relacionadas con
carga serian mínimas. Sumando a esto, M4 tiene dos características que lo hacen aun más
atractivo en la práctica. Moléculas de muteína de M2 tienden a agregarse en solución. La
filtración de M2 a través de un filtro de 0,02 µm fue esencial para obtener una buena
señal de la muteína por estudios de la dispersión dinámica de la luz debido a la pobre
señal de detección causada por la presencia de pequeñas cantidades de grandes
agregados en una muestra no filtrada. Por otra parte, una señal decente podría ser al
menos obtenida con una muestra no filtrada con preparaciones similares a M4. Así, la
conversión de los dos residuos hidrofóbicos (Val-55 y Leu-109) al residuo mas hidrofílico
de treonina ayudo a minimizar la agregación de la muteína. Otra característica atractiva es
que M4 tiene un perfil de elución notablemente agudo con su purificación usando biotina-
agarosa. Sobre del 95% de la muteína puede ser rápidamente eludida fuera de la columna
usando solo dos volúmenes de eluyente en la columna, dejando una alta tasa de proteína
recuperada.
En el estudio de mutagénesis de sitio directo, no es difícil entender el impacto de
las mutaciones en el siguiente orden: T76R > V125R > V55R. El análisis de la accesibilidad
del solvente de residuos aminoacidicos individuales con estreptavidina tetramérica indica
que área accesible al solvente de Thr-76 en la subunidad A es 0. Su distancia cercana a
ambos Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B y localizadas en una superficie rígida de una
estructura larga de lamina β construye un residuo ideal para ser cambiado por arginina
para lograr el efecto de máxima repulsión electrostática e impedimento estérico en la
interfase de la subunidad (Fig. 1B). El área de la superficie accesible de Val-125 en la
subunidad A es de 1,78%. Tiene una extensiva interacción con Leu-109, Trp-120, Thr-123 y
Val-125 en la subunidad D (Fig. 1C); Leu-109 en la subunidad B; y Gln-107 en la subunidad
C. La conversión a arginina resulta en una repulsión de cargas en la subunidad D y un

14. potencial impedimento estérico para las subunidades B, C y D. Tanto para Val-55 en la
subunidad A, su área de superficie accesible es de 29,7%; y solo se acerca a Arg-59 en la
subunidad B en la interfase (Fig. 1D). Así, V55R tienen el menor impacto en la
monomerización.
Aunque la muteína AK muestra propiedades de unión reversible de biotina y
comportamiento monomérico sobre el gel de poliacrilamida SDS, ciertamente existe en
solución en estado oligomerico como fue sugerido por estudios de filtración en gel,
dispersión dinámica de la luz, y patrones de reticulación. Estos estudios ilustran la
importancia de seleccionar residuos críticos y enfoques efectivos para alcanzar el efecto
máximo de monomerización sobre la estreptavidina tetramérica.