Memorias 2013 - 5a Conferencia Científica Anual sobre Síndrome Metabólico - Presentación Tabajos Libres Orales - MÓDULO: RESISTENCIA A LA INSULINA Y SÍNDROME METABÓLICO - Análisis de vías de señalización asociadas a síndrome metabólico * Claudia Hallal C., Alejandro Nieto R., Jorge A. García D., David Escárcega C., Diana García (Facultad de Farmacia, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Instituto Tecnólogico y de Estudios Superiores de Monterrey)

1. Dra. Claudia Hallal Calleros
ANÁLISIS DE VÍAS DE
SEÑALIZACIÓN ASOCIADAS A
SÍNDROME METABÓLICO

2. Regulación de procesos celulares
 Diferenciación, crecimiento, sobrevivencia,
muerte.
 Activados por diversos estímulos.
 Finamente regulados en el organismo.
 En esta regulación están involucradas
múltiples vías de señalización que se
integran en redes moleculares complejas
 Entender el funcionamiento y el
comportamiento de las redes biológicas
permite el desarrollo de fármacos y métodos
diagnósticos.

3. SÍNDROME METABÓLICO
 La complejidad multifactorial del SM da
como resultado la alteración de muchas
moléculas involucradas en múltiples vías de
señalización.
 Alto grado de complejidad en la
caracterización e identificación de los
mecanismos moleculares.
 Dificulta el desarrollo de fármacos eficaces y
seguros y de métodos diagnósticos

4. Biología de sistemas
 Para entender los mecanismos complejos se han
generado herramientas que generan datos masivos.
 Con los microarreglos se generan miles de datos en
células o tejidos normales o alterados.
 El reto: análisis de los datos.
 Fuera de la capacidad de humana, requiere
herramientas computacionales.
 Estudio de múltiples genes, proteínas y sus
interacciones, estructuradas como sistemas
complejos en vías de señalización.

5. Herramientas para modelación y simulación para
aplicaciones biológicas, repositorios y bases de datos en
línea.
Pathguide (http://www.pathguide.org/)
 Protein-Protein Interactions
 Metabolic Pathways
 Signaling Pathways
 Pathway Diagrams
 Transcription Factors / Gene Regulatory Networks
 Protein-Compound Interactions
 Genetic Interaction Networks
 Protein Sequence Focused

6.  Utilizan diferentes lenguajes computacionales.
 Carecen de la capacidad de transformar formatos.
 No tienen la capacidad de integrar datos
experimentales.
 Carecen de representaciones expresivas
 Carecen de visualización dinámica (imágenes
estáticas).
 Carecen de posibilidad de manipulación.
 No estan disponibles con acceso libre.
ALGUNAS DEBILIDADES

7. KEGG PATHWAY Database
http://www.genome.jp/kegg/pathway.html
 Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes
(KEGG).
 Una de las más representativas.
 De las más completa.
 Múltiples organismos.
 Libre acceso.
 PERO Diagramas no expresivos.
[Kanehisa M. 2008].

8. Vías de señalización expresivas
 Visualización dinámica: permite la interacción del
usuario con la red
 Expresivas: permiten definir las interacciones entre sus
componentes
 Funcionamiento
 Comportamiento
 Facilitar el análisis
 Facilitar la interpretación
 Permitir la manipulación

9. Petri nets
 Grafos bipartitas, constan de arcos y de nodos, que son
de dos tipos: plazas y transiciones.
 Plazas: circulos, modelan elementos pasivos del
sistema, por ejemplo componentes biológicos (genes
proteínas).
 Transiciones: barras, elementos activos, eventos, por
ejemplo reacciones químicas (fosforilación,
reclutamiento).
 Arcos: flechas, unen a los nodos relacionados.
Murata 1989).

10. Petri nets
 Varios niveles de abstracción
 Visualización dinámica
 Expresivas
 Dinámicas
 Automatizable

11. SISTEMA INMUNE
Y SÍNDROME METABÓLICO
 La respuesta inmune y la regulación metabólica
están estrechamente relacionadas.
 Muchos aspecos del SM se han asociado con inflamación
crónica inplicando al sistema inmune como posible
causal del SM[Bosello, O. 2000, Zamboni, M. 1993, Olaiz-
Fernández, G. 2006, Friedman, J.M. 1998, Lee, Y. 2001]
 Entre los principales factores de riesgo que caracterizan
al SM se incluye un estado proinflamatorio (Grundy, S.
M. 2006).
 El funcionamiento de una es dependiente de la otra.

12.  Activación del sistema inmune innato controla el
metabolismo de macronutrientes y promueve el
SM y arterosclerosis [Zamboni, M. 1993, Olaiz-
Fernández, G. 2006, Friedman, J.M. 1998, Lee, Y.
2001].
 Los ácidos grasos pueden alterar el sistema inmune
e inducir algunos de sus efectos
biológicos[Bergman, R.N. 2000, Holm, C. 2003,
Belfrage, P. 1982, Sztalryd, C. 2003, Sengenes, C.
2000, Arner, P. 2005, Kuo, L.E. 2007].

13.  Existe fuerte correlación entre la inflamación
y la obesidad, la resistencia a la insulina, y la
arterosclerosis.
 No se comprende a profundidad el
mecanismo de como el sistema inmune afecta
esta enfermedadmetabolica .
 Se necesita el entendimiento profundo de las
vias de señalización involucradas en esta
patología.

14. Vías de señalización
inflamatorias involucradas en
Síndrome metabólico

15. NLRP3 inflammasoma
 Plataforma de proteína esencial para la activación de
caspasas inflamatorias y la subsecuente maduración y
activación de sus substratos, las pro-formas inactivas
de citocinas pro-inflamatorias
 Puede ser activado por moléculas derivadas del
huésped que son abundantes en individuos obesos:
Exceso de ATP, glucosa, ceramidas, especies reactivas
de oxígeno, LDL oxidado, ácido úrico y cristales de
colesterol (Schroder K, 2010).
 La activación de esta vía en tejido graso ocurre en
individuos obesos

16. Citocinas
 Factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) puede
activar componentes inflamatorios como el factor
nuclear kappa-B (NFkappaB), e inhibir la señalización
de la insulina (Lebovitz HE 2003).
 IL-1 e IL-8 son activadas por la vía del Inflamasoma
 Respuestas mediadas por Il-1 dan lugar a la resistencia
a la insulina a nivel de tejido graso, hígado y músculo
de animales obesos.

17. Receptores Toll like (TLR)
 Son proteínas importantes en la respuesta inmune innata.
 Reconocen estructuras conservadas en microorganismos
(lípidos de pared celular).
 También tienen un papel importante en el sistema
digestivo.
 El SM y la enfermedad ateroesclerótica cardiovascular se
relacionan con ingesta de SFA (ácidos grasos libres) y con
inflamación.
 La acumulación de SFA favorece la inflamación.
 TLR4 es necesario para que la ingesta de SFA induzca
obesidad, resistencia a la insulina e inflamación vascular.

18. PPAR
 The acute phase response (APR) classically refers to the
rapid reprogramming of gene expression and
metabolism in response to inflammatory cytokine
signaling.
 Acute phase protein (APP) levels being connected to
metabolic syndrome disorders.
 PPAR modulation has been stated between the
principal factors of this syndrome (Tenebaum A, 2004).
 PPAR-alpha interferes with several steps of the
inflammatory cytokine signaling cascade in the
hepatocyte and is a regulator of the inflammatory
response (Zambon A 2006).

19. Objetivo
 Generar un mapa de vías de señalización
expresivas, importantes en los procesos
inflamatorios relacionados con SM.
 Utilizamos un modelo animal de SM.
 Analizamos los cambios en los niveles génicos en
de ratas sanas comparadas con ratas enfermas.
 Generamos redes biológicas expresivas basadas en
redes de petri para analizar los datos generados
con microarreglos de un modelo animal con SM.
 Utilizando el software BiopathXplore

20. Tejido de aorta
 MS se asocia con un aumento en la rigidez del tejido de
la aorta, que es un predictor de morbi-mortalidad
cardiovascular.
 La rigidez arterial es un determinante en las
alteraciones de la presión de pulso, que se asocia con
eventos coronarios.
 La rigidez de la aorta es un posible mecanismo causal
de el alto riesgo cardiovascular asociado al SM

21. MÉTODOS
 Modelo animal: 6 ratas Wistar, macho,
normoglicémicas, de 300 a 400 g, alimentadas con una
dieta estándar.
Tres ratas admistradas con dieta alta en grasa (HFD)
intragástrica, y posterior administración de STZ.
 Disección de tejido de aorta: Se administró
pentobarbital (35mg/Kg)y se sacrificaron por dislocación
cervical. El tejido se colocó en soln. estabilizadora
(RNAlaterTM, QIAGEN) y se mantuvo a -70°.

22.  Extracción de RNA: Método de un solo paso con
isotiocianato de guanidina/fenol/cloroformo, usando
TRIzol. Se cuantificó usando NanoDrop ® ND-1000
Spectrophotometer, y la integridad se monitoreó por
electroforesis microcapilar.
 Microarreglos: El RNA se amplificó, marcó e hibridizó en
microarreglos de expresión de rata. Se escaneó en un
GeneChip Scanner 3000 7G, obteniendo la intesnidad de
fluorescencia de cada transcrito.
 Rat Gene 1.0 ST Array (Affymetrix)
 Número total de sondas de 722,254.
 No. estimado de genes 27,342 (11 pares de sondas por
gen).

23. RESULTADOS

24. Microarreglos de expresión
Comparación del grupo SM con el grupo Cr:
 Genes expresados diferencialmente: 1883
 genes sobreregulados (up-regulated): 925
 genes subregulados (down-regulated): 958

25. http://www.cva.itesm.mx/sysbiology/pages/software.html

26. Concurrent Dynamic Visualizations With Expressive
Petri Net Representations to Enrich the Understanding
of Biological and Pathological Processes: an Application
to Signaling Pathways.
F. Ramos*1, C. Hallal2, A. Nieto3, D. García4, J. Berúmen5, D. Escárcega*6
1, 4 6 , Tecnológico de Monterrey, Campus Cuernavaca.
2, 3 Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Facultad de Farmacia
5 Hospital General de México.
Journal of Applied Research and Technology Vol. 10, October 2012, 766-782

27. Estudio de vías de señalización

30. Vía de señalización de la Insulina
Plazas azules: sobreregulados
Plazas rojas: subregulados

31. Modelos NLRP3

33. KEGG

34. KEGG
A set of NLRs induces caspase-1 activation through the assembly of
multiprotein complexes called inflammasomes. These NLRs include NALP1,
NALP3 and Ipaf. The inflammasomes are critical for generating mature
proinflammatory cytokines in concert with Toll-like receptor signaling pathway.

35. NLRP3
sinónimos
 NALP: NACHT, LRR and PYD domains-containing
protein 3
 Cryopyrin
 CLR1.1: caterpiller-like receptor 1.1
 NALP3: NOD-like receptor family, pyrin domain
containing 3
 CIAS1: cold induced autoinflammatory syndrome 1
 NLRP3; AGTAVPRL; AII; AVP; C1orf7; CIAS1; CLR1.1;
FCAS; FCU; MWS; NALP3; PYPAF1

41.  Dr. David Escárcega
 Ing. Diana García
 M.F. Jorge Alberto García
 Dr. Alejandro Nieto

42. Nombre Diana Compañía Clase
Aprobación
FDA
Bevacizumab VEGF Genentech
Anticuerpo
monoclonal
2004 Colorrectal
BIBW 2992 EGFR/Erb2
Boehringer
Ingelheim
Molécula
pequeña
Aún no
Cetuximab Erb1 Imclone/BMS
Anticuerpo
monoclonal
2006 Mar
(SCCHN)
Imatinib Bcr-Abl Novartis
Molécula
pequeña
2001 (CML)
Trastuzumab Erb2 Genentech/Roche
Anticuerpo
monoclonal
1998
Gefitinib EGFR AstraZeneca
Molécula
pequeña
Ranibizumab VEGF Genentech
Anticuerpo
monoclonal
2006 (AMD)
Pegaptanib VEGF OSI/Pfizer
Molécula
pequeña
2004 (AMD)
Sorafenib
múltiples
dianas
Onyx/Bayer
Molécula
pequeña
2005 Dec
(Riñón)/ 2007
Nov (HCC)

43. Nombre Diana Compañía Clase
Aprobación
FDA
Dasatinib
múltiples
dianas
BMS
Molécula
pequeña
solo Ph 1 ??
Sunitinib
múltiples
dianas
Pfizer
Molécula
pequeña
2006 Jan (RCC
& GIST)
Erlotinib Erb1
Genentech/R
oche
Molécula
pequeña
2005
Nilotinib Bcl-Abr Novartis
Molécula
pequeña
2007
Lapatinib Erb1/Erb2 GSK
Molécula
pequeña
2007 (HER2+
Seno)
Panitumumab EGFR Amgen
Anticuerpo
monoclonal
2006
Vandetanib
RET/VEGFR/E
GFR
AstraZeneca
Molécula
pequeña
solo Ph 3 ?
E7080
VEGFR2/VEGF
R2
Eisai Co.
Molécula
pequeña
Aún no

44. NLRP3, cryopyrin, cold-induced autoinflammatory syndrome-1 [CIAS1], NALP3,
PYPAF1, and CLR1.1)
Nod (nucleotide-binding oligimerization domain)-like receptors
ASC, PYCARD: adapter molecule (apoptosis-associated speck like protein)
PAMPs pathogen-associated molecular patterns
DAMPs damage-associated molecular patterns
TRX: inhibitor thioredoxin
TXNIP: thioredoxin-interacting protein
ASC: apoptosis-associated speck-like protein containi
pro-caspase-1: 45 kDa zymogen that undergoes autocatalytic processing