Determinacion de proteinas mediante el metodo de kjeldahl nutricion
Metabolismo de los carbohidratos
1. Metabolismo de los
Carbohidratos
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERIA
E.A.P AGROINDUSTRIAL
GRUPO:
“B”
DOCENTE:
Blgo.Mblgo. Eterio Alva Muñoz
CÓDIGO: 0201212051
Alumno:
CICLO:“IV”
–
VEGA VIERA JHONAS ABNER.
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METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS
I. INTRODUCCION
Una de las características más importantes de los microorganismos es la propiedad de
crecer. Eventualmente la célula se divide y esa división significa duplicación ordenada
de todos los elementos celulares, esta duplicación garantiza la transmisión de las
características de una generación a otra.
Para realizar un trabajo químico tan complicado los microrganismos necesitan captar
del exterior sustancias químicas como los carbohidratos, proteínas, lípidos, etc., que
necesariamente deben ser incorporados a los medios de cultivo.
Como fuente de carbono los microorganismos pueden utilizar monosacáridos como
glucosa, disacáridos como sacarosa, maltosa, etc. Y polisacáridos como almidón celulosa,
etc. La capacidad de utilizar o no un determinado sustrato dependen de la presencia o
no de las enzimas específicas que están gobernadas genéticamente.
LA GLUCOSA
La glucosa es un monosacárido que es utilizado por la mayoría de microorganismos,
cuando es incorporado aun medio de cultivo puede ser metabolizada por diferentes vías
metabólicas y derivar fácilmente en la producción de ácido y/o gas.
La formación de ácido se puede evidenciar adicionando al medio un indicador de
pH como el rojo de fenol que en alcalinidad es rojo y en acidez es amarillo. La
observacion de gas puede ser observada mediante la acumulación de gas en tubos
invertidos (campana de Durham) que son incorporados en los tubos con medio
glucosado.
EL ALMIDON
El almidón es un polímero de glucosa y es usado como fuente de carbono por aquellos
microorganismos que tienen capacidad de hidrolizarlos en sustancias simples y
asimilables. Esta capacidad está gobernada genéticamente por la sintesis o no de
amilasas que son enzimas producidas por ciertos microbios cuando crecen en presencia
de almidón.
Los microorganismos que producen amilasas y por consiguiente hidrolizan el
almidón, se denominan almidón positivo y los que no tienen esa capacidad se denominan
almidón negativo.
Para determinar si un microorganismo es almidón positivo o negativo, se le siembra en
un medio de cultivo como única fuente de carbono,
y luego de la incubación se le
adiciona yodo (bajo la forma de lugol). Cuando el almidón se combina con el yodo se
colorea característicamente de azul. Por lo que un color azul indica presencia de
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almidón (almidón negativo) y la aparición de zonas claras indica la ausencia de almidón
(almidón positivo).
II.
OBJETIVOS
Observar
e
interpretar
las
diferentes
reacciones
metabólicas
de
los
microorganismos sobre la glucosa y el almidón incluidos en los medio de cultivo.
Identificar y diferenciar los microrganismos que metabolizan la glucosa con
formación de ácidos y/o gas.
Identificar microorganismos que hidrolizan el almidón y diferenciarlos de aquellos
que no hidrolizan.
III.
MATERIALES Y METODOS
3.1. MATERIAL
Material biológico:
Cultivos puros de Chirichi cola, Síguela spa, Pseudomonas spa,
Saccharomycescerevisiae y Bacillussubtilis.
Medio de cultivo:
Caldo glucosado
Agar almidón
Material de vidrio
Laminas portaobjetos
Campana de Durham
Placas Petri
Tubos de ensayo 13x100mm
Otros:
Lugol
Asa bacteriológica
Mechero, otros.
3.2. Método (Procedimiento):
DEGRADACION DE LA GLUCOSA
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A tres tubos conteniendo caldo glucosado colocar una campana de
Durham invertida y sembrar por separado
E. coli, Shiguellasp y
Pseudomonassp.
Incubar a 37 °C/24h.
Observar la degradacion de la glucosa con la formación de ácido,
mediante el viraje a amarillo del indicador rojo de fenol.
Observar la degradación de la glucosa con la formacion de un gas
mediante la acumulación de un gas en la campana de Durham.
Anotar los resultados.
DEGRADACION DEL ALMIDON
A tres tubos conteniendo Agar almidón sembrar por puntura
Bacillussubtillis y Saccharomycescerevisiae.
Incubar a 37 °C/48h.
Cumplido el tiempo de incubación, adicionar lugol a las placas.
Dejar reposar unos minutos.
Observar resultados y anotar.
Degradación de la glucosa.
Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo
vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los
microorganismos.
Encender el mechero
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Esterilizar
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A tres tubos contenido caldo glucosado colocar una campana de Durham
invertida y sembrar por separado E. coli, Shiguellasp y Pseudomonassp, quitar
el tapón del tubo, flamear la boca e introducir el asa para tomar la muestra.
Colocar la muestra en el centro del tubo.
Sacamos la muestra del tubo.
Flamear la boca del tubo de la muestra.
Colocar la muestra en el centro del tubo
Incubar a 37° C por 24 horas
Observar la degradación de la glucosa con la formación de ácido, mediante
viraje a amarillo de indicador rojo fenol.
Prueba positiva (+): color amarillo Prueba positiva (+): Burbujas en campana de
Prueba negativa (-): color rojo
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Durham Prueba negativa (-): Sin burbujas
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Observamos la degradación de la glucosa con formación de gas mediante la
acumulación de gas en la campana de Durham.
Antes
Después
Degradación del almidón.
Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo
vivo. Dejar enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los
microorganismos.
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A tres tubos conteniendo agar almidón sembrar por puntura bacillussubtillis y
saccharomycescerevisiae.
Incubar a 37°C por 48 horas
Cumplido el tiempo de incubación, adicionar lugol a las placas.
Dejar reposar unos minutos.
IV.
RESULTADOS
Almidón:
Para determinar si un microorganismo es almidón positivo o negativo, se le siembra
en un medio de cultivo como única fuente de carbono, y luego de la incubación se le
adiciona yodo (bajo la forma de lugol). Cuando el almidón se combina con el yodo se
colorea característicamente de azul. Por lo que un color azul indica presencia de
almidón (almidón negativo) y la aparición de zonas claras indica la ausencia de
almidón (almidón positivo).
+ Apariencia transparente alrededor de microorganismos
- No hubo hidrólisis
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Inoculamos
Presencia de almidón
Sembramos en un medio de cultivo.
Ausencia de almidón
Luego de la incubación se le adiciona yodo (bajo la forma de lugol).
Acción de metabolismo de grasas:
Aquí podemos encontrar que experimentalmente para demostrar la
actividad hidrolítica de las lipasas, se utiliza un agar tributirina. Este es un
agar nutritivo suplementado con el triglicérido tributirina el cual sirve de
sustrato. El mismo forma una emulsión que aparece el medio. Luego de la
inoculación e incubación mostrará áreas claras alrededor de las colonias
(lipólisis positiva), con esto podemos decir que el microorganismo es capaz
de secretar lipasas.
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Glucosa:
La formación de ácido se puede evidenciar adicionando al medio un
indicador de pH como el rojo de fenol que en alcalinidad es rojo y en
acidez es amarillo. La observacion de gas puede ser observada mediante
la acumulación de gas en tubos invertidos (campana de Durham) que son
incorporados en los tubos con medio glucosado.
Rojo de fenol
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Incorporamos microorganismos
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Antes
Observamos la degradación de la glucosa
V.
Después
CUESTIONARIO
1. ¿Todos los microbios usan glucosa?
No todos los microbios usan glucosa, por ejemplo los Los azúcares más
comúnmente utilizados por las levaduras durante su crecimiento son la
glucosa y la fructosa, que contienen 6 átomos de carbono. Sin embargo,
existen otros compuestos con mayor o menor número de átomos de carbono
y que son de interés en algunas industrias. Estos azúcares diferentes
pueden a su vez ser metabolizados por algunas levaduras. Por ejemplo, la
levadura Candidautilis, la cual se emplea en la industria alimentaria, puede
crecer metabolizando azúcares de cinco átomos de carbono (pentosas);
esto permite que crezcan en un producto colateral de la industria del papel
que es precisamente un azúcar de cinco átomos de carbono.
2. ¿Qué sucedería si no se adiciona el indicador al caldo glucosado?
No podríamos medir la concentración de iones hidrogeno (H+), también es
Utilizado para observar productos intermediaros en caldo glucosado.Mide la
producción de acetoina.Alfa naftol: extrae acetoina.KOH: forma un diacilo,
formando un anillo de color rosa.
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El caldo glucosado funciona como Indicador:
Mostrando un color rojo de metilo (mide concentración de iones H+) En
medio ácido y mostrando en medio alcalino un color amarillo.
3. ¿Qué son amilasas?
o Las amilasas son aquellas enzimas con función de romper los
polisacáridos como el almidón en su componente más pequeño que es
el monosacárido (ejemplo la glucosa)
o La amilasa es un enzima que tiene la función de digerir el glucógeno y
el almidón para formar azúcares simples.
o
La amilasa,
denominada
también sacarosa o ptialina,
es
un enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de
hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilasa al digerir
el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples.
4. ¿Por qué algunos microorganismos no hidrolizan almidón?
Algunos microorganismos no hidrolizan el almidón, es porque no son tan
resistentes a la sustancia agregada en nuestro caso el LUGOL y en
algunos casos por ser negativas, como es el caso de EscherichiaColi no
reaccionó con la sustancia agregada (lugor) y por ser gram negativo, son
susceptible a este tipo de solución, por lo tanto no hidrolizó.
Sucede todo lo contrario con bacillussubtillis fue resistente al colorante
o sustancia y
pudo hidrolizar al almidón formándose un halo
transparente alrededor del almidón.
VI.
DISCUSIONES:
Pedro Garcianos dice: Los hidratos de carbono más interesantes desde el
punto de vista taxonómicos son: pentosas (xilosa, arabinosa, ramnosa), hexosas
(glucosa, galactosa, fructosa, manosa), disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa,
trehalosa), trisacáridos (rafinosa), polialcoholes (glicerol, manitol, dulcitol,
sorbitol), polímeros (almidón, inulina), glucósidos (salicina esculina).
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Los carbohidratos de la ración proporcionan más del 50% de la energía
necesaria para el trabajo metabólico, el crecimiento, la reparación, la
secreción, la absorción, la excreción y el trabajo mecánico.
El metabolismo de CHOs incluye las reacciones que experimentan los CHOs de
orígenes alimentarios o los formados a partir de compuestos diferentes a los
CHOs. La oxidación de este tipo de glúcidos proporciona energía, se almacenan
como glucógeno, sirven para la síntesis de aminoácidos no esenciales y ante el
exceso de CHOs se favorece la síntesis de ácidos grasos.
Gluconeogénesis es el proceso de formación de carbohidratos a partir de
ácidos grasos y proteínas, en lugar de hacerlo de carbohidratos. Intervienen,
además del piruvato, otros sustratos como aminoácidos y glicerol. Se realiza en
el citosol de las células hepáticas y en él intervienen las enzimas glucosa-6fosfatasa, fructosa 1,6-bifosfatasa y fosfoenolpiruvatocarboxicinasa, en lugar
de hexocinasa, fosfofructocinasa y piruvatocinasa, respectivamente, que son
estas últimas las enzimas que intervienen en la glucolisis.
Según Roberto Alarcón–2001: Las bacterias son capaces de metabolizar la
mayoría de los carbohidratos, ya sea por oxidación o por fermentación,
originando una serie de productos intermedios que permiten diferenciar
diversas especies; el metabolismo provoca una acidicacion del medio que se
pone manifiesto por el viraje de un indicador de pH. A veces, la acidificación se
acompaña
de
producción
de
gas
que
aparece
formando
burbujas
y
resquebrajamiento en los medios sólidos, o puede recogerse en una campana de
Durham en los medios líquidos.
VII.
BIBLIOGRAFIA
http://biosb2.blogspot.com/2009/11/identificacion-de-amilasas.html
Aspectos básicos de bioquímica clínica - Jacobo Díaz Portillo, María Teresa
Fernández del Barrio, Fernando Paredes Salido
http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismo
s.shtml
http://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa
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METABOLISMO DE LOS LIPIDOS
I.
INTRODUCCION
Las grasas son esteres del glicerol y los ácidos grasos. Los microbios
utilizan grasas solamente después de la hidrólisis del enlace ester, y las
enzimas extracelulares llamadas lipasas son responsables de la reacción.
El resultado final son la formación de glicerol y ácidos grasos. Las lipasas no
son muy específicas y atacan a grasas que tienen ácidos grasos de
diferentes longitudes de cadena. Los fosfolipidos son hidrolizados por
enzimas que especificas, que son denominadas fosfolipasas, dándoles
diferentes designaciones por medio de letras dependiendo de que el enlace
ester se rompa. El resultado de la acción de las lipasas es la liberación de
ácidos grasos y glicerol y todas estas sustancias pueden ser atacadas
aeróbica o anaeróbicamente por varios microorganismos organotróficos.
Los ácidos grasos se oxidan por un procesos llamado Beta oxidación, en el
que dos carbonos del acido grasos se separan en un tiempo dado. En las
eucariotas las enzimas se encuentran en los mitocondrias, en tanto que en
las procariotas son citoplasmáticas. La Coenzima A activa primero el ácido
graso; la oxidación da como resultado la liberación del acetil CoA y la
formación de un ácido graso corto de dos carbonos. El proceso de Beta
oxidación se repite y se libera otra molécula de acetil CoA, se efectúan dos
reacciones más por separadas de deshidrogenación, la primera los
electrones se transfieren al flavin – adenosina dinucleotido (FAD), en tanto
que la segunda se transfieren a NAD.
La mayor parte de acidos grasos tienen un número par de carbonos y su
oxidación total solo produce Acetil CoA. La Acetil CoA formada se oxida
por la vía del ciclo de ATC o se convierte en hexosa y otros constituyentes
celulares por la vía del ciclo del glioxilato.
La oxidación de los acidos grasos no progresa adecuadamente hasta que se
disponga del acidooxalacetico (derivado principalmente del metabolismo de
los carbohidratos), para que se condense con el Acetil CoA, formada apartir
de lsoacidos grasos.
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II.
OBJETIVOS
Observar halos de hidrólisis tributirina por acción microbiana.
Distinguir diversas acciones microbianas frente a lípidos en los medios de
cultivo.
III.
MATERIALES Y METODOS
3.1.
MATERIAL
Material Biológico:
Muestras de caspa y pelos de cuero
cabelludo.
Medio de cultivo:
Agar tributirina
Material de vidrio:
Placas Petri
Otros
Asa bacteriológica
Mechero, otros.
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3.2.
METODO (PROCEDIEMINTOS)
Tomar una muestra de caspa y pelos de cuero cabelludo y
hacer la siembra en el medio de Agar tributirina.
Llevar a incubar a 37ºC/24hrs.
Hacer las lecturas. En el caso de Agar tributirina indicar los
halos de hidrólisis.
Añadir muestras de
caspa y cuero cabelludo
Añadimos Bacillus y E. Coli
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Esterilizamos el asa bacteriológica
para realizar el sembrado.
Sembramos por puntura
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IV.
RESULTADOS
Acción de metabolismo de grasas:
Aquí podemos encontrar que experimentalmente para demostrar la
actividad hidrolítica de las lipasas, se utiliza un agar tributirina. Este es un
agar nutritivo suplementado con el triglicérido tributirina el cual sirve de
sustrato. El mismo forma una emulsión que aparece el medio. Luego de la
inoculación e incubación mostrará áreas claras alrededor de las colonias
(lipólisis positiva), con esto podemos decir que el microorganismo es capaz
de secretar lipasas.
Experimentalmente para demostrar la actividad hidrolítica de las lipasas.
Utilizando un agar tributirina
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V.
CUESTIONARIO
1. ¿A qué se debe la transferencia del halo de hidrolisis en el agar
tributirina?
Para determinar la transferencia de los halos de hidrolisis
hay que hacer pruebas
cuantitativas demostradas la actividad amilolítica de los aislamientos por la cantidad de
azúcares reductores liberados.
Se inocula aprox. 10 ml de cada cultivo en placas de agar tributirina, Después se incuban a 37°C
durante 2 a 4 días, y se observa la formación de un halo transparente alrededor de su
crecimiento debido a la presencia de lipasas que hidrolizan el gliseriltributirato del medio. Se
mide en milímetros los diámetros de los halos que aparecieron alrededor de las gotas de cultivo
depositadas.
En general, la actividad amilolítica fue mayor en el cuarto día del cultivo. Se destacan los
rendimientos de los aislamientos provenientes de humanos (202, 205 y 208) y el 315 de origen
vegetal
2. ¿Se podra aislar organismos lipolíticos del medio ambiental? ¿Dónde
y por qué?
Para aislar los organismos lipoliticos, tenemos que procesar y analizar la determinación de los
parámetros fisicoquímicos del producto inicial y final que donde o el ambiente que se ba
realizar.
Como sabemos para preparar a los ORGANISMOS LIPOLITICOS debemos conocer que tiene
un diluyentediluciones 10-1 y 10-2. Depositar 0,1mL sobre una placa de medio de Sierra
modificado o agar tributirina y extender con una varilla en L. Incubar a 30°C durante 48 horas.
Contar las colonias rodeadas de un halo azul oscuro en el primer medio o las que tienen halo
claro en el segundo, y multiplicar por el factor de dilución correspondiente.
MEDIO DE SIERRA MODIFICADO. Peptona 10 g, cloruro de sodio 5 g, cloruro de calcio 0,1
g, extracto de carne 3 g, citrato ferroso 0,2 g, agar 15 g, agua 1 litro. Esterilizar a 120ºC
durante 20 minutos. Enfriar a 50ºC, agregar asépticamente 5 mL solución de azul victoria B
(0,1 g en 150 mL agua estéril) y 1 mL de tween 80 (9).
AGAR TRIBUTIRINA. Peptona 5 g, extracto de levadura 3 g, tributirina 10 g, agar 15 g, agua 1
litro, pH 7,5. Esterilizar a 115ºC durante 15 minutos. Agitar para emulsionar y volcar en cajas
de Petri estériles (10).
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VI.
DISCUSIÓN
Según Pedro García: Los lípidos no constituyen cuantitativamente un
elemento nutritivo de importancia para las bacterias; solo unas pocas
especies pueden metabolizar algunos de ellos por contener lipasas, lectinas
u otras enzimas. 1. Investigación de la lipasa Se lleva acabo sobre cultivo
por un agar enriquecido con tween 80. La existencia de lipasa se traduce
como la aparición de un halo opaco alrededor de las colonias a causa de la
precipitación de los ácidos grasos.
Como fase previa a la hidrólisis enzimática es necesario un pretratamiento
que haga accesible la biomasa lignocelulósica al ataque enzimático. En este
trabajo se ha utilizado un pretratamiento de explosión por vapor para
facilitar la hidrólisis enzimática.
Los lípidos son componentes de alto peso molecular. La degradación de
éstos se lleva a cabo por enzimas extracelulares (las lipasas), que clivan los
puentes éster adicionando una molécula de agua para formar glicerol y
ácidos grasos.
VII.
BIBLIOGRAFÍA:
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis102.pdf
http://revistas.javeriana.edu.co/index.php/scientarium/rt/printerFriendly
/1646/html
http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismo
s.shtml
http://books.google.com.pe/books?id=4N8qVKckrUUC&pg=PA117&dq=hidrol
isis+enzimatica+de+lipidos+en+medios+de+cultivo+microbiologia&hl=es&sa=X
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