Tesis cacao

MULTIPLICACIÓN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES
MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO (Theobroma cacao) EN
MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS
AGRONÓMICOS
LILIANA DAVILA ROCHA
CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO
CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION
LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION
AMBIENTAL
VALLEDUPAR
2009

MULTIPLICACIÓN DE HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES
MA NATIVOS DE CULTIVO DE CACAO (Theobroma cacao) EN
MAIZ (Zea mays) BAJO DISTINTOS TRATAMIENTOS
AGRONÓMICOS
LILIANA DAVILA ROCHA
CARLOS JULIO RAMOS FRAGOZO
CINDY MANUELA ROSALES MAESTRE
Trabajo presentado como requisito para obtener el titulo de
Licenciados en Ciencias Naturales y Educación Ambiental
Tutor
Laura Esther Rojas Martinez
Bióloga
UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y EDUCACION
LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION
AMBIENTAL
VALLEDUPAR
2009

Valledupar, Mayo 15 de 2009
Nota de Aceptación
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______________________________
______________________________
Firma del Presidente del Jurado
Firma del Jurado
Firma del Jurado

A Dios
Por darme vida, salud, fortaleza y perseverancia en el transcurso de mi carrera.
A mis padres Atanasio Dávila y Celia Rocha
por haberme brindado su apoyo incondicional durante todo este tiempo.
A mi Tía Sebastiana Dávila
Mil gracias porque sin su apoyo, su tolerancia y su bondad no hubiera llegado a
ser lo que soy.
A la profesora Laura Rojas Martínez
Que dedicó parte de su tiempo a la realización de este trabajo. Gracias a todos los
que confiaron en mí y que de una u otra forma siempre estuvieron a mi lado
ayudándome.
Liliana Dávila Rocha

A Dios
Por siempre iluminar el camino que he recorrido toda mi vida, gracias por ser mi
guía.
A mis padres
Saudy Maestre Morales Y Orlando Rosales Castro, a quienes les debo todo lo que
soy, son mi admiración porque me han demostrado que nunca se debe uno de
rendir y buscar siempre nuevas oportunidades para salir adelante y las
adversidades tomarlas como un proceso de aprendizaje de la vida cotidiana.
Los amo y gracias por estar siempre conmigo en las buenas y en las malas, son la
bendición más grande que me ha dado Dios
A mis hermanos y familiares
Adriana, Andrés Felipe Y Joaquín quienes juntos crecimos y compartimos muchas
vivencias, alegrías y tristezas. Espero seguir compartiendo la dicha y la felicidad
que nos mantiene unidos.
A la Bióloga Laura Rojas Martínez
A quien admiro y respeto, gracias por tu guía en este difícil campo de la
investigación micorrizica, además de brindarme su amistad. Que Dios la bendiga
siempre.
A Carlos Julio Ramos Fragozo
Por su amor, compañía y ayuda en este proceso.
Cindy Rosales Maestre

A Dios, a mis padres y a los sueños que se hicieron realidad
Carlos Julio Ramos Fragozo

AGRADECIMIENTOS
Los autores de este proyecto expresan su agradecimiento a:
Al propietario de la Finca Monte grande de Pueblo bello Cesar por habernos
permitido obtener las muestras del suelo de los cultivos de cacao.
A los trabajadores del almacén del laboratorio de Ciencias Naturales Freddy
Pérez Domínguez y Luis Gonzales Fernández por habernos facilitado las
herramientas necesarias durante la realización de este proyecto.
A la Universidad Popular del Cesar, por brindarnos la oportunidad de superarnos,
capacitarnos y crecer intelectualmente, para poder convertirnos en los próximos
profesionales del futuro.
Las diferentes personas que intervinieron para la recolección de las muestras, la
cual fue de gran ayuda para llevar a cabo los diferentes estudios y procesos
necesarios para la realización de este trabajo.

RESUMEN
En Colombia, los estudios del efecto de los sustratos y el tipo de cultivo trampa
adecuado para la multiplicación de micorrizas arbusculares MA son escasos,
debido a ello, el objetivo del presente trabajo consistió en multiplicar hongos
micorrizógenos nativos y así obtener un inóculo con una diversidad de
microorganismos fúngico endófitos nativos adaptados a nuestro sistema
agroecológico que pueda evaluarse posteriormente en cultivos de cacao bajo las
condiciones edáficas y climáticas de la región y aumente la productividad de una
manera sostenible.
En los sistemas de cacao de la región, la baja productividad ha generado el
planteamiento de estrategias como es el uso de microorganismos para estimular
su crecimiento, donde se destacan los hongos micorrizógenos. Estos organismos
pueden ser obtenidos, seleccionados, multiplicados e incorporados al suelo en
forma de inóculos. El proceso de inoculación es complejo, por una parte, implica
diseñar métodos de aislamiento, selección, multiplicación e incorporación
adecuados para cada especie o propósito. En este trabajo se evaluó la
multiplicación de esporas de hongos micorrízicos arbusculares MA nativos
obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de maíz
(Zea mays) fertilizadas y no fertilizada. El ensayo se mantuvo en vivero durante
cuatro meses con condiciones de riego controladas. En cada una de las unidades

experimentales se evaluó número de esporas/g de suelo seco, porcentaje de
colonización y las variables agronómicas como peso seco y altura de las plantas.
Dentro de los resultados se obtuvo que las plantas trampas de maíz (Sea mays)
inoculadas respondieron significativamente a la infección y esporulación por los
hongos MA nativos, mostrando mayores niveles de infección de micorriza.
El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento y porcentaje de materia seca fue
alcanzado por el tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas.
El género micorrízico predominante con mayor abundancia relativa dentro de la
población de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus
Palabras claves: micorriza, inóculo, cacao, fertilización, infectividad, esporas.

CONTENIDO
DEDICATORIA
RESUMEN
INTRODUCCION 17
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 19
2. JUSTIFICACION 21
3. OBJETIVOS 24
3.1 Objetivo General 24
3.2 Objetivos Específicos 24
4. MARCO TEORICO 25
4.1 Antecedentes de la Investigación 25
4.2 Bases Teóricas 30
4.2.1 la micorriza 30
4.2.2 Tipos de micorrizas 31
4.2.2.1 Ectomicorriza 31
4.2.2.2 Endomicorriza 32
5. MATERIALES Y METODOS 46
5.1Obtencion de esporas nativas MA de cultivo de cacao. 46
5.1.1 Toma de muestras de suelo. 46
5.1.2 Preparación de l pre-Inoculo 47
5.1.2.1 Tamizaje-Flotación-Filtración 47
5.2.2.2 Secado de las muestras 48

5.2 Multiplicación de esporas nativas en plantas trampas 50
5.2.1 Material vegetal 50
5.2.2 Preparación de sustratos 51
5.2.3 Siembra 52
5.2.4 Aplicación del pre- inóculos 53
5.2.5 Manejo de los tratamientos 53
5.3.5 Evaluación de la infectividad y efectividad de la multiplicación de
los hongos MA nativos 55
5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo 56
5.3.2 Determinación de porcentaje de infección 58
5.3.2.1 Tinción de las Raíces 58
5.3.2.2 Evaluación de la colonización micorrizica por el método de
intercepto de McGonigle 59
5.4. Identificación de esporas de hongos MA multiplicados en el
cultivo trampa 64
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES 65
6.1 Porcentaje de infección micorrizal 65
6.2 Altura de las plantas 72
6.3 Determinación de biomasa 76
6.4 Análisis de diversidad de hongos micorrízicos 78

7. CONCLUSIONES 82
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Proceso de formación de micorriza arbuscular (MA) 35
Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los géneros de
Hongos micorrízicos arbusculares MA 43
Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de
Pueblo Bello- Cesar 46
Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras 44
Figura 5: Semillas de maíz (Zea mays)
Figura 6: Preparación de los sustratos y tratamiento 49
Figura 7: Siembra y aplicación del inóculo en los diferentes tratamientos 52
Figura 8: Aplicación del fertilizante a los diferentes tratamientos 55
Figura 9: Flotación- filtración de las muestras de suelo 56
Figura 10: Papel filtro con los sedimentos después del filtrado y corte
de la misma para observar al microscopio 57
Figura 11: Método para la tinción de las raíces 59
Figura 12: Raíces de las diferentes plantas en laminas portaobjetos 60
Figura 13: Corte de la raíz y parte aérea de la planta 57
Figura 14: Peso de las raíces y parte aérea de las plantas 62
Figura 15: Vesícula 65
Figura 16: Arbúsculos 66

Figura 17: Hifas 66
Figura 18: Comparación de la altura de plantas del tratamiento 2
y tratamiento 3 73
Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raíz de las plantas con micorriza y
sin micorrizas 74
Figura 20: Entrophospora 79
Figura 21: Acaulospora 79
Figura 22: Glomus 79
Figura 23: Archaeospora 79
Figura 24: Scutellospora 80
Figura 25: Gigaspora 80

LISTA DE GRAFICAS
Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas 67
Grafica 2: Porcentaje de infección por arbúsculos 64
Grafica 3: Porcentaje de infección por vesículas 69
Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3. 73
Grafica 5: Porcentaje peso seco parte aérea 76
Grafica 6: Porcentaje peso seco de la raíz 76
Grafica 7: Porcentaje de esporas por género en cada uno de los
tratamientos 78

LISTA DE CUADROS
Cuadro 1: Ubicación taxonómica y géneros de hongos formadores de
micorriza arbuscular 42
Cuadro 2: Proporciones del fertilizante Nutrifoliar por g/L 54

ANEXOS
Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte aérea de las plantas en los
diferentes tratamientos 91
Anexo 2: Resultados del peso seco de la raíz de las plantas en gramos 91
Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 días de edad 92
Anexo 7: Número de esporas en 10 gr de suelo 94
Anexo 8: Infección por hifas 94
Anexo 9: Infección por arbúsculos 95
Anexo 10: Infección por vesículas 95
Anexo 11: Número de vesículas por laminas 96
Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero 96
Anexo 13: Análisis fisicoquímico del suelo 97

INTRODUCCION
En la actualidad en los países europeos y de América latina, existe una alta
demanda por los productos orgánicos (Fraire, 2002). Colombia ha mostrado
interés para producir productos agropecuarios con insumos económicos e inóculos
para el bienestar de la población consumidora y de la familia de la población más
vulnerable.
El cultivo de cacao es un producto agroindustrial que presenta buena aceptación
y demanda. En los últimos años los productores han sufrido pérdidas en las
plantaciones debido a los elevados costos de insumos, bajo nivel tecnológico,
deficiencia de nutrimento en las plantaciones, altas incidencias de plagas y
enfermedades dañinas como moniliasis (Barreras, 2007). En la actualidad es
necesario buscar tecnologías alternativas que estén al alcance de los productores,
que permitan minimizar costos de producción e incrementar la productividad del
cultivo mediante la agricultura alternativa y reactivar las plantaciones mediante la
reconversión de cacao tradicional a la producción orgánica competitiva.
Una de estas alternativas, es la aplicación de microorganismos con alto potencial
biofertilizantes que puedan mantener la sostenibilidad de los cultivos. Las
micorrizas son una de las principales asociaciones simbióticas de la naturaleza ya
que las raíces de la mayoría de las plantas vasculares son colonizadas
extensivamente por hongos micorrícicos vesículo arbuscular (MA). Estos son
organismos biotróficos obligados que pueden estimular el crecimiento y desarrollo

de las plantas al mejorar la nutrición de éstas, determinando un incremento
importante en la absorción de nutrimentos inmóviles (Stribley, 1990; Bethlenfalvay
et al., 1991).
El reconocimiento, establecimiento y eficiencia de una asociación micorrizica
dependen de factores como: a) tipo de hongo (su tasa de crecimiento interior y
exterior en la raíz), b) planta hospedante (como genotipo, exudados radicales,
geometría radical, presencia de pelos radicales y de raíces laterales) y c) los
factores biofisicoquímicos del suelo (pH, humedad, textura, fertilidad, tipo de
microorganismos) (Graham et al., 1981; Estañol, 1987; Tester et al., 1987; Smith y
Giaginazzi, 1988; Varela y Estrada, 1991).
Debido a la gran variedad de especies MA es importante, determinar cual de estas
MA sera más idónea para un cultivo especifico, todo esto con el fin de poder llegar
a la obtención de una planta que presente ciertas características que le permita
adaptarse de mejor manera a las condiciones en el momento de su trasplante a
terreno definitivo con una disminución en la aplicación de fertilizantes inorgánicos.
Teniendo en cuenta esta problemática, el objetivo del presente trabajo consistió
en multiplicar hongos micorrizógenos nativos, útiles para el posterior
establecimiento de un inóculo potencial de uso regional en plantaciones de cacao.

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La producción de cacao en Colombia se desarrolla en unidades productivas
pequeñas en donde el cacao constituye una de las fuentes alternativas de
ingresos. En el Cesar, específicamente en la zona de Pueblo Bello, no es la
excepción. Las plantaciones cacaoteras están establecidas en fincas familiares,
donde la tecnología empleada es baja, no se llevan a cabo labores de fertilización,
riego, drenaje y siembras (renovaciones). La fertilización se realiza solo en el
momento de la siembra, pero durante el desarrollo del árbol esta es casi nula. La
Corporación Colombiana De Investigación Agropecuaria (CORPOICA)
recomienda, fertilizar dos o tres veces al año, actividad poco difundida en estas
fincas cacaoteras, lo que se constituye en una ventaja a la hora de aplicar
tecnologías limpias, como biofertilizantes que mejoren la productividad y
sostenimiento de los cultivos sin dañar los ecosistemas.
Adicionalmente, las labores culturales realizadas por los agricultores son
precarias dando vía libre para la propagación de enfermedades como la
moniliasis, que ya ha sido diagnosticada en Pueblo Bello- Cesar y que se
constituye como la principal limitante para la producción de cacao (Barreras,
2007). Esta enfermedad es causada por el hongo Moniliophthora roreri, que
ataca exclusivamente frutos; se estima que ocasiona pérdidas superiores al 40%

en la producción nacional que, estimada en valor comercial de $120.000 millones
al año.
Todos estos factores contribuyen a la disminución de la producción en las
plantaciones de cacao. Departamentos como Nariño, Tolima, Cundinamarca,
Meta y Cesar registran tasas decrecientes en la producción de cacao. El
departamento del Cesar produjo; 633 toneladas en el año 2000 y 513 toneladas
en el 2004 con un crecimiento de producción de -3.7% (Barreras, 2007).
Debido a los precarios manejos agronómicos y la proliferación de enfermedades
podemos identificar que la disminución de la productividad de las plantaciones de
cacao es un problema de importancia económica a nivel departamental y nacional,
teniendo en cuenta que el consumo de este producto es mucho mayor que la tasa
de producción, las micorrizas se constituyen como una herramienta útil para la
sostenibilidad y aumento de producción de los cultivos de cacao.

2. JUSTIFICACIÓN
Los fertilizantes químicos son sustancias que enriquecen el suelo y promueven el
desarrollo vegetal, son de gran ayuda si, se quiere lograr un mejor rendimiento y
producción en los cultivos. Muchos agricultores no realizan la aplicación de estos
productos debido a los altos precios que en muchas ocasiones registran.
En los suelos naturales todas las especies forestales incluyendo el cacao forman
asociaciones simbióticas y mutuamente benéficas entre sus raíces y hongos
endófitos especializados (Guerrero et al, 1996). Esta formación raíz-hongo es
llamada micorriza y cuenta con un alto potencial biofertilizante. El 95% de las
plantas dependen de las micorrizas para crecer y sobrevivir, lo que es evidenciado
por la baja supervivencia de plantas no micorrizadas cuando son plantadas en
suelos con carencia de hongos micorrízicos (Alarcón, 2007).
En la actualidad hay una gama de productos biofertilizantes internacionales y
algunos nacionales a base de MA, la efectividad de la inoculación dependerá del
balance de factores ecofisiológicos en el sistema planta-suelo, lo cual significa
que un mismo inóculo puede desencadenar efectos muy variados sobre un cultivo,
dependiendo del tipo de manejo agronómico que se realice. Por lo tanto, no se
puede generalizar el efecto de un tipo de micorrizas sobre todos los árboles ni
sobre todos los ecosistemas. (Molina L. y Col.2005).

Sieverding (1990) afirman que existe un desconocimiento acerca de la efectividad
de las especies nativas frente a las introducidas. Aunque la efectividad de la
inoculación para la mejora y mantenimiento de la salud y fertilidad del suelo, así
como su efecto benéfico en la producción y el crecimiento de plantas de interés
han sido extensivamente demostrados para diferentes sistemas a nivel de
investigación (Jeffries et al., 2003; Koide & Mosse, 2004), los reportes de
efectividad derivados de aplicación masiva en campo de inóculo producidos para
tal fin son más escasos.
Read (1991) hace un planteamiento biogeográfico según el cual cada tipo de
micorriza, tendría un juego particular de atributos y funciones adaptados a un
ecosistema y ambiente edáfico particular la cual hace un uso eficiente del fósforo
del suelo y de los fertilizantes fosfóricos, optimizar la productividad de los suelos y
cultivos con niveles bajos de insumos, hace posible y rentable la producción
vegetal en condiciones adversas (de fertilización, presencia de metales pesados,
desertificación), ayudar a establecer cultivos en suelos erosionados o degradados.
Departamentos como Bolívar y Cesar son zonas que se han caracterizado en los
últimos años (1990-2006) por presentar especialidades de cacao en grano único
reconocidas por empresa internacionales como producto con característica únicas
y que por lo tanto puede ser transado a precios más altos en los mercados
internacionales. Sin embargo uno de los principales problemas que afecta la

producción de estos departamentos es la enfermedad fungosa conocida
tradicionalmente como la moniliasis, que es el factor más limitante para la
producción de cacao en todo el país, causando graves pérdidas representadas en
más del 40% de la cosecha anual (Barreras, 2007)
Ante todas estas dificultades presentadas en la región del Cesar específicamente
en Pueblo Bello, reconocida como zona potencial de alta producción de cacao. El
proyecto en cuestión se propone obtener un inoculo como biofertilizante,
compuesto de hongos nativos (MA), con el objeto de mejorar las condiciones
edáficas de las plantaciones y proporcionar muchos beneficios a las plántulas y a
los árboles adultos, especialmente en la obtención del agua y los nutrientes que
mejoren la productividad del cultivo y mayor tolerancia a patógenos que
actualmente afectan a estos cultivos en el Cesar.

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Evaluar la producción de esporas de hongos Micorrizicos Arbusculares (MA)
nativos obtenidos de cultivo de cacao (Theobroma cacao) en plantas trampas de
maíz (Zea mays) fertilizadas y no fertilizadas.
3.2 Objetivos Específicos
· Obtener esporas de hongos MA nativos del cultivo de Cacao del municipio de
Pueblo Bello- Cesar.
· Multiplicar las esporas nativas utilizando plantas trampa de maíz (Zea mays).
· Evaluar la infectividad y la efectividad de los hongos MA nativos obtenidos
del cultivo trampa de maíz (Zea mays). Fertilizadas y no fertilizadas.
· Identificar las esporas de los hongos MA nativos obtenidos y multiplicados en el
cultivo trampa de maíz (Zea mays).

4. MARCO TEÓRICO
4.1 Antecedentes de la Investigación
La producción a gran escala de inóculos de hongos MA se inició en los años 80 –
90s, habiendo en la actualidad un amplio número de compañías registradas para
este fin en todo el mundo (Dalpe & Monreal, 2003). Los sistemas de producción
han evolucionado considerablemente en los últimos años, de tecnologías
relativamente simples a otras más complejas, como los métodos in vitro.
Actualmente, el inóculo es producido para propósitos comerciales de diversas
maneras.
En general, la investigación en el área de microbiología en Colombia ha tenido un
buen desarrollo en campos biotecnológicos orientados a la solución de
necesidades particulares relacionadas con las condiciones tropicales del país, la
caracterización de microflora de plantas nativas de nuestros ecosistemas con
aplicación en la producción de biofertilizantes. Se puede decir que se han obtenido
desarrollos con impacto a nivel económico en diferentes campos.
En el estudio de los hongos que forman endomicorrizas, principalmente de tipo
arbuscular MA, la Universidad Nacional – Palmira ha estado comprometida desde
el año1983 y en 1984, los estudios se enfocan hacia el conocimiento de MA en
agroecosistemas de importancia estratégica como es el caso del café, yuca,

gramíneas, hortalizas y frutales, indagando en primera instancia sobre especies
nativas y también sobre respuestas a inoculaciones con estos hongos. En esta
sede existe como programa de investigación el estudio de endomicorrizas en
agroecosistemas y ecosistemas, con varias líneas de trabajo; sin embargo, el
trabajo en el campo ha mostrado que los MA son un componente del sistema y
que sólo en la medida que se integra su manejo a los otros componentes, es
posible hacer un uso de sus potencialidades.
Existen instituciones en donde se están adelantando procesos de obtención de
patentes a nivel nacional como es el caso del Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia - IBUN.
El segundo caso de estudio está representado por CENICAFÉ quien ha
establecido un modelo para la producción de diferentes microorganismos
biocontroladores de plagas y enfermedades en el cultivo de café, además de
adelantar investigaciones relacionadas con el empleo de microorganismos como
biofertilizantes con miras a establecer una caficultura biológica. El modelo de
convenio internacional con la Comunidad Europea (proyecto INCO) firmado entre
varios países tiene como fin la caracterización y producción de inóculo micorrízico
allí se observa que a partir de la obtención y caracterización de micorrizas vesículo
arbusculares (MA) se establece una colección cuyo manejo tecnológico (cultivo

monoaxénico), inoculación y formulación favorece el establecimiento de musáceas
(plátano y banano) micropropagadas.
En Colombia, el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) inició trabajos
de investigación con micorrizas MA desde la década de los 80, donde se evaluó
su importancia agronómica en cultivos tropicales como yuca y algunas pasturas.
Se iniciaron trabajos de recolección de hongos nativos, aislamiento e identificación
de micorrizas originarias del Valle de Cauca, Llanos Orientales, entre otras. Como
resultado de estas investigaciones se formó un Banco de Germoplasma, y algunas
recomendaciones relacionadas con su biodiversidad potencial de uso en la
agricultura. Existen también experiencias positivas con la aplicación de inóculos de
micorrizas (Glomus, Scutellospora y Entrophospora) en frutales tropicales.
La Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA) es una
entidad con gran trayectoria y reconocimiento en el país. Mediante convenio con el
Ministerio de Agricultura y el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), administra
el banco de germoplasma de microorganismos (4.500 cepas) que son de interés
en biofertilización y fotoprotección, han obtenido biofertilizantes (Rhizobium,
Bradyrhizobium, micorrizas).
Ejemplo de este trabajo es el realizado por los técnicos de la Regional Siete de
CORPOICA, quienes realizaron aislamientos de micorrizas en muestras de suelo

de la rizósfera de plantas de cacao, tomadas a diferentes altitudes de las zonas de
Río negro, Landazurí, El Carmen y San Vicente de Chucurí. Las micorrizas fueron
analizadas en el laboratorio de microbiología del Centro Internacional de
Agricultura Tropical (CIAT), concluyendo que para la multiplicación e inoculación
de estos microorganismos benéficos en el cultivo de cacao, es aconsejable la
utilización de micorrizas nativas, ya que tienen mejor capacidad de adaptación al
medio; si se aplican micorrizas foráneas se corre el riesgo de que ocurra
competencia entre ellas.
En Colombia, la diversidad de climas y ecosistemas hace que la multiplicación de
los cultivos varíe por las diversas condiciones agroecológicas, y estos factores
son las mayores limitantes para la producción sostenible y eficiente. Los
microorganismos tienen un gran potencial para contribuir a la solución de múltiples
problemas de la agricultura, dentro de los cuales, los biofertilizantes con base en
Micorrizas Arbusculares MA son una alternativa para reducir pérdidas en los
procesos de multiplicación de especies. Estas tecnologías tienen aplicación de
fácil transferencia para los pequeños productores ya que son de bajo costos.
En la costa atlántica se está incursionando en el estudio microbiológico y la
aplicabilidad que tienen estos sobre el suelo, CORPOICA ha financiados estudios
microbiológicos con énfasis en micorrizas, especialmente con el objeto de
aumentar la producción de especies de importancia económica en la Costa

Atlántica como plátano, algodón, yuca y ñame, mediante el desarrollo e
implementación de metodologías de manejo y producción, que incluyan las
micorrizas arbusculares.
Sin embargo en el departamento del Cesar hay mucho por hacer acerca de la
multiplicación y obtención de especies nativas de hongos MA que sirva para
mejorar la producción y sostenibilidad de un cultivo específico. Estudios
financiados por la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria
(CORPOICA) ha incursionado en el estudio de las micorrizas sobre suelos
algodoneros deteriorados en Codazzi y san Juan del cesar, obteniendo respuestas
positivas en las plantas tratadas.
Las micorrizas tienen gran potencial para contribuir a una producción sostenible.
Sin embargo, se resalta la importancia de profundizar en la investigación sobre el
uso de micorrizas nativas o del sitio, lo que implica conocer más sobre la relación
hongo-planta, buscando aislar cepas específicas que permitan potencializar el
crecimiento y productividad de los árboles en determinados agroecosistemas y
evaluar las interacciones de estas con otros microorganismos de dicho suelo.
El estudio de microorganismos en un cultivo con producción sostenible y sin
aplicación de agroquímicos como ocurren en las plantaciones de cacao de Pueblo
Bello - Cesar. Se pueden detectar actividades rizosférica importantes y reconocer

microorganismos promisorios para mejorar el estatus de nutrientes en el suelo y la
productividad en los cultivos, información que se divulgaría en la zona estimulando
más la incursión en el establecimiento de más hectárea cultivable con este
sistema agroecológico con menos costos de insumos para mantener la
producción.
En la evaluación del proceso de multiplicación de hongos MA, se han usado
diferentes tipos de inóculos, entre ellos nativos de agroecosistemas bananeros del
Urabá (Antioquia-Colombia),con diferentes plantas hospedadoras para determinar
la infectividad y efectividad sobre plantas de banano (Musa AAA cv. Gran Enano).
La colonización micorrizal promedio general de los MA a las plantas trampa fue de
37,76. Se ha observado que las plantas micorrizadas se benefician en diferente
magnitud. (Usuga Osorio; Castañeda Sánchez 1999)
4.2 Bases Teóricas
4.2.1 La micorriza
Las micorriza debe entenderse como una estructura especializadas con diversas
funciones, la cual se origina al asociarse, en forma mutualista, diversos grupos de
hongos específicos con el sistema radical de la planta.

4.2.2 Tipos de micorrizas
4.2.2.1Ectomicorrizas
Las ectomicorrizas crecen en el exterior de las raíces formando una auténtica
capa que envuelve a aquellas y que se llama el manto creciendo hacia el interior
entre las células formando retícula que recibe el nombre de “red de Harting”.
Las ectomicorrizas en general son bastante específicas, lo que quiere decir que
una especie de hongo solo puede vivir con una o unas pocas especies de plantas.
Las esporas sólo germinan en contacto con una raíz y las esporas sin germinar
tienen un período de viabilidad también corto. Además los hongos de este grupo
son además específicos a la planta, en general específicos al medio (suelo, clima,
etc.) y en general mucho más sensibles a las agresiones externas que las
endomicorrizas.

4.2.2.2 Endomicorrizas
Son poco específicas, lo que quiere decir que una especie puede infectar a un
gran número de especies vegetales. Son mucho menos sensibles a las agresiones
externas que las ectomicorrizas, sus esporas germinan con facilidad alejadas de
raíces vivas y pueden crecer considerablemente sin contacto con ninguna raíz, lo
que les permite localizar a éstas y pueden sobrevivir durante dilatados períodos de
tiempo (meses) sobre trozos de raíz si otras condiciones no son adversas. Como
su nombre indica viven en el interior de la raíz, en los espacios intercelulares y si
emiten hifas al interior de las células que se subdividen formando estructuras en
árbol (arbúsculo) dan origen al grupo de hongos micorrízicos más abundante que
se conoce.

Proceso de infección de la micorriza
La infección o colonización de una raíz por parte de un hongo micorrizógeno es un
proceso que involucra una secuencia de etapas reguladas de una precisa
interacción entre endosimbionte y hospedero.
La pre-infección está asociada a la actividad de los propágulos infectivos
presentes en el suelo que circunda la raíz. Dichos propágulos pueden ser esporas
o micelios fúngicos. Este último, generalmente se encuentra vinculado a raicillas
de plantas vivas o segmentos de raíz infectada.
La penetración se inicia con la formación de un “punto de entrada” que se
caracteriza por el desarrollo de un abultamiento o apresorio en el punto de
contacto sobre la superficie de la raíz. Cada espora genera un solo punto de
entrada, mientras que un segmento de raíz puede eventualmente generar más de
uno. No es del todo claro si el mecanismo de penetración esta mediado por un
evento enzimático, por un evento mecánico o por una combinación de ambos.
Una vez que penetre el hongo se asegura un proceso proliferativo que conduce
al establecimiento de una unidad de colonización que se puede extender hasta un
centímetro de distancia a partir del punto de penetración. El avance de la infección
está restringido a la epidermis y el parénquima cortical. La unidad de colonización
avanza mediante el crecimiento de hifas aseptadas que se extienden por entre las

células corticales y que generan estructuras características como los arbúsculos y
las vesículas
Algunas semanas después iniciada la infección, el hongo está en condiciones de
esporular, lo cual supeditado a las condiciones ambientales del suelo en particular
la humedad parece ser un factor regulador de importancia, ya que se ha visto
que le estrés hídrico en el suelo dispara la esporulación (Guerrero, et, al 1996).
Las hifas externas están en capacidad de reinfectar el mismo sistema de raíz del
cual se origina. Algunas de estas hifas generan “puntos de entrada” que provocan
nuevas unidades de colonización, lo cual supone la infección avanza a lo largo de
la raíz a través de unidades de colonización discontinuas. Este proceso de
proliferación se puede trasladar a otros sistemas de raíz vecinos de la misma o
diferente especie de planta. Se ha establecido que los hongos micorrizógenos se
pueden mover en el suelo a razón de 0.6 -3.2 m/año, lo cual da una idea de las
posibilidades de expansión de la infección micorrizica (Powell, 1970, citado por
guerrero, 1996). Figura 1

Figura 1: Proceso de formación de micorriza arbuscular (Guerrero, et, al 1996)

Las ventajas de la aplicación de micorrizas en un sistema agroecológico son:
· Mayor crecimiento y desarrollo de las plantas en beneficio de la adaptación
y eficiencia de éstas al facilitar una mayor absorción de nutrientes minerales del
suelo.
La capacidad de la raíz para absorber nutrientes del suelo unido al movimiento de
estos en el suelo, permiten su absorción por la planta. La tasa de absorción de
iones de alta movilidad en el suelo (como el nitrato) está determinada por la
especie vegetal o la variedad, y la de iones poco móviles, como el P, Zn, Mo y en
menor grado el K, S y NH4, dependen más de la densidad de las raíces por
volumen de suelo.
En este caso, la absorción de los nutrientes la determina la morfología de la raíz y
el crecimiento del hongo micorrícico en el suelo. Las hifas del hongo no son
capaces de absorber del suelo nutrientes diferentes a aquellos que están
disponibles para la raíz, bien sea en la solución del suelo o las rápidamente
intercambiables. La micorriza solamente aumenta la eficacia de la absorción de
nutrientes por la planta; así, las plantas cultivadas y asociadas con hongos
eficientes pueden usar el abono aplicado entre 2 y 10 veces más que las plantas
micorrizadas y abonadas (Mosse y col., 1986).
La solución del suelo contiene una concentración relativamente baja de P y
alrededor de la raíz se forma rápidamente una zona carente de este elemento.
Como la hifa de los hongos formadores de la micorriza vesículo-arbuscular (MA)

crecen mas allá de la zona agotada de la raíz, permiten que el suelo sea mas
intensivamente explorado. El P, una vez absorbido por la hifa en forma de
ortofosfato, es transportado por polifosfato hacia el interior de la raíz donde es
liberado (Herrera y col., 1984).
· Mejora el reciclado de nutrientes en el suelo.
La micorriza interactúa significativamente en los reciclajes de nutriente por la
intensiva exploración del suelo a través de las hifas de los hongos MA,
incluyéndose la perdida de nutrientes por la fijación química o la lixiviación,
después de la mineralización de la materia orgánica.
· Aumenta la eficiencia de otros microorganismos que tienden a asociarse
con ellas, tales como Rizhobium, Azospirillum, Azotobacter, que a su vez
incrementan la captación de nutrientes para las plantas.
(Fitter, 1998), encontró que las micorrizas interactúan con otros organismos del
suelo y estas interacciones pueden inhibir (crean competencia entre ellos) o
estimular (forman asociaciones mutualistas). Sin embargo, en muchos casos no
ha sido posible definir completamente dichas interacciones. Entre los organismos
mencionados pueden estar hongos patógenos (a nivel del micelio interno),
protozoarios, nemátodos y artrópodos.

· Mejora el control de enfermedades y la disminución en gasto de insecticidas
y funguicidas, con el uso de plantas micorrizadas.
En investigaciones realizadas, se encontró que la mezcla de bacterias del genero
Rhizobium con micorrizas, dan mayor vigor a la planta, lo cual la hace más
resistente al ataque de patógenos, porque las micorrizas forman una barrera física
impenetrable en la superficie de las raíces, variando en grosor y densidad
(INGHAM, 2003). Además se encontró que especies de micorrizas parasitan a
otros hongos como es el caso del Trichoderma y lo destruyen. Sin embargo
existen interacciones donde las micorrizas pueden sobrecolonizar la planta y
convertirse en parásitos ( FITTER AH, GARBAYE J, 1994 ).
· Produce plantas más resistentes al ataque de patógenos.
Varios autores concuerdan en que las micorrizas pueden contribuir a la salud de la
planta y a su productividad al aumentar el desarrollo de tolerancia a enfermedades
y parásitos (READ D. J. 1991). Las ectomorrizas protegen la raíz ya que reciclan
los carbohidratos, aminoácidos y otros compuestos producidos por las raíces,
capaces de atraer agentes patógenos. Además proveen una barrera física a
patógenos debido a la formación del manto, en el cual las hifas individuales o
cordones de hifas crecen hacia afuera, introduciéndose en el suelo, y hacia
adentro, intercalándose entre las células del córtex de la raíz a través de la lámina
media, formando un entramado denominado red de Harting.

En esta red el micelio deja de estar tabicado, es xenofitico, lo que se interpreta
como ventaja para acelerar los procesos de intercambio. La red de Harting puede
sintetizar compuestos como el diatretinenitrilo, con efecto de tipo antibiótico. Así
mismo, (RADDATTZ E. 2002) reporta tolerancia contra ataques de nemátodos.
· Facilitan la adaptación a suelos salinos.
La salinidad es un factor limitante de la producción agrícola, los estudios sobre
micorrizas y tolerancia de las plantas a este estrés es relativamente reciente.
Resultados reportados por Barea, 2003, demuestran el efecto inducido por la
micorrización en la disminución de la deficiencia nutritiva provocada por
antagonismos iónicos, efecto secundario del estrés salino, lo que permite
crecimiento mayor de las plantas micorrizadas.
Concretamente, las micorrizas mejoran diversos procesos fisiológicos (incremento
del ritmo de intercambio de CO2, transpiración, cambios en la
conductancia estomática, eficacia en el uso de agua), aparte del derivado de la
captación de nutrientes. Adicionalmente, (Corredor 2003) y( Barea, 2003),
sugieren otros mecanismos para justificar el papel de las micorrizas en relación
con la tolerancia a salinidad, tales como la inducción de cambios hormonales o la
mejora en la capacidad de agua.

· Contribuyen con la disminución de la erosión. (Molina L. y Col 2005)
Se sabe que tanto el medio agrícola como los ecosistemas naturales pueden ser
afectados por procesos de degradación de diversa índole, en cuanto a su origen y
naturaleza, que inciden en la productividad y calidad de las cosechas y/o en la
estabilidad, diversidad y productividad de los ecosistemas. La utilización de
micorrizas no sólo ha facilitado mejor revegetalización en condiciones particulares,
como pueden ser la recuperación de suelos degradados por la minería y la
introducción de especies exóticas en distintas partes del mundo, sino también ha
mejorado la repoblación de especies vegetales en suelos forestales (3). Lo
anterior es confirmado por (LONDOÑO C, 2002), quien manifiestat que cuando se
aplican hongos edáficos, la pérdida por lixiviación, fijación y erosión se disminuye,
dado que la red de hifas captura y trasloca elementos nutritivos hacia la planta
desde sitios no explorados por la raíz; así en los sistemas selváticos de los
trópicos húmedos, el reciclaje de nutrientes de la materia orgánica descompuesta
hacia la planta, la hacen los hongos, principalmente por los sistemas micorrícico.
La falta de especificidad en la asociación micorrizal se ha mostrado con estudios
moleculares de DNA, al encontrar que una misma raíz puede albergar tres o más
especies de hongos micorrícicos (Clapp et al., 1995). Así mismo también se ha
comprobado la colonización de diferentes sistemas radicales por parte de un
mismo organismo fúngico (Chiariello et al., 1982; Francis & Read, 1984). La

proporción de especies de hongos micorrícico-arbusculares MA y especies de
plantas descritos (150/ 225000) puede explicar la baja especificidad existente
entre planta y hongo en la asociación micorrícica (Zobel et al., 1997). Esta falta de
especificidad puede condicionar una considerable diversidad en los componentes
de la red de micelio extramatricial, como sistema captador de nutrientes.
La ubicuidad y biodiversidad que presenta la micorriza dan la idea de un
organismo multifuncional, cuyo beneficio no se limita solamente al aumento de
toma de nutrientes -Fósforo especialmente- debido a un volumen mayor de suelo
explorado con ayuda de las hifas del hongo (Newsham et al., 1995). También está
jugando un papel muy importante en la composición de una comunidad vegetal,
pues el micelio presente en el suelo puede gobernar el establecimiento de una
planta. Además, la colonización de material de origen vegetal -y posiblemente
animal- en descomposición, hace de la micorriza un posible puente directo entre
plantas cultivadas y enmiendas orgánicas.
Recientemente se ha propuesto un árbol filogenético (cuadro 1) donde se incluyen
siete familias ancestrales, Glomeraceae Paraglomeraceae, Archaeosporaceae,
Acaulosporaceae, Gigasporaceae, diversisporaceae y pacisporaceae. De estas
dos últimas familias están en estudio para su reaclasificacion. Asi mismo se
incluye el género sclerocystis como parte del genero Glomus. (Schubler et al,
Walter, 2004)

Cuadro 1. Ubicación taxonómica y géneros de hongos formadores de micorriza arbuscular
(Schubler et al, Walter, 2004)
Taxonomía basada en la morfología de las esporas MA
Prácticamente, para la identificación taxonómica de las esporas MA se toman en
cuenta las características morfológicas de la hifa de sostén, el tamaño de la
espora, el cual es muy variable aun centro de la misma especie, sin embargo se
tienen algunos rangos de estas. Para Acaulospora entre 50-150 um siendo las
mas comunes entre 50 y 100 um, para Entrophospora entre 50- 150 um, para

Gigaspora 250- 300 um y 300- 450 um, Scutellospora 150- 400 um, sclerocystis
50- 350 y Glomus 10- 250.
Morton (1988) resume 11 formas diferentes que las esporas de MA pueden tener
(figura 2). Las esporas tienen características altamente variables, probablemente
porque son afectadas por el medio ambiente físico en el cual ellas se forman. Con
excepción de sclerocystis, en la mayoría de los otros géneros las esporas son
globosas o subglobosas, se han reportado proporciones de 44, 27 y 36% en
Glomus, Acaulospora y Gigaspora respectivamente (Gonzalez- Chavez, 1989).
Figura 2: Diversidad en forma de esporas de todos los géneros de hongos micorrizicos
arbusculares. A: globosas, B: subglobosa, C: ovoboide, E: elipsoidal, F: piriforme, G:
irregular, H: oblonga, I: reniforme, J: fusiforme, K: clavada (González- Chávez, 1989).

La diferencia del color de muchas especies, puede ser debido a pigmentos en la
pared de la espora o pigmentos del interior de esta. Tendencias significantes en el
grado de color de la espora son evidentes a nivel de género (Morton 1988).
Esporas de Glomus, Acaulospora y Scutellospora presentan un rango de color
hialino a negro, espora de Entrophospora exhiban variabilidad similar, pero cada
una de las tres especies descritas de este género, tienen un diferente color.
Esporas de Sclerocystis y Gigaspora tienen un rango más restringido en color,
siendo consistentemente café en la primera y hialinas y amarillo pálido en las
últimas.
El número de capas es una característica importante que se considera para
identificación de esporas, aunque varían aun dentro de géneros. Glomus,
sclerocystis y Gigaspora usualmente tienen 1-2 capas (80, 100 y 72%
respectivamente). Más de tres capas están presentes en esporas de Acaulospora,
Scutellospora y Entrophospora (75, 90 y 100% respectivamente, Morton 1986). A
esta observación, se adiciona la definición de Walker (1983) que es el grupo de
pared, entendido como la agregación de capas, las cuales pertenecen en
proximidad a otras a pesar de que la espora está rota.
Observaciones de la ornamentación de las capas ayuda de gran manera a la
identificación de las esporas. La ornamentación de la capa en general se presenta
en la capa laminada, única y membranosa. Las ornamentaciones no han sido
descritas en las capas de Gigaspora o sclerocystis. La ornamentación de la capa

laminada puede ser: proyecciones reticulares, espinas agrupadas. Verrugas,
retículos, etc. En la capa única: espinas poligonales, pústulas, tubérculos, etc.

5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Obtención de esporas nativas MA de cultivo de cacao.
5.1.1 Toma de muestras de suelo.
Para esta fase se seleccionó una plantación de cultivo de cacao (Theobroma
cacao) con árboles de diferentes edades (figura 3), se dividió el área de estudio
de la siguiente forma:
Zona A, árboles de 1-5 años
Zona B, árboles de 5-15 años
Zona C, árboles de15-30 años
Figura 3: Toma de las muestras de suelo en el municipio de Pueblo Bello- Cesar

Se tomó de cada zona un promedio de 15 muestras de suelo y raíces que se
homogenizaron para cada zona, estas se guardaron en bolsas plásticas de ziploc
y se refrigeraron a -4 grados centígrados y posteriormente se secaron a
temperatura ambiente por tres días.
5.1.2 Preparación del pre- Inóculo
Para la obtención de las esporas del pre-inóculo se utilizó el método de tamizaje
flotación-filtración propuesto por Sieverding, (1983) Del Centro De Investigación
De Agricultura Tropical (CIAT) y el método de L-DRYING modificado de
Tommerup y Kidby, (1979) para el secado de las muestras cuyo procedimiento es
el siguiente
5.1.2.1 Tamizaje-flotación-filtración:
Se pesaron 100g de suelo y se le agregó 1 litro de agua, se agitó vigorosamente,
luego se dejó sedimentar por 5 minutos las partículas pesadas y se procedió a
decantar a una serie de tamices de 150 um, 250 um, 65 u.m y 45 u.m uno
colocado sobre el otro (figura 4). Después se lavó la muestra con un chorro fuerte
de agua para que las partículas pequeñas pasaran a los tamices de menor calibre.
Estas fracciones fueron lavadas en un Beaker de 500 mL y se llenó hasta ¾ partes
con agua, luego se agitó la suspensión fuertemente por 10-15 segundos,
posteriormente se dejó sedimentar el suelo durante 2 min, se decantó lentamente
en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le colocó un papel filtro y se

complementó con una bomba de vacío, de manera que todo el material que se
encontró flotando en la superficie del agua quedó atrapado en el papel filtro, se
repitió el procedimiento con el suelo precipitado en el Beaker dos veces más.
Del papel filtro se realizó la posterior obtención, observación y cuantificación de las
esporas al microscopio con los objetivo de 4X, 10X Y 40X. Para su respectiva
multiplicación.
5.1.2.2 Secado de las muestras
El tamizado obtenido del suelo nativo se mezcló y se llevó a un recipiente de vidrio
para un posterior secado de las muestras, en esta etapa las muestras se llevaron
a una estufa de secado a una temperatura de 38º- 40º hasta que toda el agua se
evaporó. El suelo obtenido se maceró y fraccionó en porciones de 10g el cual se
utilizó como inóculo para las plantas trampa.

Figura 4: Tamizado de las diferentes muestras

5.2 Multiplicación de las esporas nativas de hongos MA en plantas trampas
de maíz (Zea mays)
5.2.1 Material vegetal :
Se utilizaron semillas de maíz (Zea mays) variedad ICA-109. Las semillas
seleccionadas para la siembra se desinfectaron con 500 mL de una solución de
hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto. (Figura 5).
Se seleccionó como hospedero de reproducción de hongos MA, el maíz (Zea
mays) ya que la literatura recomienda, que para multiplicar organismos
micorrizicos la planta trampa debe ser una gramínea, para disminuir el peligro de
los patógenos que pueden ser iguales o muy parecidos (Sieverding, 1984).
Adicionalmente, el maíz es de rápido crecimiento, desarrolla una abundante raíz
que es rápidamente infectada (Hayman et al., 1976; Owusu-Bennoah y Mosse,
1979; Skipper y Smith, 1979).
Figura 5: Semillas de maíz (Zea mays)

5.2.2 Preparación de sustratos:
la preparación del sustrato tuvo la siguiente relación 2:1; 2 de suelo y 1 de
cascarilla de arroz.
Se tomó suelo de la zona en estudio y junto con la cascarilla de arroz se procedió
a dividirse en fracciones de 1000g, cada una por separado se guardaron en
recipientes de aluminio tapados con papel del mismo material. Posteriormente los
recipientes fueron llevados a una estufa con una temperatura constante de 100ºC
durante 2 horas para su esterilización con el fin de eliminar microorganismos que
establecieran competencia y la posible presencia de propágulos de micorrizas ya
establecidas. Después de las 2 horas, los recipientes se retiraron de la estufa y se
dejaron en reposo por 48 horas. (Figura 6)
Figura 6: Preparación de los sustratos y tratamiento

5.2.3 Siembra
Para el establecimiento del micro-cultivo se realizó la mezcla del sustrato teniendo
en cuenta la relación de 2:1; 2 de suelo y 1 de cascarilla de arroz. Se llevaron a
unos 20 recipientes de icopor con capacidad de 1000g que sirvieron como
macetas. Se plantaron 4 semillas de maíz (Zea mays) por cada maceta teniendo
un total de 80 semillas sembradas. (Figura 7)
Figura 7: Siembra y aplicación del inóculo en los diferentes tratamientos
5.2.4 Preparación de los Tratamientos
El experimento consta de tres tratamientos de los cuales, dos de ellos estuvieron
inoculados con el pre-inoculo nativo obtenido de cultivo de cacao. El otro
tratamiento no se vio afectado por ningún carácter externo y las plantas tuvieron la

oportunidad de desarrollarse por sus propios medios constituyéndose en el
tratamiento control. Estos tratamientos se designaron de la siguiente manera:
Tratamiento 1: Inoculadas fertilizadas
Tratamiento 2: Inoculadas no fertilizadas
Tratamiento 3: Testigo o control
5.2.4.1 Aplicación de pre-inóculo:
Se tomaron 10 macetas con semillas y a cada una de ellas se les aplicó 10
gramos de pre-inóculo a 5 centímetros de profundidad. Luego las otras diez
macetas con sus respectivas semillas se dejaron sin inóculo como tratamiento
control.
Transcurridos 15 días después de la siembra se procedió a realizar el corte
(raleo) de las plantas mas pequeñas dejando las mas desarrolladas en cada
maceta con el fin de evitar competencia.
5.2.5 manejo de los tratamientos
Se aplicaron soluciones nutritivas o iniciadoras buscando ajustar el nivel de
nutrientes para el desarrollo de los hongos, ya que según Brundrett, et al (1996) el

sustrato debe poseer un nivel moderado de nutrientes para estimular la asociación
entre el hongo y la planta. (Figura 8).
Para caracterizar al tratamiento 1 se preparo una solución del fertilizante
Nutrifoliar, al 40% de concentración. Que se le aplico al tratamiento 1 cada 15
días a partir de los 45 días de edad, hasta los 90 dias de edad. Las plantas tenían
una altura promedio de 23.5 cm . La composición del fertilizante nutrifoliar se
muestra en el cuadro 2.
Elemento g/L
Nitrógeno total 200,0 g/L
Fosforo asimilable 100,0 g/L
Potasio soluble 50,0 g/L
Magnesio 10,0 g/L
Azufre 14,0 g/L
Cobre 1,5 g/L
Hierro 2,5 g/L
Manganeso 1,0 g/L
Molibdeno 1,0 g/L
Zinc 0,03 g/L
Cuadro 2: Composición del fertilizante Nutrífoliar por g/L

La duración del desarrollo de las plantas de maíz fue de tres meses, en condición
de vivero.
Figura 8: Aplicación de las soluciones nutritivas a los tratamientos
5.3 Evaluación de la infectividad y efectividad de la multiplicación de los
hongos MA nativos
Las variables respuesta a utilizar son los número de esporas por gramo de suelo,
porcentaje de infección y el desarrollo vegetativo (altura y peso seco) de las
plantas.

5.3.1 Numero de esporas por gramo de suelo utlilizando el método de Flotación –
Filtración planteado por el CIAT.
Se pesó 10g de suelo tamizado y se llevó a un beaker de 500 ml, se le agregó 300
ml de agua y luego se agitó la suspensión fuertemente por 10-15 segundos,
posteriormente se dejó sedimentar el suelo durante 2 min. Se decantó lentamente
en un embudo de Buhner (figura 9) al cual se le colocó un papel filtro y se
complementó con una bomba de vacío, de manera que todo el material que se
encontraba flotando en la superficie del agua pasó al papel filtro (figura 10). Luego
se repitió el procedimiento con el suelo precipitado en el beaker unas dos veces
más.
Para cada fase de decantación se cambió el papel filtro, enumerándolos para una
posterior obtención, observación y cuantificación de las esporas al microscopio
con los objetivo de 4X, 10X Y 40X.
Figura 9: Método Flotación- filtración de las muestras de suelo

Figura 10: Papel filtro con los sedimentos después del filtrado y corte del mismo para
observar al microscopio

5.3.2 Determinación de porcentaje de infección
Para hallar el porcentaje de infección se dividió en dos etapas; la primera consistió
en la tinción de las raíces de los diferentes tratamientos y la segunda etapa en
calcular la infección mediante el método de interceptos de McGonigle et al (1990)
para determinar porcentaje de MA
5.3.2.1 Tinción de las Raíces
Se tomaron las raíces de las plantas trampas del tratamiento 1 y el tratamiento 2
por separado, las raíces se lavaron con abundante agua con la ayuda de un tamiz
convencional para eliminar todo el suelo, luego se introdujeron en un tubo de
ensayo al cual se agregó una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10%
hasta cubrir las raíces por completo y se llevó al baño de maría a una temperatura
de 97º C por un tiempo de una hora con el fin de despigmentar las las raíces.
Transcurrido este tiempo y con ayuda de unas pinzas se lavaron las raíces con
agua corriente, luego se adicionó acido clorhídrico (HCl) al 10% hasta taparlas
completamente. Se dejaron reposar 15 minutos, pasado este tiempo se escurrió el
exceso de ácido pero sin lavar las raíces. Se le adicionó el colorante (azul de
tripán en lactoglicerina) y se llevaron las raíces a baño de maría durante 5
minutos. Posteriormente se decantó el colorante y se filtró para reutilizarlo, las
raíces teñidas se conservaron en lactoglicerina limpia para su posterior
observación al microscopio. (Figura 11)

Figura 11: Método para la tinción de las raíces
5.3.2.2 Evaluación de la colonización micorrizica por el Método de Interceptos de
McGonigle Etal (1990)
Se tomaron las raíces ya teñidas y se arreglaron los segmentos en las láminas
portaobjetos a lo largo (figura 12). Luego se le coloco un cubreobjeto suavemente
para evitar la formación de burbujas, y se llevó al microscopio. El campo óptico
del microscopio se movió a través de la lámina, se utilizó el indicador de ocular
como línea de intersección. En cada intersección se registró algunas de las
siguientes posibilidades.

Figura 12: Raíces de las diferentes plantas en laminas portaobjetos
La línea puede interceptar:
· NI=sección no infectada
· A=arbúsculos
· V=vesículas
· H=hifas micorrizicas (exclusivamente)
Se debe tener en cuenta que:
1. Arbúsculos (A) y vesículas (V) pueden ser interceptados a la vez, en este
caso se sumó un registro para cada categoría, pero se sumó un solo
campo para el total de intersecciones observadas.

2. Las hifas micorrizicas pueden también fueron interceptadas en A y V pero
no se sumaron a H ya que en esta categoría se registraron solo los casos
de presencia exclusiva de hifas en la intersección.
3. Las hifas que se registraron en H fueron solo las que se consideraron
micorrizicas basándose en características morfológicas.
4. Las intersecciones con hifas de las que no se tuvo la certeza de que eran
micorrizicas o bien con hifas claramente pertenecientes a otros hongos no
micorrizicos se registraron como NI.
Se examinaron 100 intersecciones para cada muestra de raíz asignando cada
intersección en una de las categorías mencionadas: NI, A, V y H.
El porcentaje de micorrización (%M.A) se calculó de la siguiente manera.
%M.A= (# Intersecciones – NI) x 100 / # Intersecciones observadas.
5.4 Identificación de esporas de hongos MA multiplicados en el

cultivo trampa
Las plantas se midieron cada 15 días a partir de los 45 días hasta completar
los tres meses (90 días), realizándose en total 4 mediciones por tratamiento,
posterior a esto se eliminaron los riegos para inducir un estrés hídrico con el
objeto de estimular la esporulación de los hongos durante una semana. Mas
tarde se procedió a medir y a separar la planta en hojas, tallo (parte aérea) y
raíz. (Figura 13, 14). Este material vegetal fue pesado e introducido en bolsas
de papel previamente identificadas, luego se colocaron dentro de una estufa de
secado a una temperatura de 70ºC por un período de 48 horas hasta obtener
un peso constante, luego el material vegetal fue pesado nuevamente para
determinar los indicadores de peso seco.
Figura 13: Corte de la raíz y parte aérea de la planta

Figura 14: Peso de las raíces y parte aérea de las plantas
5.4 identificación de los hongos nativos multiplicados en las plantas
trampas de Maíz.
Para la identificación taxonómica de las esporas de MA se tuvieron en cuenta las
características morfológicas de las hifas de sostén, el tamaño de las esporas, la
forma y el color de las mismas. Según el catalogo ilustrado de micorrizas
arbusculares de la amazonia colombiana (Peña-Venegas C. P., Cardona G. I.,
Mazorra A., Arguellez J. H., Arcos A. L. Catalogo Ilustrado. Instituto Amazónico de
Investigaciones Científicas SINCHI, 2006.).
(Schenck. Norman, the international culture collection of va mycorrhizal fungI
(INVAM), Florida, 1985)

6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1 Porcentaje de Infección Micorrizal:
Se obtuvieron segmentos radiculares con presencia de micelio y de estructuras
representativas de los hongos MA (arbúsculos y vesículas). (Figura 15, 16,17).
El análisis de varianza realizado a la variable del porcentaje de infección mostró
diferencias significativas entre porcentaje de infección del tratamiento 1 y el
tratamiento 2.
En los datos obtenidos se pudo observar que la infección de los hongos
micorrízicos se ve influenciado por la cantidad de nutrientes presentes en el
sustrato utilizado es decir, que el porcentaje de infección micorrizal es
inversamente proporcional a la cantidad de nutrientes presentes en el suelo, tal
como se observa en las graficas 14,15,16. El tratamiento con MA no fertilizado
alcanzó los valores mas altos en cada uno de los indicadores de infección
micorrizal (Hifas, Arbúsculos y vesículas).
En relación a este punto de vista algunos autores han señalado que el grado de
micorrización y colonización del sistema radical se ve influenciado por factores
como el grado de fertilidad del suelo y el pH (Barea, J. M. Y Azcon – Aguilar, C.
1982). Esto se corroboró con un análisis fisicoquímico realizado al sustrato de
cada uno de los tratamientos (Anexo 13). Con respecto a los nutrientes del suelo,
específicamente a la cantidad de fósforo se encontró que todos los tratamientos

mostraron niveles altos de este elemento, pero numéricamente dentro de los
tratamiento inoculados con MA, el tratamiento 2 se mostró con valores de 133,6
ppm; mientras que el tratamiento 1 tuvo un porcentaje de fósforo de 138,6 ppm,
estos valores llamaron la atención ya que diversos autores señalan que a medida
que los niveles de fósforo en el suelo aumentan, se disminuye la infección
micorrizal, esto se refleja en una diminución del porcentaje de infección, tal como
se aprecia en las plantas de tratamiento 1 las cuales presentaron los niveles de
infección micorrizal más bajos.
Figura15: Vesícula observado en el objetivo 10X

Figura 16: Arbúsculos observado en el objetivo 10X
Figura 17: Hifas observado en el objetivo 10X

Grafica 1: Porcentaje de infeccion por hifas
Para el porcentaje de infección por hifa los valores más altos fueron alcanzados
por las plantas del tratamiento 2 con un nivel de infección de 30,5 %, frente al
tratamiento 1 con valores de 12,16% (Grafica 1)

Para el porcentaje de infección por arbúsculos los valores más altos fueron
alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de infección de
2,333 %, mientras que en el tratamiento 1 no se encontraron dichas estructuras
(grafica 2).
Los arbúsculos son un conjunto de hifas intracelulares que forman un
enrollamiento con un alto potencial metabólico el cual sirve como centro de
intercambio bidireccional entre el hongo y la planta. Estos arbúsculos tienen un
período de vida muy corto que oscila entre 2 y 15 días, cuando un arbúsculos
muere o sucumbe es reemplazado por otro más joven, este relevo se repite
mientras el intercambio de nutrientes esta activo, cuando este intercambio cesa
todos los arbúsculos mueren y, de la colonización interna solo quedan las
vesículas que son estructuras de reserva de nutrientes del hongo. Este fenómeno
se pudo apreciar en el tratamiento 1 en el cual no se encontraron arbúsculos, pero
si se detectó la presencia de vesículas las cuales aparecen durante el periodo de
vida de los arbúsculos, evidenciando la presencia previa de arbúsculos en el
tratamiento 1 pero desaparecieron cuando cesó el intercambio de nutrientes,
debido a que el exceso de P, Mn, Fe, Cu y otros elementos, induce a una
disminución en la asociación simbiótica del hongo MA- Planta. Y la planta se ve
forzada a utilizar su propio sistema radical para la obtención de estos elementos
disminuyendo asi la infección micorrizal

Grafica 2: Porcentaje de infección por arbúsculos
Para el porcentaje de infección por vesículas los valores más altos fueron
alcanzados por las plantas del tratamiento 2 con un porcentaje de 15.5,
mientras que en el tratamiento 1 fue de 4.66. (Figura 3).
Las vesículas son estructuras globosas cuya función es de almacenamiento o
de reserva, ya que en su interior se encuentra densas gotas de grasa (Hodge A.
2000). La formación de vesículas es posterior a la de los arbúsculos y tiene
lugar a partir del hinchamiento de una hifa generalmente terminal. Esta

estructura es muy común en las especies del género Glomus Acaulospora,
Archaespora, Entrophospora excepto Gigaspora y Scutellospora (honrubia et al
1992). En el género Glomus las vesículas se caracterizan por que pueden
llegar a engrosar sus paredes y convertirse en esporas.
Debido a que la producción de vesículas depende de las actividades de los
arbúsculos, se puede afirmar que la cantidad de vesículas es directamente
proporcional a la cantidad de arbúsculos.
La disminución de vesículas en el tratamiento1 está corroborada por estudios
previos (Smith y Gianinazzi-Pearsson1989,Hetrick et tal 1989, Sieveverding
1991) observaron, que en ocasiones la fertilización con niveles altos de fosforo
reduce los porcentaje de infección y deprime el desarrollo de arbúsculos,
vesículas, hifas externas e internas y disminuye también el número de puntos
de penetración y de esporas (Figura 18)

Grafica 3: Porcentaje de infección por vesículas
6.2 Altura de las plantas
Los análisis de varianza y la prueba de media de Dunnett realizados a los
tratamientos 1, tratamiento 2 y tratamiento 3 no mostró diferencias
significativas. Sin embargo numéricamente se notó una diferencia en las
plantas del tratamiento 2 (inoculadas no fertilizadas) en el incremento de la
tasa de crecimiento, superando a los otros dos tratamientos (Grafica 4, figuras
18 y 19 ).

Cuando las plantas se asocian con el hongo para formar micorrizas
arbusculares (MA), se incrementa la absorción del fósforo y otros nutrientes
presentes en la solución del suelo por parte de estas plantas hospederas, esto
es debido a que las hifas del hongo se extienden y exploran un mayor volumen
de suelo, que sería imposible explorar con los pelos radiculares. Por esta razón,
las plantas micorrizicas alcanza un mejor desarrollo que las no micorrizadas en
suelos con bajos contenidos de fósforo disponible. Resultados similares fueron
reportados en muchos trabajos por autores como (Saif, 1977;Tinker, 1978;
Fortín et al., 2002).
Las estimulaciones de los hongos MA en el crecimiento de la planta están
normalmente acompañado de un incremento en el contenido y frecuentemente
la concentración de algunos nutrientes minerales en los tejidos de la planta.
En numerosos trabajos experimentales se ha puesto de manifiesto que como
consecuencia de la formación de la MA, tiene lugar normalmente una
considerable estimulación al ritmo de crecimiento de la planta. La causa de
tales acciones es fundamentalmente inducida por el hongo, aunque como
consecuencia de la formación de la MA se producen diversos cambios
fisiológicos que con mayor o menor grado pueden contribuir dicho incremento al
crecimiento (Smith y Read, 1997)

Grafica 4: Altura de las plantas en los tratamientos 1, 2 y 3.
Figura 18: Comparacion altura de plantas del tratamiento 2 y tratamiento 3

Figura 19: Crecimiento de parte foliar y raíz de las plantas con micorriza y sin micorriza

6.3 Determinación de biomasa (peso seco)
El análisis de varianza realizado a la variable peso seco mostró diferencias
significativas entre los tratamientos. En la prueba de medias por Dunnett
realizada a la parte aérea (hojas y tallos) se observó que el máximo valor fue
obtenido por el tratamiento 2 con un peso de 1,876 gr. (Grafica 5), de igual
manera el tratamiento 2 alcanzó un valor de 0,296 gr, siendo el más alto en la
variable peso seco de la raíz. (Grafica 6). Analizando las variaciones en el
tamaño de las plantas, no es extraño que las características morfométricas de
la variable en cuestión sean mayor en las plantas del tratamiento 2, ya que
según otros autores la presencia de MA hace aumentar la tasa de crecimiento y
un incremento en la producción de biomasa, y que este efecto es mayor en
suelos de baja fertilidad o desequilibrados nutrimentalmente, especialmente
cuando el contenido de fosforo asimilable es bajo (Smith y Read, 1997). El
aumento de la materia seca es debido a que las hifas de las MA exploran un
mayor volumen de suelo aumentando así la capacidad de absorción de
nutrientes en la planta. Se pudo observar que una de las plantas del
tratamiento 1 logro una altura de 35,6 cm y aun así el tratamiento 2 logró
superarlo en la cantidad de peso seco, teniendo plantas con alturas de 33,6 cm,
esto se debe a que la planta del tratamiento 1 a pesar de que eran altas
poseían tallos muy delgados, mientras que en las del tratamiento 2 tenían una
altura cercana 35,6 cm y poseían tallos con mayor diámetro.

Grafica 5: Porcentaje peso seco parte aérea
Grafica 6 : Porcentaje peso seco de la raiz

6.4 Análisis de la diversidad de hongos micorrizicos
En la grafica 7 se presentan los conteos totales de las esporas correspondientes a
10 gramos de suelo seco. Para esta variable según el Índice de margalef, que es
una medida utilizada en ecología para estimar la biodiversidad de una comunidad
con base a la distribución numérica de los individuos de las diferentes especies en
función del número de individuos existentes en la muestra analizada. Tiene la
siguiente expresión I=(s-1)/Ln N, donde I es la diversidad, s es el número de
especies presentes, y N es el número total de individuos encontrados
(pertenecientes a todas las especies). La notación Ln denota el logaritmo
neperiano de un número.
De acuerdo a este índice la diversidad es baja para cada tratamiento. Pero en
términos generales el porcentaje de esporas por 10 gramos de suelo no es bajo
para condiciones nativas, si tenemos en cuenta los datos reportados por Collins et
al (1991) quienes encontraron entre 0 y 49 esporas en 1 gramo de suelo en un
experimento en el que se evaluaron poblaciones MA asociadas en cultivos de
maíz y soya de cinco años. Igualmente Douds et al (1995) encontraron entre 1 y
43 esporas por 50 gramos de suelo en cultivo de maíz, soya y trigo en sistemas de
labranza convencional y mínima.
A partir del aislamiento de las esporas se encontraron seis de los géneros
conocidos: Glomus, Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Archaeospora y

Scutellospora (figuras 20, 21,22, 23, 24) siendo el más común el género Glomus
en cada uno de los tratamientos. Se logró incrementar el número total de esporas
del suelo muestreado, pero no en todos los géneros se obtuvo la misma tasa de
multiplicación. Esto coincide con lo señalado por Morton y Benny (1990), quien
observó que algunas especies presentes en los suelos pueden disminuir su
número o incluso desaparecer, cuando se les intenta multiplicar en macetas de
propagación, debido a factores ambientales desconocidos o a las condiciones del
invernadero, otras especies raras o aparentemente inexistentes pueden en cambio
incrementar su número.
Grafica 7: Numero de esporas por género en cada uno de los tratamientos

Figura 20: Entrophospora (Dávila, Rosales, Ramos) Figura 21: Acaulospora (Rosales)
Figura 22: Glomus(Dávila, Ramos, Rosales) Figura 23: Archaeospora (Dávila, Rosales)

Figura 24: Scutellospora (Dávila, Rosales) Figura 25: Gigaspora
(Dávila, Ramos, Rosales)

7. CONCLUSIONES
El suelo del municipio de Pueblo Bello es rico en diversidad de esporas de
hongos MA.
Las plantas trampas de maíz (Zea mays) inoculadas respondieron
significativamente a la infección y esporulación por los hongos MA nativos,
mostrando mayores niveles de infección micorrizal y producción de esporas
MA en las plantas inoculadas no fertilizadas.
El mayor porcentaje de infección por hifas fue alcanzado por las plantas
inoculadas no fertilizadas.
El mayor porcentaje de infección por Arbúsculos fue alcanzado por las
plantas inoculadas no fertilizadas
El mayor porcentaje de infección por vesículas fue alcanzado por las
plantas inoculadas no fertilizadas
El mayor rendimiento en la tasa de crecimiento fue alcanzado por el
tratamiento de las plantas inoculadas no fertilizadas
Los mayores rendimientos de porcentaje de materia seca fueron
alcanzados por las plantas inoculadas no fertilizadas.

Existe una asociación inversamente proporcional entre el porcentaje de
infección y la cantidad de nutrientes presentes en el suelo.
El género micorrizico predominante con mayor abundancia relativa dentro
de la población de esporas aisladas en los tratamientos fue Glomus.
El tratamiento que mostró la mayor abundancia relativa de esporas fue el de
las plantas inoculadas no fertilizadas.
Las plantas inoculadas sin fertilizante respondieron significativamente a la
infección por hongos micorrizicos arbusculares con un alto contenido de
fosforo, a pesar que la literatura dice que cuanto hay alto contenido de
fosforo se inhibe la infección.

8. RECOMENDACIONES
Utilizar varias tipos de plantas trampas en la multiplicación de estos hongos
ya que los hongos MA no son altamente específicos en el momento de
infectar a una planta determinada pero si existe afinidad o compatibilidad
con ciertas especies vegetales.
Realizar nuevos aislamientos de hongos MA nativos en otras regiones
donde se cultiva cacao con el fin de caracterizarlas, identificarlas y evaluar
el comportamiento de las mismas, con el objeto de producir un pool de
estos individuos como inoculo potencial.
Establecer cultivos monoesporicos con el fin de evaluar la multiplicación,
infectividad y efectividad de cada uno de los géneros individualmente.
Evaluar los factores que afectan el proceso de micorrización en
condiciones naturales estableciendo la habilidad competitiva y estudiando
su infectividad en las plantas
Continuar con este tipo de investigaciones con el fin de evaluar las
micorrizas nativas en los diferentes cultivos agroforestales

Realizar cultivos monoesporicos con cada uno de los géneros multiplicados
para evaluar la infectividad y efectividad de cada uno de ellos.

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ANEXOS
Peso seco de la parte aérea de las plantas (en gr)
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 (control)
0,5 2,63 1,3
1 1,5 1,8
0,7 1,5 2,1
0 0 0
0 0 0
Anexo 1: Resultados del peso seco de la parte aérea de las plantas en los
diferentes tratamientos
Peso seco Raíz de las plantas (en gr)
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3
(control)
0,1 0,35 0,1
0,1 0,3 0,2
0,2 0,24 0,1
Gr gr gr
Gr gr gr
Anexo 2: Resultados del peso seco de la raíz de las plantas en gramos

Altura 45 días
(control)
19 37 35
25 32 34
27 34 34
20 36 32
25 31 21
Anexo 3: Altura de las plantas a los 45 días de edad
Altura 60 días
(control)
24 45 40
31 34 38
33 37 37
24 42 38
30 0 25

Altura 75 días
(control)
28 67 43
36 0 40
37 42 0
27 48 42
0 0 0
Altura 90 días
(control)
32 70 45
40 0 42
0 46 0
0 52 44
0 0 0

Número de esporas en 10 gr de suelo
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento X (suelo
nativo)
309 224 77
115 344 86
165 233 79
Anexo 7: Número de esporas en 10 gr de suelo
Infección por hifas
Tratamiento 1 Tratamiento 2
22 50
8 28
6 29
2 12
23 40
12 24
Anexo 8: Infección por hifas

Infección por arbúsculos
0 4
0 3
0 2
0 1
0 2
0 2
Anexo 9: Infección por arbúsculos
Infección por vesículas
0 14
1 16
0 17
1 10
15 15
11 21
Anexo 10: Infección por vesículas

Numero de vesículas por laminas
0 251
1 282
0 322
19 202
198 261
172 439
Anexo 11: Numero de vesículas por laminas
Tabla 8: Numero de esporas por genero
Genero Tratamiento
1
Tratamiento
2
Tratamiento
X (suelo
nativo)
Glomus 154 364 144
Entrophospora 12 78 22
Acaulospora 205 61 10
Archaeospora 21 48 13
Paraglomus 0 0 0
Gigaspora 20 67 17
Scutellospora 108 92 25
total 520 710 231
Anexo 12: Porcentaje de esporas por genero

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