Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
1. ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay)
Universidad de la Salle Colombia
Facultad de ciencias agropecuarias
Medicina Veterinaria
Bogotá-Colombia
Luis G. Perez
Yeili Álvarez Niño
Andrés Ricardo Avellaneda
2. SE DEBE ENTENDER
ANTÍGENO (Ag): Molécula exógena, que se encuentra en la
superficie de un agente patógeno, y que al entrar en contacto con el
organismo, induce la producción de una respuesta del Sistema Inmune
específica (formación de Acs)
ANTICUERPO (Ac): Proteína producida como respuesta a
una sustancia “extraña” (Ag) y que tiene la capacidad de combinarse
con él (complejo Ag-Ac).
3. QUE ES ?
El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática.
4. Al estar uno de los componentes (Ag o Ac)
marcado con una enzima e insolubilizado sobre
un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la
reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y, por
tanto, será fácilmente revelada mediante la
adición de un substrato especifico que al actuar,
la enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de
un espectrofotómetro o un colorímetro.
5. Se usa en muchos laboratorios para determinar
si un anticuerpo particular está presente en la
muestra de sangre de un paciente.
6. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo,
involucra a un gran número de variables, tales
como selección de reactivo, temperatura,
medición de volumen y tiempo, que si no se
ajustan correctamente, puede afectar los pasos
sucesivos y el resultado de la prueba.
7. TIPOS
ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una
muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado
reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
• Directo: Detectan Ag
• Indirecto: Detectan Ac
• ELISA Sandwich
– Doble (DAS)
– Heterólogo (HADAS)
ELISA COMPETITIVO:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de
sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a
que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado
por el Ac presente en la muestra.
8. PROCEDIMIENTO
1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de Ags
o Acs.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el
pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac
no unido.
5. Adición del Ac secundario marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima
no unida.
8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10.Coloración.
10. ELISA DIRECTO
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs
específicos.
2. Lavado con solución salinaTween 20 como agente
tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Acs fijados
deficientemente o no fijados.
3. Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una
enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el
complejo quedará solubilizado.
4. Lavado para eliminar los Ags marcados que no
hayan reaccionado
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
12. ELISA INDIRECTO
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags
específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente
tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Ags fijados
deficientemente o no fijados.
3. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima;
si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará
solubilizado.
4. Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan
reaccionado.
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
14. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la
posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su
objetividad. Dicha automatización se puede conseguir
con un simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de lectura
automática de micro placas.
15. Los resultados finales de la lectura colorimétrica
se reflejan numéricamente mediante valores de
absorbancia o densidad óptica que se obtendrán
a la longitud de onda más adecuada para la
coloración final alcanzada.
16. RESULTADOS FALSOS POSITIVOS
• Reacciones cruzadas entre anticuerpos con
especificidades similares.
Enfermedades autoinmunes
Embarazadas
Presencia de virus como epstein barr, VIH, Etc.
• Contaminación cruzada entre muestras.
• Deterioro de los reactivos
• Errores técnicos
17. RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS
• Paciente no ha generado los anticuerpos en
estudio
• Los anticuerpos de la muestran no tienen
especificidad contra el antígeno de la prueba o
viceversa.
• Deterioro de los reactivos
• Errores técnicos
18. APLICACIONES CLÍNICAS:
Enfermedades producidas por parásitos: Toxoplasmosis,
Triquinosis, Tripanosomas…
Enfermedades producidas por Micoplasmas
Enfermedades producidas por bacterias: Mycobacterium
tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonella.
Enfermedades producidas por virus: Enfermedad de Newcastle,
Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia felina…
Otras aplicaciones:
• Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
• Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
• Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos
circulantes)
22. Resumen
Por más de medio siglo de uso, la vacunación con el toxoide tetánico ha
mostrado un elevado porcentaje de eficacia en la prevención del tétanos.
Este trabajo pretende introducir un ensayo inmunoenzimático en fase sólida
(ELISA) como método alternativo a la prueba de seroneutralización in vivo
utilizada en la evaluación de la potencia de las vacunas antitetánicas. Se
desarrolló un ELISA de tipo indirecto para la cuantificación de antitoxina
tetánica en suero de curiel a partir de un estándar con 29 UI/mL,
previamente calibrado. Se determinó la precisión, exactitud y linealidad del
ensayo. Se analizó la correlación entre el ELISA y la prueba biológica
mediante la evaluación de un total de 75 muestras de sueros por ambos
métodos. Por último, se estudió la respuesta individual de un grupo de
animales contra 15 lotes de toxoide tetánico. El ensayo demostró ser preciso
y exacto, con imprecisiones inferiores al 20% y valores de recuperación
entre el 90–110%. Las desviaciones del paralelismo mostraron coeficientes
de variación alrededor del 10%. El análisis por regresión lineal mostró una
buena correlación entre el ELISA y el ensayo biológico (R2= 0,989). El
método alternativo desarrollado probó ser una herramienta útil para la
determinación de la potencia de vacunas antitetánicas a partir de la
evaluación independiente de la respuesta de cada animal contra el toxoide
tetánico. Los niveles de seroprotección alcanzados se encontraron entre el
83–100%.
23. BIBLIOGRAFÍA
• Palacios, L. (2012). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay.
http://www.slideshare.net/lexass/presentacion-elisa-13245114
• Cultek (2006). Fundamentos y Tipos de ELISAs.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf
• Dra. Fernández, N. (2007). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay.
http://www.slideshare.net/aselle/elisa-14876995?from_search=2
• Jose, M. (2009). Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)
http://es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay
• Escobedo, J., Bautista, A., Correa, P., Mier, J., Pam, W., Valladares, J. (2012). Técnicas aplicadas a la
Proteómica. http://www.slideshare.net/angelicashantay/elisa-pasos-elaborado-por-jos-mier
• Savournin, O. et al. Técnicas serológicas en el diagnóstico de Leptospirosis. Estudio de 100 casos.
Rev. Ciencias Médicas Holguín, 1981. 2:51, sep-dic.
• Ochoa R, et al. Validación de un ELISA para la cuantificación de antitoxina tetánica en suero
humano. Vaccimonitor. 2000; 9(4):16-21.
Notas del editor
Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada.