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ELISA 
(enzyme-linked immunosorbent assay) 
Universidad de la Salle Colombia 
Facultad de ciencias agropecuarias 
Medicina Veterinaria 
Bogotá-Colombia 
Luis G. Perez 
Yeili Álvarez Niño 
Andrés Ricardo Avellaneda
SE DEBE ENTENDER 
ANTÍGENO (Ag): Molécula exógena, que se encuentra en la 
superficie de un agente patógeno, y que al entrar en contacto con el 
organismo, induce la producción de una respuesta del Sistema Inmune 
específica (formación de Acs) 
ANTICUERPO (Ac): Proteína producida como respuesta a 
una sustancia “extraña” (Ag) y que tiene la capacidad de combinarse 
con él (complejo Ag-Ac).
QUE ES ? 
El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs 
marcados con una enzima, de forma que los 
conjugados resultantes tengan actividad tanto 
inmunológica como enzimática.
Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) 
marcado con una enzima e insolubilizado sobre 
un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la 
reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y, por 
tanto, será fácilmente revelada mediante la 
adición de un substrato especifico que al actuar, 
la enzima producirá un color observable a 
simple vista o cuantificable mediante el uso de 
un espectrofotómetro o un colorímetro.
Se usa en muchos laboratorios para determinar 
si un anticuerpo particular está presente en la 
muestra de sangre de un paciente.
Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, 
involucra a un gran número de variables, tales 
como selección de reactivo, temperatura, 
medición de volumen y tiempo, que si no se 
ajustan correctamente, puede afectar los pasos 
sucesivos y el resultado de la prueba.
TIPOS 
ELISA NO COMPETITIVO: 
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una 
muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado 
reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color. 
• Directo: Detectan Ag 
• Indirecto: Detectan Ac 
• ELISA Sandwich 
– Doble (DAS) 
– Heterólogo (HADAS) 
ELISA COMPETITIVO: 
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de 
sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a 
que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado 
por el Ac presente en la muestra.
PROCEDIMIENTO 
1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac. 
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de Ags 
o Acs. 
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el 
pocillo. 
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac 
no unido. 
5. Adición del Ac secundario marcado con la enzima. 
6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac. 
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima 
no unida. 
8. Adición del sustrato. 
9. Unión del sustrato a la enzima. 
10.Coloración.
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA DIRECTO 
Consta de las siguientes etapas: 
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs 
específicos. 
2. Lavado con solución salinaTween 20 como agente 
tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Acs fijados 
deficientemente o no fijados. 
3. Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una 
enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el 
complejo quedará solubilizado. 
4. Lavado para eliminar los Ags marcados que no 
hayan reaccionado 
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz 
de actuar la enzima marcadora. 
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA INDIRECTO 
Consta de las siguientes etapas: 
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags 
específicos. 
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente 
tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Ags fijados 
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si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará 
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reaccionado. 
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz 
de actuar la enzima marcadora. 
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
LECTURA E INTERPRETACIÓN 
DE RESULTADOS: 
Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la 
posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su 
objetividad. Dicha automatización se puede conseguir 
con un simple colorímetro o espectrofotómetro de 
cubeta o con sofisticados equipos de lectura 
automática de micro placas.
Los resultados finales de la lectura colorimétrica 
se reflejan numéricamente mediante valores de 
absorbancia o densidad óptica que se obtendrán 
a la longitud de onda más adecuada para la 
coloración final alcanzada.
RESULTADOS FALSOS POSITIVOS 
• Reacciones cruzadas entre anticuerpos con 
especificidades similares. 
Enfermedades autoinmunes 
Embarazadas 
Presencia de virus como epstein barr, VIH, Etc. 
• Contaminación cruzada entre muestras. 
• Deterioro de los reactivos 
• Errores técnicos
RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS 
• Paciente no ha generado los anticuerpos en 
estudio 
• Los anticuerpos de la muestran no tienen 
especificidad contra el antígeno de la prueba o 
viceversa. 
• Deterioro de los reactivos 
• Errores técnicos
APLICACIONES CLÍNICAS: 
Enfermedades producidas por parásitos: Toxoplasmosis, 
Triquinosis, Tripanosomas… 
Enfermedades producidas por Micoplasmas 
Enfermedades producidas por bacterias: Mycobacterium 
tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonella. 
Enfermedades producidas por virus: Enfermedad de Newcastle, 
Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia felina… 
Otras aplicaciones: 
• Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..) 
• Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA) 
• Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos 
circulantes)
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Resumen 
Por más de medio siglo de uso, la vacunación con el toxoide tetánico ha 
mostrado un elevado porcentaje de eficacia en la prevención del tétanos. 
Este trabajo pretende introducir un ensayo inmunoenzimático en fase sólida 
(ELISA) como método alternativo a la prueba de seroneutralización in vivo 
utilizada en la evaluación de la potencia de las vacunas antitetánicas. Se 
desarrolló un ELISA de tipo indirecto para la cuantificación de antitoxina 
tetánica en suero de curiel a partir de un estándar con 29 UI/mL, 
previamente calibrado. Se determinó la precisión, exactitud y linealidad del 
ensayo. Se analizó la correlación entre el ELISA y la prueba biológica 
mediante la evaluación de un total de 75 muestras de sueros por ambos 
métodos. Por último, se estudió la respuesta individual de un grupo de 
animales contra 15 lotes de toxoide tetánico. El ensayo demostró ser preciso 
y exacto, con imprecisiones inferiores al 20% y valores de recuperación 
entre el 90–110%. Las desviaciones del paralelismo mostraron coeficientes 
de variación alrededor del 10%. El análisis por regresión lineal mostró una 
buena correlación entre el ELISA y el ensayo biológico (R2= 0,989). El 
método alternativo desarrollado probó ser una herramienta útil para la 
determinación de la potencia de vacunas antitetánicas a partir de la 
evaluación independiente de la respuesta de cada animal contra el toxoide 
tetánico. Los niveles de seroprotección alcanzados se encontraron entre el 
83–100%.
BIBLIOGRAFÍA 
• Palacios, L. (2012). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. 
http://www.slideshare.net/lexass/presentacion-elisa-13245114 
• Cultek (2006). Fundamentos y Tipos de ELISAs. 
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf 
• Dra. Fernández, N. (2007). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. 
http://www.slideshare.net/aselle/elisa-14876995?from_search=2 
• Jose, M. (2009). Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) 
http://es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay 
• Escobedo, J., Bautista, A., Correa, P., Mier, J., Pam, W., Valladares, J. (2012). Técnicas aplicadas a la 
Proteómica. http://www.slideshare.net/angelicashantay/elisa-pasos-elaborado-por-jos-mier 
• Savournin, O. et al. Técnicas serológicas en el diagnóstico de Leptospirosis. Estudio de 100 casos. 
Rev. Ciencias Médicas Holguín, 1981. 2:51, sep-dic. 
• Ochoa R, et al. Validación de un ELISA para la cuantificación de antitoxina tetánica en suero 
humano. Vaccimonitor. 2000; 9(4):16-21.

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Prueba de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

  • 1. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Universidad de la Salle Colombia Facultad de ciencias agropecuarias Medicina Veterinaria Bogotá-Colombia Luis G. Perez Yeili Álvarez Niño Andrés Ricardo Avellaneda
  • 2. SE DEBE ENTENDER ANTÍGENO (Ag): Molécula exógena, que se encuentra en la superficie de un agente patógeno, y que al entrar en contacto con el organismo, induce la producción de una respuesta del Sistema Inmune específica (formación de Acs) ANTICUERPO (Ac): Proteína producida como respuesta a una sustancia “extraña” (Ag) y que tiene la capacidad de combinarse con él (complejo Ag-Ac).
  • 3. QUE ES ? El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.
  • 4. Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o pocillo (inmunoadsorbente) la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar, la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
  • 5. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente.
  • 6. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
  • 7. TIPOS ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac, y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color. • Directo: Detectan Ag • Indirecto: Detectan Ac • ELISA Sandwich – Doble (DAS) – Heterólogo (HADAS) ELISA COMPETITIVO: El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el Ac presente en la muestra.
  • 8. PROCEDIMIENTO 1. Tapizado del pocillo con el Ag o Ac. 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de Ags o Acs. 3. Unión del Ag o Ac específico al Ag o Ac tapizado en el pocillo. 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag o Ac no unido. 5. Adición del Ac secundario marcado con la enzima. 6. Unión del Ac secundario al Ag o Ac. 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida. 8. Adición del sustrato. 9. Unión del sustrato a la enzima. 10.Coloración.
  • 10. ELISA DIRECTO Consta de las siguientes etapas: 1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos. 2. Lavado con solución salinaTween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados. 3. Adición de Ags marcados (“conjugados”) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado. 4. Lavado para eliminar los Ags marcados que no hayan reaccionado 5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
  • 12. ELISA INDIRECTO Consta de las siguientes etapas: 1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos. 2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo (ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados. 3. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado. 4. Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan reaccionado. 5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
  • 14. LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: Una de las grandes ventajas de la técnica ELISA es la posible automatización de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatización se puede conseguir con un simple colorímetro o espectrofotómetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automática de micro placas.
  • 15. Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada.
  • 16. RESULTADOS FALSOS POSITIVOS • Reacciones cruzadas entre anticuerpos con especificidades similares. Enfermedades autoinmunes Embarazadas Presencia de virus como epstein barr, VIH, Etc. • Contaminación cruzada entre muestras. • Deterioro de los reactivos • Errores técnicos
  • 17. RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS • Paciente no ha generado los anticuerpos en estudio • Los anticuerpos de la muestran no tienen especificidad contra el antígeno de la prueba o viceversa. • Deterioro de los reactivos • Errores técnicos
  • 18. APLICACIONES CLÍNICAS: Enfermedades producidas por parásitos: Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas… Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias: Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonella. Enfermedades producidas por virus: Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia felina… Otras aplicaciones: • Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..) • Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA) • Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos circulantes)
  • 22. Resumen Por más de medio siglo de uso, la vacunación con el toxoide tetánico ha mostrado un elevado porcentaje de eficacia en la prevención del tétanos. Este trabajo pretende introducir un ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA) como método alternativo a la prueba de seroneutralización in vivo utilizada en la evaluación de la potencia de las vacunas antitetánicas. Se desarrolló un ELISA de tipo indirecto para la cuantificación de antitoxina tetánica en suero de curiel a partir de un estándar con 29 UI/mL, previamente calibrado. Se determinó la precisión, exactitud y linealidad del ensayo. Se analizó la correlación entre el ELISA y la prueba biológica mediante la evaluación de un total de 75 muestras de sueros por ambos métodos. Por último, se estudió la respuesta individual de un grupo de animales contra 15 lotes de toxoide tetánico. El ensayo demostró ser preciso y exacto, con imprecisiones inferiores al 20% y valores de recuperación entre el 90–110%. Las desviaciones del paralelismo mostraron coeficientes de variación alrededor del 10%. El análisis por regresión lineal mostró una buena correlación entre el ELISA y el ensayo biológico (R2= 0,989). El método alternativo desarrollado probó ser una herramienta útil para la determinación de la potencia de vacunas antitetánicas a partir de la evaluación independiente de la respuesta de cada animal contra el toxoide tetánico. Los niveles de seroprotección alcanzados se encontraron entre el 83–100%.
  • 23. BIBLIOGRAFÍA • Palacios, L. (2012). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. http://www.slideshare.net/lexass/presentacion-elisa-13245114 • Cultek (2006). Fundamentos y Tipos de ELISAs. http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf • Dra. Fernández, N. (2007). E.L.I.S.A Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay. http://www.slideshare.net/aselle/elisa-14876995?from_search=2 • Jose, M. (2009). Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay) http://es.scribd.com/doc/15834994/Tecnica-de-ELISA-Enzyme-Linked-Inmuno-Sorbent-Assay • Escobedo, J., Bautista, A., Correa, P., Mier, J., Pam, W., Valladares, J. (2012). Técnicas aplicadas a la Proteómica. http://www.slideshare.net/angelicashantay/elisa-pasos-elaborado-por-jos-mier • Savournin, O. et al. Técnicas serológicas en el diagnóstico de Leptospirosis. Estudio de 100 casos. Rev. Ciencias Médicas Holguín, 1981. 2:51, sep-dic. • Ochoa R, et al. Validación de un ELISA para la cuantificación de antitoxina tetánica en suero humano. Vaccimonitor. 2000; 9(4):16-21.

Notas del editor

  1. Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada.