1. Cursada: Biogeoquímica
Carrera: Bioquímica
Introducción a la
METAGENÓMIC
A
Bioq Farm Andrea Méndez - 2018

2. Qué es Metagenómica?
Fuente: Nalin et al. Environmental metagenomics: an innovative resource of industrial biocatalysis. 2009

3. Estudios de Diversidad
Microbiana del Suelo

4. Técnicas moleculares no dependientes del cultivo microbiano utilizadas en el análisis de la diversidad
bacteriana de suelos. Abreviaciones: RDP, Ribosomal Database Project; FISH, hibridación fluorescente in
situ; PCR, reacción en cadena de la polimerasa; ARDRA, análisis de restricción de ADN ribosomal
amplificado; RAPD, amplificación aleatoria de ADN; T-RFLP, polimorfismo de fragmentos de
restricción terminales; DGGE, electroforesis desnaturalizante de gradiente en gel; RT-PCR, PCR en
Estudios de Diversidad
Microbiana del Suelo
Escalante et al. Soil bacterial diversity:
Microbial culture-independent
methods of study and biotechnological
implications. 2004

5. Extracción de DNA de suelo:
Reactivos a usar
Tampón de extracción (para 50
ml):
5 ml Tris-HCl 1M pH 8
10 ml EDTA 0.5M
5 ml tampón fosfato sódico 1M
(4.66 ml de Na2
HPO4
1M y 0.34 ml
de NaH2
PO4
1M)
30 ml de agua destilada
Tampón TAE 50x (para 500 ml):
121g Tris base
28.5 ml ácido acético glacial
50 ml EDTA 0.5 M pH:8
Llevar a volumen con H2
O deionizada.
Solución de carga:
En H2O
deionizada
Azul de bromofenol 0.25 %
Glicerol 30%
Gel agarosa al 1%:
•Disolver 0.5 g de agarosa en 50 ml de
buffer TAE
1X y agregar 1 µl de Gel Red (20000 X).
•Fundir en horno microondas.
•Volcar en el dispositivo para armado
de geles.
•Esperar hasta la polimerización.

6. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
2grSuelo
1) Tamizar 2 gr de suelo muestra

7. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
Tampón de
Extracción +
Lisozima
2) Añadir 3,6 ml de tampón
de extracción y 36 µl de
lisozima (300 mg/ml).
Qué está pasando?
Se necesita controlar pH
para efectividad de la
extracción. La lisozima
lisa las paredes celulares
(disrupción enzimática)

8. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
3) Incubar en agitación
durante 30 min a 37˚C.
Qué está pasando?
El calor ayuda a la lisis
celular

9. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
4) Añadir 900 µl de SDS 10%.
Mezclar bien por inversión
SDS 10%
Qué está pasando?
Se están solubilizando
las membranas celulares
mediante el uso de un
surfactante (disrupción
química)

10. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
5) Incubar en agitación
durante 30 min a 37˚C.
Qué está pasando?
El calor ayuda a la lisis
celular

11. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
6) Agregar 1,35 ml de NaCl 5 M
NaCl 5M
Qué está pasando?
NaCl también ayuda a
solubilizar las membranas
celulares (disrupción
química)

12. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
8) Añadir 450 µl de la solución de CTAB/NaCl
(10%/0,7M) (precalentar la solución para que esté bien
disuelta).
CTAB/
NaCl
9) Incubar durante 15 min a 65˚C.
Qué está pasando?
Se usa otro surfactante
(CTAB) para solubilizar
las membranas
celulares. El NaCl
remueve proteínas
(precipitación salina)

13. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
10) Centrifugar el tubo a 7100 rpm (6000 g) durante 10 min.
Qué está pasando?
Separo los detritos
celulares y otros
interferentes de la matriz
de los ácidos nucléicos

14. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
11) Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y conservar en hielo.
12) Añadir al sobrenadante 0.1 vol de acetato de sodio 3 M pH 4.8 y 0.7 vol de
isopropanol. Mezclar bien por inversión.
NaAc
3M
pH 4.8
Isopro-
panol
SOBRENADANT
E
Qué está pasando?
Acetato de sodio e
isopropanol precipitan
los ácidos nucléicos.

15. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
13) Centrifugar a 13000 rpm durante 20 min.
Qué está pasando?
Se favorece el proceso de
precipitación de los
ácidos nucléicos

16. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
14) Retirar el sobrenadante y añadir 3 ml de etanol 70%.
Etanol
70%
Qué está pasando?
El etanol 70% limpia el
pellet de cualquier
residuo de solvente
orgánico usado que
pueda interferir en pasos
posteriores

17. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
15) Centrifugar a 13000 rpm durante 20 min.
Qué está pasando?
Precipitan los ácidos
nucléicos limpios

18. Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
16) Eliminar el etanol y secar al aire
Qué está pasando?
Es necesario evaporar el
etanol porque puede
interferir en la PCR

19. 17) Resuspender en 100µl de agua destilada precalentada a 60-80°C
e incubar durante 10 min a 37°C.
Extracción de DNA de suelo:
Protocolo
Qué está pasando?
El calor ayuda a
solubilizar el pellet de
ADN/ARN para poder
utilizarlo posteriormente
(PCR, RT-PCR)

20. Resultados
Sembrado en gel de agarosa 1%:
oSembrar 20 µl de extracto al que se le adicionan 2 µl
de solución de carga.
oCorrer durante 40 min en cuba electroforética en
solución tampón TAE 1X. Condiciones de corrida: 70 V
Visualización en transiluminador (UV): ej mtras A, B, C, D
DNA genómico
Acidos húmicos
A B C D
Qué está pasando?
Se realiza una
electroforesis en gel para
chequear la calidad de
los ácidos nucléicos
extraídos para su
posterior uso.

21. DNA genómico listo para
utilizarse en:
• PCR 16S rDNA:
El análisis de las secuencias de los genes que codifican los ARN
ribosomales 16S (ADNr 16S) ha permitido establecer firmas moleculares a
varios niveles taxonómicos, utilizadas como la base de una identificación
bacteriana por comparación filogenética.
• Clonación molecular de DNA metagenómico me permite:
La caracterización filogenética de la diversidad microbiana .
La caracterización de nuevos genomas.
La elucidación de nuevas vías metabólicas
para la síntesis de metabolitos primarios y
secundarios.
La identificación de sistemas biológicos de
resistencia a compuestos contaminantes.
El descubrimiento de nuevas enzimas y biopolímeros.

22. Bibliografía
• Catroux et al. DNA extraction from soils: old bias for new
microbial diversity analysis method. (2001)
• Roose-Amsaleg et al. Extraction and purification of
microbial DNA from soil and sediment samples. (2001)
• Escalante et al. Soil bacterial diversity: Microbial culture-
independent methods of study and biotechnological
implications. (2004)
• Nalin et al. Environmental metagenomics: an innovative
resource of industrial biocatalysis. 2009
• Rastogi Verma et al. An improved method for soil DNA
extraction tu study the microbial assortment within
rhizospheric region. (2014)
• Cooper et al. Limitations and recommendations for
succesful DNA extraction from forensic soil samples: a
review. (2014)

23. Biogeoquímica