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  1. 1. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ELIMINACIÓN DE CÚMULOS DE HIDROCARBUROS Y ÁCIDOS GRASOS EN DRENAJE DEL ÁREA METROPOLITANA DE MONTERREY MEDIANTE BIORREMEDIACIÓN CON RHODOCOCCUS ERYTROPHOLIS. Proyecto para acreditar el curso de Metodología Científica Evidencia 6 Grupo 455, Equipo 1 Balli Morales Nahomy 1803547 Hernández González Angel Daniel 1923675 Vázquez Juárez Juan Maximiliano 1957770 Gómez Patiño José Rodrigo 1962138 De la Cruz Galván Laura Alicia 2075704 Profesor: Dr. Jesús Montemayor Leal San Nicolás de los Garza, N.L. Noviembre,19, 2022
  2. 2. Introducción Los desbordamientos de aguas residuales en los sistemas de recolección de alcantarillado suelen ser por la acumulación de grasas y aceites provenientes de los desagües de hogares, negocios y empresas que no cuentan con un correcto proceso de desecho de grasas. Estas grasas y aceites al enfriarse se pegan a las tuberías del alcantarillado restringiendo o bloqueando el flujo haciendo que el agua salga de las alcantarillas hacia las calles públicas, desagües pluviales y ríos provocando problemas para la salud pública. (Concord general services,2020) La biorremediación es un proceso que se basa en el uso de agentes biológicos, como los microorganismos, en la descontaminación del medio ambiente. Debido a su gran diversidad metabólica, las bacterias del género Rhodococus son candidatas para ser utilizadas en bioprocesos. (Sánchez, N, Sandoval, AH, Díaz-Corrales, F, & Serrano, JA. ,2004). Rhodococcus erytropholis es una bacteria perteneciente a la clase de Actinobacteria y a su vez, forma parte del orden de Actinomicetales. Los actinomicetos son bacterias filamentosas ampliamente distribuidas en el medio ambiente, son microorganismos heterótrofos, aerobios y crecen de forma óptima en un rango de PH de 5.0 a 9.0, crecen en un rango de temperatura de 25 a 30°C. Estas bacterias han sido estudiadas debido a su participación en procesos de fitorremediación Son relacionadas con una gran variedad de procesos de biodegradación de suelos contaminados con hidrocarburos. (González Jimenez,2010) Definición del problema El mal manejo de los residuos de grasas y aceites provenientes de hogares, restaurantes e industrias como causantes de cúmulos de ácidos grasos en las tuberías del drenaje pluvial provocando el desbordamiento de estos. Justificación Los cúmulos de grasas que se forman al desechar los residuos de grasas y aceites de manera no adecuada por los desagües afectan en la actividad óptima del sistema de alcantarillado provocando desbordamientos de aguas negras hacia las calles públicas y/o almacenamientos de agua potable y ríos provocando serios problemas de salud pública así como problemas económicos al tener que utilizar recursos económicos para la reversión de estos problemas de salud y de mal funcionamiento del drenaje pluvial. Los beneficios de la resolución de este problema traería consigo la disminución de personas infectadas por la ingestión de agua contaminada, así como la solución al problema de desbordamientos en lugares públicos por aguas negras, además de
  3. 3. que habría una reducción de costos en el tratamiento de este problema y en la reparación de daños. Las personas de la comunidad serían los más beneficiados al reducir el riesgo de infecciones y encharcamientos en lugares públicos, permitiendo así una mejor circulación de peatones y vehículos. Antecedentes Fat, oil and grease (FOG) 1. Cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el drenaje 1.1 Formación de FOG en sistemas de alcantarillado En el primer estudio para caracterizar su composición física y química (Keener et al., 2008), se encontró que los depósitos de FOG en el sistema de recolección de alcantarillado tenían una textura granulosa y similar a la arenisca. El color general de los depósitos de FOG varió de marrón claro a blanco. Keener et al. (2008) observaron un alto contenido de lípidos, siendo el ácido graso primario el palmítico. Otros ácidos grasos como el oleico y el linoleico se encontraron en cantidades significativas en estos depósitos de FOG. Fuera de los ácidos grasos, el calcio fue el metal más abundante encontrado en los depósitos de FOG. Un estudio de laboratorio ha demostrado que la mayoría de los ácidos grasos de cadena larga producidos en los interceptores de grasa se deben a actividades microbianas, que contribuyen potencialmente a la formación de depósitos de FOG en las líneas de alcantarillado (He y Yan, 2016). 1.2 Fuentes de componentes involucrados en la formación de depósitos de FOG Los ácidos grasos libres se generan principalmente a partir de la hidrólisis de FOG. Durante el proceso de cocción (p. ej., freír, hornear y asar a la parrilla), se ha descubierto que la hidrólisis rápida genera ácidos grasos libres tan pronto como la grasa entra en contacto con la humedad (Canakci, 2007). En su trabajo, Ducoste et al., (2008) identificaron a los restaurantes asiáticos como uno de los principales contribuyentes de FOG en los Estados Unidos, seguidos por los restaurantes de mariscos y los establecimientos de comida rápida. Además de las fuentes basadas en alimentos, los productos de jabón pueden ser el principal contribuyente a la presencia de ácidos grasos libres en los
  4. 4. sistemas de alcantarillado, que incluyen jabones duros, así como jabones y geles para afeitar para hombres. Sin embargo, no se han encontrado ácidos grasos libres en detergentes para ropa o productos de limpieza de cocinas (Szostak, 2013). Una encuesta exhaustiva de municipios en Noruega y Suecia mostró que las áreas residenciales tenían el segundo mayor número de problemas relacionados con FOG después de los centros urbanos, especialmente en las áreas de edificios de gran altura (Mattsson et al., 2014). Se sugirió que la generación preferencial de ácidos grasos saturados durante la cocción y la descomposición preferencial de los ácidos grasos insaturados por parte de las lipasas podría conducir a la generación de ácido palmítico en las aguas residuales (Iasmin et al. 2014). En 2014, Mahbuba L.; O. Dean S; . Lappi J;& J. Ducoste trabajaron para cuantificar los factores que pueden afectar la formación de depósitos de FOG y sus propiedades químicas y reológicas. Estos factores incluyen los tipos de grasas utilizadas en los FSE, las condiciones ambientales (es decir, pH y temperatura) y la fuente de calcio en los sistemas de alcantarillado. Los resultados de este estudio mostraron que el contenido de calcio en las sales a base de calcio parecía depender del límite de solubilidad de la fuente de calcio e influenciado por las condiciones de pH y temperatura 2. Rhodococcus erythropolis y la biorremediación 2.1 Procesos biológicos para la eliminación de FOG Brooksbank et al. (2007) demostraron que un suplemento de varias especies era capaz de mejorar significativamente la degradación de varias grasas y aceites en un 37-62 % después de incubarse durante 28 días. Nisol et al. (2009) observaron que la bioaumentación resultó en una diferencia significativa en la eficiencia de eliminación de FOG cuando la concentración de FOG afluente fue superior a 5000 mg/L durante un experimento a escala de laboratorio de 16 días. He et al. (2012) realizaron una evaluación de dos interceptores de grasa a gran escala, con y sin bioaumentación, durante un período de un año y demostraron que las concentraciones generales de FOG en el efluente del interceptor de grasa en ciclos bioaumentados no eran inferiores a las de los ciclos de control.
  5. 5. Tang et al. (2012) observaron que los ácidos grasos totales se redujeron en un 59 % en el efluente del interceptor de grasa y la formación de depósitos de FOG se redujo en un 40 % en las tuberías de alcantarillado después del tratamiento de un interceptor de grasa con un bioaditivo durante tres meses. Klaucans et al. (2018) mencionan que la biodegradación de FOG involucra múltiples enzimas consistiendo en lipasas, esterasas, proteasas, y amilasas. También dan como ejemplo la creación de una lipasa recombinante proveniente de E. coli que es capaz de mantener su actividad en condiciones adversas. Poh et al. (2016) describen el proceso de digestión anaeróbica de aguas residuales como el uso de microorganismos para la degradación de materia orgánica, como los lípidos, en la ausencia de oxígeno. Este proceso involucra una secuencia de reacciones, incluyendo hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y metanogénesis. 2.2 Rhodococcus erythropolis en la biorremediación Pucci et al. (2013) realizaron una investigación en la que utilizaron R. erythropolis para limpiar barros contaminados con petróleo provenientes de estaciones de servicio; concluyeron que R. erythropolis presentó un excelente potencial de biorremediación de hidrocarburos como lo son los aceites lubricantes, su posible empleo en la eliminación de barros provenientes de lavados de motores o de estaciones de servicio sería su aplicación más importante. De acuerdo a Peng et al. (2007) se encontró que Rhodococcus erythropolis produce tensoactivos utilizando hidrocarburos no solubles en agua. Al extraer Rhodococcus erythropolis y proporcionar n-hexadecano como fuente de carbono, encontraron que se produce ácidos grasos libres y glicolípidos. Kis et al (2015) llevaron a cabo un estudio en el que prueban la habilidad de Rhodococcus erythropolis para degradar grasas animales y aceites vegetales y se encontró que la bacteria fue capaz de utilizar todos los substratos dados pero la eficiencia para la degradación de cada uno depende de las condiciones ambientales, pero con poca variación. 3. Otros métodos capaces de degradar grasas
  6. 6. Los investigadores han sugerido que es necesario un tiempo de retención hidráulica (TRH) de 30 minutos o más para eliminar adecuadamente el FOG (Metcalf & Eddy, 1991). Los investigadores han sugerido que los cambios físicos, como la disminución de la longitud de la tubería de entrada, el uso de expansiones de tubería de entrada y salida, conexiones en T distributivas y otros accesorios que se pueden agregar fácilmente a los interceptores de grasa existentes, pueden conducir a mejoras significativas en la eficiencia de eliminación de FOG (Aziz et al., 2011). La actividad microbiana es otro contribuyente a la producción de ácidos grasos en los sistemas de alcantarillado. Los investigadores han identificado numerosos microorganismos capaces de degradar FOG utilizando lipasas extracelulares (Brooksbank et al., 2007; Kis et al., 2015). GI Boiko et al (2021) desarrolló un método de purificación que incluye la adición de un coagulante a base de un componente que contiene aluminio, seguido del espesamiento y filtración del precipitado. Se usó aleación de aluminio Rau-85 como componente que contiene aluminio. La aleación de aluminio se utiliza en forma de polvo estable en el aire. Composición de la aleación (% en peso): 85 aluminio, 5 indio, 5 galio y 5 estaño. El método se lleva a cabo en una etapa, es amigable con el medio ambiente, ya que no requiere grandes cantidades de coagulantes (10-50 g/t). Cuando la aleación se agrega al agua residual aceitosa, interactúa activamente con el agua con la formación de un precipitado de hidróxidos metálicos que absorben moléculas de aceite contaminantes. Este año (2022) Sudipti Arora, Sakshi Saraswat ,A.A. Kazmi desarrollaron una propuesta para un biofiltro con lombrices y que cuida casi todos los criterios sostenibles y económicos para su efectiva implantación. Se puede apreciar por el hecho de que las lombrices digieren todas las partículas en suspensión tamizadas en el lecho del filtro, y degradan la materia orgánica, y en el proceso de ingestión; airea pasivamente el sistema mediante la acción de excavación y elimina los patógenos. 4. Medidas que se han tomado 4.1 En Ecuador
  7. 7. Los autores León D., & Salcedo L. En 2006 elaboraron un ensayo en el que presentaban su propuesta de realizar una contratación de personal por medio de empresas tercerizadoras para la empresa municipal de agua potable y alcantarillado de la ciudad de Azogues EMAPAL. 4.2 En México La JAPAC exhortó a la población de Culiacán en 2017 a tomar medidas en contra los hundimientos ocurridos en ese año debido a la basura acumulada en el drenaje, presento estos consejos: “No desechar en el sistema de desagües, elementos sólidos que perturben el funcionamiento de las instalaciones, dado que las conexiones están diseñadas y construidas para permitir solamente el paso de líquidos o disposiciones excretas, etc....” En el 2021 el centro de investigación y asistencia en tecnología del estado de jalisco desarrollaron un proyecto para implementar la transparencia en la toma de decisiones de los recursos; la participación y la responsabilidad en la elaboración de presupuestos y la planificación a nivel nacional, estatal y municipal; y la planificación de la reutilización de las aguas residuales tratadas para reducir las extracciones de aguas subterráneas y reducir los vertidos a las aguas superficiales En una situación similar protección civil representado por José Carlos Espinoza Espinoza en 2022, a consejo a las personas de no tirar basura a los desahogues porque se avecinaba temporada de lluvias lo que traería consigo inundaciones y precipitaciones. 4.3 En Colombia En Arauca, Colombia debido a las malas prácticas de los civiles con su basura, tienden a sufrir de inundaciones del alcantarillado, por lo cual, el ingeniero Pascito Ramírez en el presente año, recomienda a los usuarios no depositar restos de comidas, servilletas, ni tampoco aceites en los lavaplatos; no arrojar papel higiénico, ni toallas higiénicas, ni algodones, cabellos y objetos sólidos al sanitario sino a la caneca de la basura; y que frecuentemente se vierta agua caliente a los desagües y cañerías de las viviendas 5. Efectos contraproducentes 5.1 Infecciones oportunistas
  8. 8. Fue identificado por Sánchez N., Sandoval A., Díaz F. Serrano J. en 2004, los procesos infecciosos causados por diferentes especies del género Rhodococcus. El principal patógeno reconocido dentro de este género es Rhodococcus equi, aunque otras especies como Rhodococcus luteus, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous y Rhodococcus globerulus también han sido descritas como agentes causantes de infecciones, sobre todo a nivel cutáneo y de la córnea. Recientemente, se ha observado como agente patógeno en los estudios de Ito C. en 2017 donde en circunstancias específicas es posible que cause septicemia en personas inmunodeprimidas. 5.2 Lipasas y sus efectos a la salud Aunque se considera que no existen muchos estudios que señalan su seguridad, el artículo de LaVozdeEcuadorⓇdeterminó en 2022 que puede causar reacciones alérgicas, problemas gastrointestinales e incluso efectos neurológicos. Objetivo general. Dar solución a la problemática causada por los cúmulos de ácidos grasos de las alcantarillas del sistema de drenaje público del área metropolitana de Monterrey mediante biorremediación con los procesos bioquímicos que presentan las bacterias del género Rhodococcus erythropolis. Objetivos específicos: ● Desarrollar un método de degradación de cúmulos de ácidos grasos e hidrocarburos mediante enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis ● Comprobar que este método sea reproducible y utilizable a escala masiva para la degradación de cúmulos de ácidos grasos en sistemas de drenaje ● Identificar los riesgos que conlleva el utilizar este método y presentar soluciones en caso de que estos riesgos estén presentes. Hipótesis Hipótesis Nula
  9. 9. Las enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis no son capaces de degradar eficientemente los cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el sistema de drenaje público de Monterrey. Hipótesis Alterna Las enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar eficientemente los cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el sistema de drenaje público de Monterrey. Liberando una descarga significativa de acumulaciones de material contaminante en el sistema de drenaje. Materiales ● Sonicador Branson Sonifier (VWR Company), con las siguientes indicaciones: Output control: 7, Duty Cycle: 60, Time: 10 minutos. ● Bacteria Rhodococcus erythropolis, obtenida de la American Type Culture Collection (ATCC No. 4277). ● Medio de crecimiento: ATCC medium: 1877 ISP Medium 1; Composición: Triptona (BD 211705) 5,0 g; Extracto de levadura 3,0 g; Agar 15,0 g; Agua destilada 1,0 L. ● Tritón X-100 ● Desecador ● Matraz Erlenmeyer ● Pipetas ● Cajas petri ● Centrifugadora Metodología Material biológico
  10. 10. Preparación de medio de crecimiento 1. Inocular Rhodococcus erythropolis en los medios de cultivo. 2. Colocar los medios de cultivo en un desecador saturado con monóxido de carbono, con agitación constante a 30 ºC. 3. Esperar 96 horas, tiempo necesario para que las células alcancen la fase de crecimiento exponencial. Material Químico Extracción enzimática 1. A un cultivo bacteriano crecido de 200 ml, agregar lisozima (2 ml por cada 25 ml de suspensión bacteriana), preparada en 0.89 g de NaCl y 100 ml de agua destilada. 2. Colocar las bacterias con lisozima en un baño maría durante 12 horas a 40 ºC. 3. Completar el rompimiento celular por sonicación. 4. Someter a sonicación un volumen final de 5 ml de la suspensión celular tratada con lisozima. 5. Colocar la muestra en hielo mientras se somete a sonicación, con el objetivo de evitar su calentamiento. 6. Los períodos de sonicación fueron de dos minutos con un período de descanso de 30 segundos. Obtención de la muestra 1. Identificar por medio de fuentes oficiales del sistema de agua y drenaje de Monterrey, las principales ubicaciones que estén relacionadas con problemas de acumulacion de cumulos de grasa. 2. Una vez identificadas las ubicaciones, se realiza una recolección de muestra utilizando un Auto-sampler para comprobar que la acumulacion esta hecha por cumulos de grasa. 3. Cuando las muestras positivas hayan sido seleccionadas, deberá obtenerse una muestra mensual durante el tratamiento en campo. Esto solamente se llevará a cabo si la enzima utilizada es útil para el tratamiento de cúmulos de grasa. Técnicas utilizadas
  11. 11. Purificación de los extractos enzimáticos crudos (Solubilización con el detergente Tritón X-100) 1. Agregar 200 mL de Tritón X-100 al extracto enzimático después de la sonicación. 2. Homogenizar la solución. 3. Centrifugar a 10.000 rpm durante 45 minutos en una centrífuga refrigerada. 4. Tomar el sobrenadante. 5. Retirar el detergente remanente mediante diálisis. Aislamiento de bacterias 1. Agregar 2gr de la muestra del suelo a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de un medio de sal mineral (MSM, Ph 7,4) 2. Agregar 0.5 g de extracto de levadura y solución de oligoelementos( ZnSO4 , 0,29 g; CaCl2 , 0,24 g; CuSO4 , 0,25 g; MnSO4 , 0·17 g l -1 ) 3. Verter 5.5 ml de agua destilada. 4. Como única fuente de carbono, agregar n-hexadecano al 2% v/v. 5. Esterilizar por filtración. 6. Realizar el enriquecimiento a 28°C a 150 rpm durante 5 días. 7. Aislar un cultivo puro en una placa de agar Luria-Bertani. 8. Confirmar degradación de aceite mediante la degradación del aceite en un MSM líquido que contenga n-hexadecano. Prueba de degradación de cúmulos in vitro. 1. Realizar un aislamiento de los cultivos utilizando únicamente los cúmulos obtenidos de las recolecciones en campo como fuente de energía y carbono. 2. Registrar la degradación en las cepas cada día por un mes. *Si los resultados son favorables y efectivamente existe una degradación significativa de este contaminante; el experimento podrá llevarse a cabo utilizando una mayor cantidad de cúmulos de grasa para simular la contaminación en los sistemas de drenaje seleccionados.
  12. 12. Prueba de resistencia enzimática Temperatura 1. Someter 3 grupos de 100mL de la solución enzimática a ambientes con temperatura de 2°C, 15°C y 30°C. (Temperaturas comunes en el el A.M.M) 2. Esperar 1 día y medir pureza mediante el uso de inhibidores específicos a la enzima pH 1. Preparar 3 vasos con 100mL de la solución enzimática y agregar 20g de una muestra de cúmulo de grasa 2. En el primer vaso agregar gradualmente un ácido fuerte y observar a qué pH disminuye la actividad enzimática mediante un pH-metro 3. En el segundo vaso agregar gradualmente una base fuerte y observar a qué pH disminuye la actividad enzimática mediante un pH-metro 4. Mantener el tercer vaso a pH neutro como control Tiempo 1. Preparar 3 vasos con 100mL de la solución enzimática 2. Guardar los vasos por 1 día, 3 días y 6 días respectivamente 3. Medir la pureza enzimática mediante el uso de inhibidores específicos a la enzima Análisis estadístico Chi-cuadrada para determinar la degradación en las placas 1. Se inocularon 20 platos diferentes con Rhodococcus Erytopholis.
  13. 13. 2. Se registraron las placas que se habían degradado a través de un año dividido en meses. 3. Determinamos las hipótesis, Ho: No hubo degradación; Ha: Si hubo degradación 4. Una vez anotadas las cantidades de placas que presentaron degradación las agrupamos en 12 grupos (Ene - Dic). 5. Los datos se deben agrupar en una tabla de datos observados y posteriormente calcularemos los “datos esperados” en otra tabla con esta fórmula Ei = (n1 *n2) / n 6. Calculamos X2 = (Oi - Ei)^2 / Ei, para sacar el dato calculado. 7. Definimos el valor de tablas X2 utilizando el valor crítico. 8. Comparamos el valor calculado con el valor crítico y hacemos la decisión estadística Bibliografía 1. Aurora, S., Saraswat, S., & Kazmi, A. A. (2022). Vermifilter: A biofilter with earthworms for wastewater treatment. En M. Shah, S. Rodriguez-Couto, & J. Biswas (Eds.), An Innovative Role of Biofiltration in Wastewater Treatment Plants (WWTPs) (pp. 87–112). Elsevier. 2. de Anda, J., & Shear, H. (2021). Sustainable wastewater management to reduce freshwater contamination and water depletion in Mexico. Water, 13(16), 2307. https://doi.org/10.3390/w13162307 3. Oil, sewage, heavy metals: The pollution plaguing Latin America’s water. (2019, octubre 17). Americas Quarterly. https://www.americasquarterly.org/article/oil-sewage-heavy-metals-the- pollution-plaguing-latin-americas-water/ 4. TecnoConverting. (2019, febrero 14). The industrial sector, driving waste water treatment in Mexico. Smart Water Magazine. https://smartwatermagazine.com/news/tecnoconverting/industrial-sector- driving-waste-water-treatment-mexico 5. Yasmin, M., Dean, L. O., Lappi, S. E., & Ducoste, J. J. (2014). Factors that influence properties of FOG deposits and their formation in sewer collection systems. Water Research, 49, 92–102. https://doi.org/10.1016/j.watres.2013.11.012 Referencias citadas
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