Helicobacter pylori

1. Helicobacter pylori, inflammation
chronique et cancer gastrique
Hilde de Reuse
(hdereuse@pasteur.fr)
Unité de Pathogenèse de
Helicobacter

2. Jusqu’en 1983, on pensait que l’estomac était un
organe stérile et que les ulcères de l’estomac
étaient causés par le stress
pH median de
l’estomac = 2

3. 1886 :
identification de bactéries spiralées
dans des lavages gastriques
humains par Walery Jaworski
(Université de Cracovie)
1893 : description de bactéries
spiralées dans l’estomac d’un
chien par Giulio Bizzozero
(Université de Padoue)
Anciennes observations de bactéries dans l’estomac...

4. Ces observations ne montrent pas
que la bactérie cause une maladie

5. 1) Analyse de biopsies de l’estomac de 135 patients souffrant de gastrite
et de biopsies de patients sains
=> identification d’une bactérie spiralée uniquement chez les patients
souffrant de gastrite
3) Barry Marshall démontre l’un des postulats de Koch en avalant
une culture de cette bactérie qu’ils appellent Helicobacter pylori
En 1983 - le travail exemplaire de deux médecins
australiens, R. Warren et B. Marshall
2) Culture de cette bactérie pure in vitro

6. 2005: R. Warren et B. Marshall
Prix Nobel de Médecine
pour la démonstration du rôle de la bactérie Helicobacter pylori
dans le développement des maladies de l’estomac

7. La bactérie Helicobacter pylori
• Gram négatif
• Classe des epsilon protéobactéries
• Spiralée et fortement mobile
H. pylori colonise exclusivement
l’estomac des humains
et des primates non-humains
• Helicobacter pylori : chef de file d’un nouveau genre bactérien

8. Helicobacter pylori chef de file d’un nouveau genre bactérien
Esp
ces de Helicobacter ayant un tropisme pr
f
rentiel pour l'estomac
Esp
ces H™tes
"Candidatus Helicobacter bovis" Bovins
"Candidatus Helicobacter heilmannii" Flid
s sauvages, hommes
"Flexispira" taxon 7 Chiens
Helicobacter acinonychis Gu
pard s
Helicobacter baculiformis Chats
Helicobacter bizzozeronii Chiens, chats, hommes
Helicobacter cetorum Dauphins, blugas
Helicobacter cynogastricus Chiens
Helicobacter felis Chats, chiens, gu
p ards, hommes
Helicobacter mustelae Furets
Helicobacter pylori Hommes, primates non-hominiens
Helicobacter salomonis Chiens, hommes
Helicobacter suis Porcs, hommes, primates non-hominiens
"Helicobacter suncus" Musaraigne
"Helicobacter winghamensis" Hommes
Esp
ces de Helicobacter ayant un tropisme pr
f
rentiel
pour l'intestin et/ou le foie
Esp
ces H™tes
"Flexispira" taxon 10 Primates non-hominiens
Helicobacter aurati Hamsters
Helicobacter anseris Oies
Helicobacter bilis Souris, rats, hamsters, gerbilles, chiens,
chats, ovins, porcs, hommes
Helicobacter brantae Oies
Helicobacter canadensis Hommes, oies
Helicobacter canis Chiens, chats, hommes
Helicobacter cholecystus Hamsters
Helicobacter cinaedi Hommes, hamsters, chiens, chats,
renards, macaque rh
sus, rats
"Helicobacter colifelis" Chats
Helicobacter equorum Chevaux
Helicobacter fennelliae Hommes, primates non-hominiens (?),
chiens (?)
Helicobacter ganmani Souris
Helicobacter hepaticus Souris, hommes (?)
Helicobacter marmotae Marmotte, chats
Helicobacter mastomyrinus Souris, mastomys
Helicobacter mesocricetorum Hamsters
"Helicobacter muricola" Souris sauvages
Helicobacter muridarum Rats, sour is
Helicobacter pametensis Oiseaux, porcs, chats
Helicobacter pullorum Volailles, hommes
Helicobacter rodentium Souris
Helicobacter trogontum Rats, porcs, ovins
Helicobacter typhlonius Souris
"Helicobacter sp. Bird-B" Oiseaux
"Helicobacter sp. Bird-C" Oiseaux
"Helicobacter sp. cotton-top tamarins" Cotton-top tamarins

9. Infections par
Helicobacter pylori

10. - très forte prévalence, la moitié de la population humaine mondiale
- fortes disparités géographiques (niveau socio-économique)

11. Mode de transmission :
- inter-humaine
- acquisition par voie oro-orale
- acquisition au cours de la petite enfance
- transmission le plus souvent intrafamiliale
- infection persiste souvent toute la vie
Epidémiologie de l’infection par
Helicobacter pylori

12. Prévalence des infections à H. pylori
Dans les pays occidentaux => l’incidence diminue
- 66 % de la population de l’âge de 60 ans est infectée
- 22 % de la population de l’âge de 20 ans est infectée
Effet cohorte

13. Asymptomatique
(80%)
Ulcères gastriques
ou duodénaux (10%)
Gastrite atrophique
Adénocarcinome (1-3%)
Lymphome
du MALT
(0.3%)
Gastrite chronique
(100%)
Infection par H. pylori
Métaplasie intestinale
Dysplasie
Pathologies associées à l’infection par H. pylori
Dyspepsie
fonctionnelle
(5-10%)
<1a
20-30a
65-80a
30-50a

14. Caractéristiques génétiques
de l’hôte
Génotype de la bactérie
Facteurs de l’environnement
et mode de vie de l’hôte
Risque accru
d'atrophie gastrique
et d'adénocarcinome
Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires
-> TNF et IL1 β (puissant inhibiteur de la sécrétion
acide gastrique)
(îlot de pathogénicité Cag, VacA-s1m1)

15. • Trithérapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline,
clarithromycine, tétracycline, métronidazole)
+ inhibiteur de Pompe à Protons (IPP)
• Nouveaux traitements (90% éradication)
- séquentiel
- IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth
Traitements des infections
à Helicobacter pylori
• Apparition préoccupante de souches résistantes
Souches isolées de 530 biopsies (2004-2007, France)
26% clarithromycineR
61% métronidazoleR
0% amoxicillineR
(Raymond et al. Helicobacter 2010)

16. Helicobacter pylori
et cancer gastrique
1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme
oncogène de classe I
par l’agence internationale de recherche sur le cancer (IARC)

17. Principaux agents impliqués :
Bactérie : Helicobacter pylori 5.5%
Virus : Papilloma Virus humains 5.2%
Virus des Hépatites B & C 4.9%
Virus d’Epstein-Barr 1%
VIH & HHV8 0.9%
HTL Virus 0.03%
Parasites du foie : 0.02%
(Parkin, Int J Cancer 2006)
Cancers associés aux infections
cancers gastriques
Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 :
- 1.9 million de cas dans le monde
- 18% de l’ensemble des cancers

18. Le cancer gastrique en chiffre
• 600 000 nouveaux cas/an dans le monde
• 2ème cause de mortalité par cancer dans le monde
(2/3 des cas dans pays en voie de développement)
• 800 000 morts par an dans le monde
• En France : 6 000 nouveaux cas/an
• Survie à 5 ans : 10-15 %
• Cancers gastriques associés à H. pylori
90 % des lymphomes gastriques de type MALT
71 % des adénocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus)

19. Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001)
• Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités
aucun n’a développé de cancer
- Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais
* 4,7 % Dyspeptiques
3,5 % Ulcères gastriques
2,2 % Polypes gastriques
0 % Ulcères duodénaux
• Sur 1246 patients infectés par H. pylori *
36 patients ont développé un cancer (2,9%)

20. Comment l’infection par H. pylori conduit au cancer gastrique ?
Processus très long (>40 ans) multifactoriel - mécanismes encore mal compris.
• H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique au niveau des cellules épithéliales
de la muqueuse gastrique => conduit à des lésions de l'ADN (espèces réactives de l'oxygène
et de l'azote).
• H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de
l"editing" d'ADN => génère l'accumulation de mutations dans TP53.
(Matsumoto et al. Nature Med 2007)
• L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes
de réparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009)
• H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activités
augmentent le risque d'oncogenèse (VacA et CagA).

21. Activités de la cytotoxine VacA
s1 s2 i1 i2 m1 m2
p33 p55
Formes plus fréquemment associées
avec le cancer gastrique
(D'après Polk and Peek,
Nature Reviews Cancer, 2010)
Séquence signal
Domaine
autotransporteur
s i m
Libération cytochrome C
Vacuolisation
Affaiblissement des
jonctions intracellulaires
Induction de
l'apoptose
Integrin ß2
Inhibition de l'activation
et de la prolifération
IL-2
Altération de la
capacité à présenter
les antigènes
Activité immuno-suppressive :
évasion de la réponse
immunitaire adaptative
Macrophages Lymphocytes B Cellules T
Inhibition de la
fusion phagosome-lysosome

22. L'îlot de pathogénicité Cag
cagA
30 gènes
- Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gènes,
présent dans :
• 50 % des souches européennes
• >95% des souches asiatiques
- souches Cag+ = facteur de risque pour le cancer
gastrique :
cancer => 95% Cag+
gastrite non-atrophique => 40 % Cag+
- Contient 22 gènes requis pour la synthèse d'un
système de sécrétion de type IV (SST4)
40 kb
Cellule
épithéliale
H. pylori
Membrane interne
Membrane externe

23. H. pylori
Cellule
épithéliale CagA
SST4
CagA,
une molécule pro-oncogène
injectée par le SST4 Cag
récepteur
intégrines 5 ß1
- Remaniement du cytosquelette
(augmentation de la mobilité et élongation cellulaire)
- Prolifération cellulaire
CagA
P
SHP2
SRC ABL
CagA
P
CSK
fragments de PG
Viala et al.
Nature Immunol. 2004
Activation de NF-kB
=> Stimulation de la
transcription de la cytokine
pro-inflammatoire IL-8
Nod1
Perturbation
- des jonctions serrées et adhérentes
- de la polarité cellulaire
CagA
JAM
ZO-1
ß-catenin
Hyperprolifération
et différentiation
aberrante
(D'après Polk and Peek,
Nature Reviews Cancer, 2010)
Rôle du SST4 Cag dans la transformation des cellules épithéliales gastriques

24. Effet de l’éradication de H. pylori sur le
développement du cancer gastrique
Atrophie gastrique
Amélioration dans l'antre et le corps
Métaplasie intestinale
Aucune amélioration
Gastrite chronique
Atrophie gastrique
Métaplasie intestinale
Dysplasie
Adénocarcinome
• Traitement du MALT: 80 % de régression après éradication de H. pylori
• Effet bénéfique de l'éradication de H. pylori sur l'évolution des lésions pré-néoplasiques
(Méta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007)
Point de
“non-retour” ?

25. • Helicobacter pylori : une bactérie de découverte récente responsable de diverses
pathologies de l'estomac chez l'homme.
• H. pylori colonise de manière persistante la moitié de la population humaine mondiale
(800 000 morts/an).
• H. pylori = la seule bactérie reconnue comme oncogène de classe 1 (MALT et
adénocarcinome).
• Adénocarcinome apparaît après des décades d'infection par H. pylori
– mutagenèse de l'ADN des cellules hôtes (inflammation, AID).
– diminution de l'expression de facteurs de réparation de l'ADN.
– expression de facteurs de virulence (VacA et Cag) qui augmentent le risque d'oncogenèse.
• L'éradication de H. pylori fait régresser le MALT et elle est bénéfique pour l'évolution des
lésions pré-oncogènes.
Conclusions

26. H. pylori possède des propriétés uniques
qui lui permettrent de survivre
et de se multiplier à long terme dans
l’estomac, un organe pourtant hostile...

27. Barrière physique :
mucus très épais
Barrière biologique :
réponse immunitaire
Barrière chimique : acidité
pH médian : 2
pH 4.5-6
cellules
épithéliales
Adapté de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an
introduction" editeur Pearson
pH neutre

28. Barrière immunologique
Motifs Lewis : mimétisme moléculaire
Immuno-suppression

29. Barrière physique : mucus très épais
Forme spiralée pour pénétrer dans le mucus
Flagelles pour se déplacer dans le mucus

30. 2 NH3 + CO2
NH4
+
H+
H+
=
O
NH2-C-NH2 + H2O
H+
H+
H+
H+
Barrière chimique : pH très acide
Uréase

31. Urease : un facteur de virulence
majeur de H. pylori
- Enzyme essentielle pour la résistance à l'acidité,
indispensable à la colonisation de modèles animaux
- Urease : 10% protéines totales de H. pylori
- Uréase de H. pylori, la plus active de toutes les uréases
décrites (Km=0,2-0,5 mM)
- Au niveau des cellules épithéliales gastriques de l'hôte
- l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique
- la présence d'ammoniac accélère l'induction de l'apoptose induite
par la cytokine TNF

32. Ni2+
24 nickel ions par complexe actif
d'uréase [(UreA-UreB)3]4
Urease : une métalloenzyme à nickel

33. Ni2+
Uréase :
une arme à double tranchant
- à pH acide : activité indispensable à la survie de H. pylori
- à pH neutre : production d'ammoniac délétère car conduit
à un pH alcalin toxique pour H. pylori

34. pH Compte-viable des bactéries
PBS pH 7.0
37°C - 1 H
PBS pH 2
+ 10mM urée
PBS pH 7.0
+ 10mM urée
2x108 bact./ml
H. pylori
Tests de la réponse de H. pylori à l'acidité in vitro

35. 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1
pH = 7
pH = 7
pH = 2
1 H
108 CFU/ml
pH = 2
pH final
pH initial
Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase
Incubation sans urée
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1
pH = 6.5
pH = 7
pH = 9
1 H
108 CFU/ml
pH = 2
pH initial pH final
Incubation avec urée
Toxique

36. Plusieurs niveaux de contrôle de
l'activité uréase chez H. pylori
- Accessibilité de son substrat, l'urée
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif
Identification de mécanismes originaux
- Stockage du nickel

37. Sous-unités
catalytiques
Protéines accessoires
ureA ureB ureI ureE ureFureG ureH
Ni2+ UreHEFG
(UreA-UreB)6
P
Canal à urée
UreI
H+
Urée
Urée
Skouloubris et al. Infect & Immun 1998
Bury-Moné et al. Mol Microbiol 2001 et 2004
Construction d'un mutant de H. pylori DureI
-> activité uréase identique à celle de la souche sauvage (sur des lysats)

38. 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1
pH = 6.5
pH = 7
pH = 9
1 H
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1
pH = 2.5
pH = 9
108 CFU/ml
105 CFU/ml
1 H
pH = 2
Souche de H. pylori sauvage Mutant de H. pylori DureI
pH = 7
pH = 2
UreI est nécessaire pour la survie de H. pylori à pH acide en présence d'urée
pH final
pH initial pH final
pH initial
Incubation avec urée
Démonstration du transport de l'urée à pH acide par UreI dans un système
hétérologue (oocytes de Xénopes) Weeks et al. 2001

39. 0 1 2 3 4 semaines
Inoculation par voie orogastrique
de 109 bactéries
(souche SS1)
Compte-viable
Sacrifice
H. pylori sauvage
109
0 10 20
2 7 14 28
Charge
bactérienne
(CFU/g
estomac)
101
102
103
104
105
106
107
108
0
H. pylori DureI
(Skouloubris et al. I&I 1998)
jours
Contrôle négatif
La protéine UreI est essentielle pour la colonisation
d'un modèle animal par H. pylori

40. NH3 + CO2
Uréase
NH4
+
H+
Urée
H+
H+
H+
Urée
UreI = canal à urée dans la membrane interne
de la bactérie ouvert uniquement à pH acide
(cible thérapeutique - brevet)
H+
H+
H+
UreI
H+
H+
H+

41. Plusieurs niveaux de contrôle de
l'activité uréase chez H. pylori
- Accessibilité de son substrat, l'urée
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif
Identification de mécanismes originaux

42. Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se
procurer du nickel dans l’estomac de son hôte
Nickel
L'acquisition des métaux par les bactéries
pathogènes au sein de leur hôte
est un élément de virulence

43. Environnement gastrique :
- complexe et varié
- biodisponibilité des ions métalliques ?
Concentration du nickel dans le corps
humain est très faible : 2-11 nM
Acquisition du nickel par H. pylori
Ni2+
NixA
?
MI
ME
Comment le nickel est-il
transporté à travers la membrane
externe (ME) ?
Aucune source d'énergie
disponible au niveau de la ME

44. Modified from Braun & Braun
Substrate-binding site
Le complexe TonB/ExbB/ExbD fournit de l'énergie pour le
transport à travers la membrane externe (ME) en utilisant la
force proto-motrice de la membrane interne (MI)
Substrats du système TonB :
• Fer chélaté (sidérophores)
• Cobalamin, vitamine B12 (cofacteur cobalt)
Transporteur
dépendant de
TonB = TBDT
ME
MI

45. La machinerie ExbB/ExbD/TonB est impliquée
dans le transport du fer chez H. pylori
Kristine SCHAUER
Question: est-ce que TonB est
requis pour le transport
énergisé du nickel ?

46. Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de
"Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS)
Ni2+
pH 7
• A pH 7, peu de nickel accumulé indépendamment de TonB
µmol Ni2+ /g prot
• A pH 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dépend de TonB
pH 5
mutant ∆exbB-exbD-tonB
+ mutant complémenté

47. Modified from Braun & Braun
Identification du transporteur TonB-dépendant
 présente les caractéristiques d'un TBDT
 localisée dans la membrane externe
(Ernst et al. 2006 J. Bact)
 régulée par NikR en réponse au nickel
(Muller et al. 2011 NAR)
FrpB4
Mutant ∆frpB4, même phénotype que
le mutant ∆exbB-D-tonB

48. Conséquences du transport du nickel
TonB-dépendant sur l'activité uréase
pH 7 pH 5
A pH 7, accumulation du nickel
TonB-indépendante
=> activation de l'uréase
A pH 5, à des faibles doses de nickel
=> Machinerie ExbB/ExbD/TonB + FrpB4
nécessaires à l'activité uréase

49. H+
PMF
ExbB
ExbD
TonB
FrpB4
H+
ME
MI
• FrpB4 = Transporteur de
nickel dépendant de TonB
• Transport de nickel est activé
à pH acide
• Activation de l'uréase à pH
acide par l'apport de nickel
Schauer et al. Molec Microbiol (2007)
NixA
Nickel
Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008)
Uréase
Première démonstration d'un transport du nickel à travers la ME
par un mécanisme dépendant de la machinerie TonB

50. Plusieurs niveaux de contrôle de
l'activité uréase chez H. pylori
- Accessibilité de son substrat, l'urée
- Transport de son co-facteur, le nickel
- Incorporation du nickel dans son site actif
Identification de mécanismes originaux

51. • Purification de complexes multi-
protéiques à partir de l'organisme
d'origine
=> Meilleure spécificité des
complexes (moins de faux positifs)
• Purification de complexes protéiques par la technique TAP,
Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL)
Incorporation du nickel dans l'uréase
par des complexes protéiques
• Carte génomique d'interaction protéiques par paires (Y2H)
Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003)

53. Recherche de complexes protéiques
associés à l'uréase chez H. pylori par TAP

54. Identification de deux
populations de complexes
- un complexe enzymatique actif
associé à des enzymes du
métabolisme de NH3
- un complexe d'incorporation du
nickel partagé avec celui de
l'hydrogénase (distribution du nickel)
Urease
Hydrogenase
Complexes protéiques
pour l'incorporation du
nickel

55. Urease
Hydrogenase
Complexes protéiques
pour l'incorporation
du nickel
Urée
H+
UreI
H+
Canal à urée activé
à pH acide
Urée
NixA
Nouveaux mécanismes pour
l'acquisition du nickel,
activés à bas pH
FrpB4
TonB-ExBD
Ni2+
Ni2+

56. Helicobacter pylori
est une bactérie fascinante !
- il reste beaucoup d’aspects de sa virulence à comprendre
- elle constitue un bon système d’étude
* pour identifier de nouveaux mécanismes ou de nouvelles
fonctions dont certains peuvent être communs à d’autres
bactéries pathogènes
* pour comprendre les processus qui conduisent au cancer

57. http://www.helicobacter.fr./
Pour en savoir plus sur H. pylori

58. Eliette TOUATI
Valérie MICHEL
Hilde DE REUSE
Unité Pathogenèse de Helicobacter
Julien GALLAUD
Yulia REDKO
Sylvie AUBERT
Daniel VINELLA
Julien FERNANDES
Mécénat
ODYSSEY-Re
Janssen
Karine ANGER
ERL3526
Mireille FERRAND

59. Laboratoire de Chimie et Biologie des
Métaux (CEA/CNRS Grenoble)
Christelle BALHAWANE
Isabelle MICHAUD-SORET
Laboratoire de Cristallographie et
Cristallogenèse des Protéines
(CEA/CNRS Grenoble)
Christine CAVAZZA
Laboratoire CEA de Cadarache
DSV/IBEB/SBVME/LB3M
Pierre RICHAUD
Groupe de Cristallographie
Macromoléculaire (ESRF Grenoble), now at
IBCP Lyon
Cyril DIAN
Laurent TERRADOT
Génopole IP
(Proteopole)
Pascal LENORMAND
Jean-Claude ROUSSELLE
Abdelkader NAMANE
Burnham Institute, La Jolla USA
Dmitry RODIONOV

60. MERCI POUR
VOTRE
ATTENTION !
AVEZ-VOUS DES QUESTIONS ?