UNIVERSIDAD VERACRUZANA 
INMUNOLOGÍA BÁSICA 
CITOMETRÍA DE FLUJO 
Carlos Manuel Malpica Márquez 
Greysi Gutiérrez porras 
...
CITOMETRÍA DE FLUJO 
 Su fundamento se basa en hacer pasar una 
suspensión de partículas (generalmente 
células) alineada...
SISTEMA NECESARIO DEL CITÓMETRO 
 Fluidos. La muestra que será 
analizada 
 Óptica. Es una fuente de excitación y 
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SISTEMA HIDRÁULICO 
 Controles neumático y fluidos 
para establecer un flujo laminar 
que permita a la suspensión 
celula...
SISTEMA ÓPTICO 
 Láser. Argón con luz monocromática de 488nm , filtros 
, lentes y detectores. 
 SISTEMA ELECTROINFORMAT...
PARÁMETROS 
 Características 
morfológicas de la célula 
: tamaño y complejidad del 
citoplasma 
 Características antigé...
OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO 
 Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas. 
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COMO SE DETECTAN ESTAS 
CARACTERÍSTICAS
EL CITÓMETRO DE FLUJO DETECTA COMO LAS CÉLULAS INTERACTÚAN CON UN 
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a) Desvía l...
SEÑALES DE DISPERSION 
Forward Scatter (FS) 
Es la luz dispersada frontalmente en 
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FLUORESCENCIA 
 Un fluorocromo es una molécula química que absorbe la luz a una determinada 
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CÓMO SE OBTIENE LA LUZ FLUORESCENTE. 
 Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con 
fluorocromos. 
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REACTIVOS FLUORESCENTES 
 Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, 
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REALIZACIÓN DE 
CITOMETRIA DE 
FLUJO
SE HACE EN 3 ETAPAS INDEPENDIENTES : 
 Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, 
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PROCESAMIENTO: 
 La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es 
forzada a pasar a través de una aguja crean...
RESULTADOS 
Dot-plots Histogramas
APLICACIONES 
 Hematología: tipificacion y conteo de células, reticulocitos y análisis de 
medula ósea . 
 Farmacología:...
INMUNOTIPIFICACIÓN 
ES EL PROCESO PARA DETERMINAR MARCADORES EXPRESADOS EN LA SUPERFICIE CELULAR.
 Esta detección se hace empleando anticuerpos 
monoclonales antígeno-específicos marcados con un 
fluorocromo dirigidos a...
 Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya función 
es impedir que las célu...
ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECION 
 Se ha utilizado para cuantificar la secreción de citoquinas a partir de linfocitos T 
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DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA 
 Una suspensión de células es coloreada con un colorante fluorescente que se ...
 La medida del contenido de DNA también ha sido utilizada para determinar el 
grado de aploidía de células malignas y el ...
APOPTOSIS 
 La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. 
Dichas ...
FAGOCITOSIS 
 Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede analizar el proceso de fagocitosis de estas 
por...
VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO 
 Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 
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Citometria de flujo

  1. 1. UNIVERSIDAD VERACRUZANA INMUNOLOGÍA BÁSICA CITOMETRÍA DE FLUJO Carlos Manuel Malpica Márquez Greysi Gutiérrez porras Sara Hernández Xico
  2. 2. CITOMETRÍA DE FLUJO  Su fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.  La citometría de flujo es un proceso que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido.
  3. 3. SISTEMA NECESARIO DEL CITÓMETRO  Fluidos. La muestra que será analizada  Óptica. Es una fuente de excitación y un sistema de colección para generar y recoger las señales luminosas.  Electrónica. Para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisis computacional.
  4. 4. SISTEMA HIDRÁULICO  Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.
  5. 5. SISTEMA ÓPTICO  Láser. Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.  SISTEMA ELECTROINFORMATICO. Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.
  6. 6. PARÁMETROS  Características morfológicas de la célula : tamaño y complejidad del citoplasma  Características antigénicas de la célula : Inmunofenotipo.
  7. 7. OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO  Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.  Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflexión electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")  Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas  NOTA. DE. Refiere a una técnica para modificar la trayectoria de un flujo de partículas cargadas por el uso de un campo eléctrico aplicado transversal a la trayectoria de la técnica de partículas. Se llama electrostática debido a que la fuerza y la dirección del campo aplicado cambia lentamente con relación a el tiempo que toma para que las partículas a transitar por el campo, y por lo tanto se puede considerar no cambiar para cualquier partícula en particular.
  8. 8. COMO SE DETECTAN ESTAS CARACTERÍSTICAS
  9. 9. EL CITÓMETRO DE FLUJO DETECTA COMO LAS CÉLULAS INTERACTÚAN CON UN RAYO LÁSER EN TÉRMINOS DE CÓMO LA CÉLULA : a) Desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC) b) Emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3.) las propiedades de dispersión de la luz en una célula nos da información acerca del tamaño celular y granularidad.
  10. 10. SEÑALES DE DISPERSION Forward Scatter (FS) Es la luz dispersada frontalmente en ángulo cónico pequeño (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamaño de la partícula que produce la dispersión.  La luz es desviada a bajos ángulos entre 1 y 10 grados.  Generalmente proporcional al tamaño celular.  Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en dirección delantera. Side Scatter (SSC) Es la luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular.  Luz es desviada a altos ángulos.  Proporcional a la granularidad de la célula y su complejidad.  Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.
  11. 11. FLUORESCENCIA  Un fluorocromo es una molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (energia ) energía de excitación y emite a una longitud superior (menor energia).  Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser.  Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula.  La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.
  12. 12. CÓMO SE OBTIENE LA LUZ FLUORESCENTE.  Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos.  El fluorocromo absorbe energía del láser.  El fluorocromo libera energía absorbida por : a) Vibración y disipación del calor. b) Emisión de fotones a una mayor longitud de onda Llamada fluorescencia.
  13. 13. REACTIVOS FLUORESCENTES  Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.  Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .  Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos.  Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a través de algunos reactivos.
  14. 14. REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJO
  15. 15. SE HACE EN 3 ETAPAS INDEPENDIENTES :  Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.  Fase de citometría de flujo : involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.  Fase de análisis: análisis de los datos recolectados
  16. 16. PROCESAMIENTO:  La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila de líquido que contiene las células.  A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente.  Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador.  Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots".
  17. 17. RESULTADOS Dot-plots Histogramas
  18. 18. APLICACIONES  Hematología: tipificacion y conteo de células, reticulocitos y análisis de medula ósea .  Farmacología: estudios de cinética celular.  Inmunología: subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular.  Oncología: Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos.  Microbiología: diagnostico bacteriano y vírico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos.  Genética: Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.
  19. 19. INMUNOTIPIFICACIÓN ES EL PROCESO PARA DETERMINAR MARCADORES EXPRESADOS EN LA SUPERFICIE CELULAR.
  20. 20.  Esta detección se hace empleando anticuerpos monoclonales antígeno-específicos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar.  Para esto, es necesario aislar previamente las células a analizar ( por ejemplo linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las células son luego estimuladas a producir los marcadores poniéndolas en contacto con un antígeno capaz de estimular su síntesis.
  21. 21.  Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina A (BFA) cuya función es impedir que las células expulsen las citoquinas que están sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior. Después las células son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos específicos. Una vez realizado este último procedimiento, las células están listas para ser leídas en el clitómetro
  22. 22. ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECION  Se ha utilizado para cuantificar la secreción de citoquinas a partir de linfocitos T El procedimiento utilizado es :  Encapsulación de la célula en una microgota de agarosa con biotina  Incorporación de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos detectar  Unión no específica y retención del anticuerpo en la matriz de agarosa  Incorporación de un segundo anticuerpo que reconoce la unión antígeno- anticuerpo ya formada. Este segundo anticuerpo está marcado con un fluorocromo  Las microgotas se analizan en el citómetro, midiendo la fluorescencia emitida por el fluorocromo, que es proporcional a la unión antígeno-anticuerpo
  23. 23. DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA  Una suspensión de células es coloreada con un colorante fluorescente que se une estequiométricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es entonces proporcional a la cantidad de DNA. Las células coloreadas se introducen entonces en el citómetro y la luz fluorescente emitida es proporcionarle al contenido de DNA de cada célula.  Este análisis nos da información además sobre la distribución de las célula en las diferentes fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible diferenciar G2 y M ya que en las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se han desarrollado modelos matemáticos para establecer el porcentaje de células que se encuentran en cada fase. Esta información puede complementarse utilizando antígenos cuya expresión está restringida a un momento del ciclo celular en particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un incremento en la excreción del antígeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por otra parte el antígeno Ki-67 es una proteína nuclear que se incrementa linealmente a través de todo el ciclo celular alcanzando la concentración máxima en G2 y M. Al marcar estás proteínas con anticuerpos específicos unidos a un fluorocromo, podemos entonces establecer con mayor precisión la fase del ciclo celular en que se encuentra la célula.
  24. 24.  La medida del contenido de DNA también ha sido utilizada para determinar el grado de aploidía de células malignas y el porcentaje de estas que se encuentran en fase S. Algunos autores sugieren que esta información es útil para conocer el tamaño del tumor, el estado nodal y el estado de expresión de marcadores para ayudar a establecer el pronóstico del tumor
  25. 25. APOPTOSIS  La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometría de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos últimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular.
  26. 26. FAGOCITOSIS  Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede analizar el proceso de fagocitosis de estas por parte de macrófagos y neutrófilos
  27. 27. VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO  Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 100.000 células).  Múltiples marcajes de una sola célula.  Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg).  Alta sensibilidad y objetividad.  Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio).  Medidas cuantitativas : discriminación de las células según la cantidad de marcador.  Múltiples parámetros : define subpoblaciones complejas.  Miles de células por segundo
  28. 28. DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO  Poca información morfológica de la célula  No proporciona información de la localización celular en un tejido  Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora)  Necesita suspensión de células individuales .  Costos de la tecnología  Método destructivo.  Incapacidad de visualizar las células que se analizan.

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