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Dosier cm gq

C
CarlosML4

DOSSIER presentado por los estudiantes Genesis Quezada y Carlos Maestre de la facultad de medicina universidad latina sede CHIRIQUI .

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1
UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA
SALUD
LIC. MEDICINA Y CIRUGIA
Microbiología médica
Estudiantes:
Genesis Quezada
8-970-10003
Y
Carlos Maestre
4-810-1518
Dossier:
“Técnicas de laboratorio”
Prof. Ricardo Saldaña
Fecha de entrega:
29 de septiembre del 2021
2
“Un poco de ciencia aleja de Dios, pero mucha ciencia devuelve a él.“
-Louis Pasteur
3
Indice
Autopresentación……………………………………………………………..pág 4.
Objetivos……………………………………………………………………….pág 5.
Introducción……………………………………………………………………pág 6.
I. Recolección y procesamiento del espécimen…………………pág 7.
IA.Resumen……………………………………………………….pág 7.
IB.Análisis…………………………………………………………pág 10.
II. Exámen microscópico de materiales provenientes
de sitios infectados………………………………………………pág 11.
IIA.Resumen………………………………………………………pág 11.
IIB.Análisis…………………………………………………………pág 14.
III. Uso de morfología de las colonias para
identificación presuntiva de microorganismos…………………pág 15.
IIIA.Resumen………………………………………………………pág 15.
IIIB.Análisis…………………………………………………………pág 18.
IV. Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas……….pág 19.
IVA.Resumen………………………………………………………pág 19.
IVB.Análisis…………………………………………………………pág 22.
V. Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas……………..pág 23.
VA.Resumen………………………………………………………..pág 23.
VB.Análisis…………………………………………………………..pág 26.
VI. Mecanismos de acción antibacterial y
mecanismo de resistencia de las bacterias………………………pág 27.
VIA.Resumen……………………………………………………….pág 27.
VIB.Análisis…………………………………………………………pág 30.
VII. Aplicaciones del diagnóstico molecular…………………………pág 31.
VIIA.Resumen………………………………………………………pág 31.
VIIB.Análisis…………………………………………………………pág 34.
VIII. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos………………pág 35.
VIIIA.Resumen……………………………………………………pág 35.
VIIIB.Análisis……………………………………………………….pág 38.
Conclusión………………………………………………………………………pág 39.
Bibliografía………………………………………………………………………pág 40.
Anexo…………………………………………………………………………….pág 41.
4
Autopresentación
Mi nombre como es señalado en la presentación, es Genesis Quezada, tengo 20 años y
soy estudiante de medicina de 2do año, estudie en Changuinola American Academy y he
residido en Bocas del Toro por 10 años; para mi esta carrera es una puerta hacia la
posibilidad de ayudar a personas, no solo a los enfermos, sino para todos aquellos que lo
necesiten; principalmente las madres, futuras madres y los niños. Si se toman en cuenta
estos elementos de la sociedad y se protegen y educan, la vida de los niños así como el
futuro puede cambiar radicalmente.
Yo me llamo Carlos Maestre tengo 23 años, soy estudiante de medicina 4to semestre,
vivía en David san mateo, luego puerto armuelles y finalmente caldera gracias a los
esfuerzos de mi labor y ahorros, sobre todo a Dios por brindarme esta oportunidad y
bendición de llegar hasta aquí hoy dia, he perdido muchas personas cercanas a mí a lo
largo de mi vida y siempre culpe a todo y a todos menos a mí por no poder hacer nada,
veo a los médicos como héroes que dejan sus vidas en los hospitales para hacer felices y
salvar a los demás eso quiero de mí y hasta allí quiero llegar dentro de mi carrera.
5
Objetivos
 Reconocer y estudiar los diversos mecanismos de resistencia de
microorganismos.
 Ser capaz de aplicar la teoría en un campo de laboratorio práctico.
 Conocer los métodos más eficacez para el diagnóstico de patologías causadas
por microorganismos.
 Determinar el papel de las nuevas tecnologías en los procesos de diagnóstico de
microorganismos.
 Comparar conocimientos previos de genética con los aplicados para el
diagnóstico molecular o de ADN de los microorganismos.
6
Introducción
Cómo estudiantes de medicina, debemos reconocer los distintos métodos de diagnóstico
a los que podemos recurrir para el correcto manejo de un caso. Si bien no se relacionan
mucho con la práctica de laboratorio, como cualquier tema en la medicina es necesario
que se conozcan los principios básicos, de los mecanismos y práctica de laboratorio de
microbiología. Muchas de las enfermedades, que son transmitidas hospitalizaciones, son
causadas por la acción de bacterias o microorganismos, cuál es tienden a ser muy
cambiantes debido a la frecuentes mutaciones a las que son sometidos con el fin de
aumentar su patogenicidad y su resistencia a fármacos utilizados generalmente para su
eliminación del organismo del hospedador. Éstos factores deben ser estudiados y
comprendidos para evitar que en el futuro no se pueden encontrar soluciones
farmacológicas o del tratamiento contra estas enfermedades causadas por agentes
microbianos. Por ello en este dos cierre se incluirán diversos capítulos resumidos, con el
fin incluir o abarcar los temas y puntos más importantes de cada uno de los capítulos a
tratar.
I. Recolección y procesamiento del espécimen

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  • 1. 1 UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD LIC. MEDICINA Y CIRUGIA Microbiología médica Estudiantes: Genesis Quezada 8-970-10003 Y Carlos Maestre 4-810-1518 Dossier: “Técnicas de laboratorio” Prof. Ricardo Saldaña Fecha de entrega: 29 de septiembre del 2021
  • 2. 2 “Un poco de ciencia aleja de Dios, pero mucha ciencia devuelve a él.“ -Louis Pasteur
  • 3. 3 Indice Autopresentación……………………………………………………………..pág 4. Objetivos……………………………………………………………………….pág 5. Introducción……………………………………………………………………pág 6. I. Recolección y procesamiento del espécimen…………………pág 7. IA.Resumen……………………………………………………….pág 7. IB.Análisis…………………………………………………………pág 10. II. Exámen microscópico de materiales provenientes de sitios infectados………………………………………………pág 11. IIA.Resumen………………………………………………………pág 11. IIB.Análisis…………………………………………………………pág 14. III. Uso de morfología de las colonias para identificación presuntiva de microorganismos…………………pág 15. IIIA.Resumen………………………………………………………pág 15. IIIB.Análisis…………………………………………………………pág 18. IV. Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas……….pág 19. IVA.Resumen………………………………………………………pág 19. IVB.Análisis…………………………………………………………pág 22. V. Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas……………..pág 23. VA.Resumen………………………………………………………..pág 23. VB.Análisis…………………………………………………………..pág 26. VI. Mecanismos de acción antibacterial y mecanismo de resistencia de las bacterias………………………pág 27. VIA.Resumen……………………………………………………….pág 27. VIB.Análisis…………………………………………………………pág 30. VII. Aplicaciones del diagnóstico molecular…………………………pág 31. VIIA.Resumen………………………………………………………pág 31. VIIB.Análisis…………………………………………………………pág 34. VIII. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos………………pág 35. VIIIA.Resumen……………………………………………………pág 35. VIIIB.Análisis……………………………………………………….pág 38. Conclusión………………………………………………………………………pág 39. Bibliografía………………………………………………………………………pág 40. Anexo…………………………………………………………………………….pág 41.
  • 4. 4 Autopresentación Mi nombre como es señalado en la presentación, es Genesis Quezada, tengo 20 años y soy estudiante de medicina de 2do año, estudie en Changuinola American Academy y he residido en Bocas del Toro por 10 años; para mi esta carrera es una puerta hacia la posibilidad de ayudar a personas, no solo a los enfermos, sino para todos aquellos que lo necesiten; principalmente las madres, futuras madres y los niños. Si se toman en cuenta estos elementos de la sociedad y se protegen y educan, la vida de los niños así como el futuro puede cambiar radicalmente. Yo me llamo Carlos Maestre tengo 23 años, soy estudiante de medicina 4to semestre, vivía en David san mateo, luego puerto armuelles y finalmente caldera gracias a los esfuerzos de mi labor y ahorros, sobre todo a Dios por brindarme esta oportunidad y bendición de llegar hasta aquí hoy dia, he perdido muchas personas cercanas a mí a lo largo de mi vida y siempre culpe a todo y a todos menos a mí por no poder hacer nada, veo a los médicos como héroes que dejan sus vidas en los hospitales para hacer felices y salvar a los demás eso quiero de mí y hasta allí quiero llegar dentro de mi carrera.
  • 5. 5 Objetivos  Reconocer y estudiar los diversos mecanismos de resistencia de microorganismos.  Ser capaz de aplicar la teoría en un campo de laboratorio práctico.  Conocer los métodos más eficacez para el diagnóstico de patologías causadas por microorganismos.  Determinar el papel de las nuevas tecnologías en los procesos de diagnóstico de microorganismos.  Comparar conocimientos previos de genética con los aplicados para el diagnóstico molecular o de ADN de los microorganismos.
  • 6. 6 Introducción Cómo estudiantes de medicina, debemos reconocer los distintos métodos de diagnóstico a los que podemos recurrir para el correcto manejo de un caso. Si bien no se relacionan mucho con la práctica de laboratorio, como cualquier tema en la medicina es necesario que se conozcan los principios básicos, de los mecanismos y práctica de laboratorio de microbiología. Muchas de las enfermedades, que son transmitidas hospitalizaciones, son causadas por la acción de bacterias o microorganismos, cuál es tienden a ser muy cambiantes debido a la frecuentes mutaciones a las que son sometidos con el fin de aumentar su patogenicidad y su resistencia a fármacos utilizados generalmente para su eliminación del organismo del hospedador. Éstos factores deben ser estudiados y comprendidos para evitar que en el futuro no se pueden encontrar soluciones farmacológicas o del tratamiento contra estas enfermedades causadas por agentes microbianos. Por ello en este dos cierre se incluirán diversos capítulos resumidos, con el fin incluir o abarcar los temas y puntos más importantes de cada uno de los capítulos a tratar. I. Recolección y procesamiento del espécimen
  • 7. 7 IA. Resumen Aspectos fundamentales en la recolección:  Si es posible, recolectar el espécimen en la fase aguda de la infección y antes de administrar antibióticos.  Seleccionar el sitio anatómico correcto para la recolección del espécimen.  Recolectar el espécimen utilizando una técnica y los suministros apropiados, con contaminnación mínima por biota normal.  Recolectar la cantidad apropiada del espécimen.  Empacar el espécimen en un contenedor o medio de transporte diseñado para mantener la viabilidad de los organismos y evitar peligros de unna fuga.  Marcar con presición el espécimen, indicando el sitio anatómico específico y la información del paciente (nombre del paciente, número de identificación, fecha y hora de la recolección de la muestra).  Transportar el espécimen con rapidez al laboratorio o hacer preparativos para almacenar el espécimen en un ambiente que no degrade los organismos sospechosos.  Notificar por adelantado al laboratorio si se sospechan patógenos inusuales o agentes de bioterrorismo. Algunas muestras deben ser tomadas por el mismo paciente, como: las heces, orina y esputo (esputo espectorado). La información del etiquetado y formalario , ya que para realizar un análisis de calidad el laboratorio necesita información específica concerniente al paciente y la muestra. La falta dee información puede formar eslabón debíl. El personal de salud debe adherirse al sistema de seguridad necesario para analisar una muestra. Cada espécimen debe tener un almacenamiento específico dependiendo del tipo de muestra y agente sospechoso. Dos tipos de muestras con las que puede utilizarse preservativos son la orina y heces, se ha utilizado ácido bórico para mantener colonias urinarias. En el caso de las heces estas, se pueden refrigerar para preservarlas pero si este tiempo sobrepasa las 2 horas se debe añadir medio de transporte Cary-Blair. Los anticoagulantes se usan para prevenir la coagulación de los especímenes, incluso la sangre, la médula ósea y el líquido sinovial. Es difícil aislar organimos en un material coagulado. Es importante la concentración y el tipo de anticoagulante, el polianetol sulfonato sódico es el mayormente utilizado. Los medios de sostén o transporte son otro medio de preservación que ayuda a que los microorganismos no se reproduzcan o crezcan y se arruine la muestra. Es común utilizar medios de transporte Stuart o Amie. Los especímenes de N.gonorrhoeae pueden colocarse de anera directa en sistema JEMBEC. Los especímenes recolectados en la cabecera del paciente suelen ser más suceptibles a contaminaciones. Recepción y procesamiento del espécimen Los especímenes requieren de un procesamiento expedito luego de su llegada al laboratorio, aveces esto puede ser imposible. Para ello estas se dividen en niveles: nivel 1, deben procesarce inmediatamente son críticos e invasivos (muestra de líquido amniótico, sangre, LCR, válvulas cardíacas y líquido pericárdico); nivel 2, son muestras
  • 8. 8 no preservadas que deben ser procesadas rápidamente para evitar la perdida de la muestra; nivel 3, se basa en especímenes que requieren ser cuantificados y porello no se puede retrasar el procesamiento, ya que esto significaría un aumento o disminución del número de especímenes en la muestra; y el nivel 4 son las que se pueden retrasar, ya que no son críticas e invasivas, y la parte más importante esque ya vienen procesadas. Hay casos en que los especímenes pueden ser inadecuados, como en los siguientes casos:  La información del formulario no coincide con la de la muestra.  No hay identificación del paciente en el envase de la muestra.  El espécimen no se transporta en un medio adecuado presenta fugas.  La cantidad del espécimen en inadecuada para desarrollar todas las muestras requeridas.  El tiempo de transporte del espécimen ha sido mayor a 2 horas y no ha sido preservado.  El espécimen se recibe en un fijador como la formalina.  Se solicita un cultivo anaeróbico en un espécimen en el cual los anaerobios son nativos.  El procesado dee microbiología de una muestra particular produce datos cuestionables.  El espécimen esta seco  Se envió más de una muestra de la misma fuente y del mismo paciente en el mismo día.  Se envió un hisopo con múltiples peticiones para diversos organismos.  La colaración de Gram del esputo expectorado revela al menos de 25 leucocitos y más de 10 células epiteliales por campo de bajo aumento, y flora microbiana mixta. El procesamieento de las muestras inicia con la observación macroscópica, ya que esta proporciona informacílon muy útil, principalmente características físicas, las anotaciones que se deben realizar deben incluir: claridad del líquido, presencia de sangre o moco, consistencia de las heces, hisopado o aspirado, volumen y el color. Esta etapa ayuda a determinar si es necesario realizar un procesamiento especial. El exámen de microscopia directa es de gran utilidad, ya que es rápida. Puede determinar la calidad del espécimen. En algunos especímenes puede no ser la mejor opciónn o no proporcionar información adecuada. La coloración Gram es la más utilizada. Existen diversos tipos de cultivo, que pueden dividirse de acuerdo a su capacidad de soportar el crecimiento bacteriano: medios no selectivos (soportan la mayoría de bacterias no exigentes), medios selectivos (ayudan al crecimiento de ciertas bacterias e inhiben el de otras), medios enriquecidos (contienen estimuladores de crecimiento), caldo enriquecido (estimula crecimiento de un número pequeño de bacterias), medios tipo caldo (son suplementos). La elección del tipo de medio depende de la especie y tipo de muestra. Los medios de sembrado primario incluyen: un medio agar no selectivo, medio enriquecido para organismos exigentes o de líquidos corporales normalmente estériles, medios selectivos
  • 9. 9 y diferenciales para organismos Gram negativos entéricos, medios selectivos para Gram positivos y Gram negativos mixtos, medio selectivo adicional o caldo de enriquecimiento para patógenos específicos, medio tipo caldo para especímenes de líquidos corporales. Los especímenes como los fluidos corporales estériles, pus, orina y esputo se pueden inocular directamente en medios seleccionados. Los especímenes en hisotopos también se pueden inocular directamente. Los tejidos se deben homogenizar. Los especímenes se pueden inocular en placas de agar con un trazo de aislamiento de propósito general para producir un estimado semicuantitativo del crecimiento. La estría de aislamiento de propósito general e útil para la mayoría de los especímenes; las muestras de orina se inoculan al utilizar un aislamiento cuantitativo. Después se deben establecer las condiciones de incubación, ya sea aerobios o anaerobios, incluso aquellas bacterias que son capnófilas y requieren una cconcentración aumentada de CO2. A medida que se realizan estos procedimientos se debe considerar las preguntas ¿Cuál es la fuente del espécimen?¿Esta fuente tiene biota normal o es unna fuente estéril? ¿Qué bacterias se encuentran y como lucen estas colonias? ¿Cuáles son los patógenos más probables en esta muestra? ¿Cuál es la morfología de las colonias de los patógenos? ¿Cuál medio esta demostrando crecimiento y cuál es el propósito del medio? Para ello se requiere entrenamiento profesional. Hay especímenes que son rutinarios y por ello poseen procedimientos de evaluación estandar muy establecidos. En las situaciones en las que se observen especímenes no rutinarios, el laboratorio debe utilizar un medio bien pensado quee garantice que se cultiven de manera adecuada. Las muestras no rutinarias pueden incluir injertos venosos, catéteres de múltiples luces, válvulas cardiacas, soluciones de impregnación de implantes, perfundidos, muestras de agua y equipo. Ya existen procedimientos de aalguunas de ellas, como las muestras para esterilidad del agua, soluciones de impregnación de implantes. La fase postanalítica se basa en la comunicación de los resultados. Se debe hacer lo posible para proporcionar información precisa y oportuna. Se deben comunicar los resultados primarios. Informe debe estar libre de jerga y abreviaturas microbiologícas. En casos críticos se deben tener listos lo antes posible y reportarse de manera inmediata al médico.
  • 10. 10 IB. Análisis En este capítulo se nos resume acerca de los diversos métodos que se pueden utilizar para la toma de muestras, su inoculación, incubación, análisis y comunicación de los resultados. Es importante que el estudiante de medicina conozca estos conceptos, usos y medios de empleo; ya que ello ayudaría a la mejor selección de prueba, además de que el médico es generalmente el que toma las muestras de tejido, lesión, o cualquier líquido corporal (sangre, LCR). Una de las principales razones por las cuales se rechazan muestras, es una muestra inadecuada; debido a que se seleccionó un lugar anatómico inadecuado, poca cantidad de muestra, muestra contaminada, o una muestra no adecuada para el tipo de especie de la cual se sospecha. Por ello, es clave que el estudiante de medicina se entrene para la toma de muestras correctas, claves para un correcto diagnóstico. Estos análisis además poseen una rutina, gracias a que existen patógenos que son muy frecuentes; esto es positivo ya que puede agilizar los procesos de cultivo, observación, obtención de resultados; gracias a ello se pueden detectar mucho más rápido la causa de la enfermedad por bacterias comunes en casos de meningitis, diarrea, malestar general, indigestión, ETS, entre otros. Patógenos como S. Aureus, S.pneumoniae, B.antrax, y otros y poseen un planeamiento o rutina en su cultivo y análisis. La comunicación de los resultados la vemos como la parte más fundamental y que debe ser sencilla y sin jergas microbiologas, esto debido a que los médicos NO son microbilogos, los médicos son enseñados para realizar posibles hipótesis de diagnóstico que comprobaran con la solicitud de diversas pruebas y estos resultados seran evaluados para determinar un tratamiento adecuado a cada paciente. Esto es de clara importtancia, un lenguaje no conocido puede dificultar este proceso o retrasarlo, y ello puede poner en riesgo la vida del paciente.
  • 11. 11 II. Examen microscopico de materiales provinientes de sitios infectados. IIA. Resumen En 1884 Christian Gram desarrollo la coloración de Gram. La visualización directa de los patógenos se convierte en evidencia priimaria, o directa, que confirma o refuta la impresión clínica inicial del médico. Los resultados de cultivo casi siempre se resiven demasiado tarde como paea cambiar la terapia presuntiva. En la mayoría de los casos estos sirven como confirmación de exactitud de las elecciones terapéuticas ya tomadas e implementas. En la preparación de muestras, como en los frotis, los especímenes deben examinarse en forma macroscópica para determinar un mejor abordaje, este debe producir monocapas y no deben ser opacas.  Frotis de hisopos: no deben prepararse frotis a partir de un hisopo luegoo de que este se haya utilizado para inocular medios de cultivo. Estos frotis se preparan al rodar el mismo hacia adelante y hacia atrás sobre áreas contiguas de la lámina de vidria para depositar una capa delgada de material.  Frotis de líquidos espesos o semisólidos: hisotopo se puede usar en muestras de heces, se sumerge en el espécimen por varios segundos y se utiliza para preparar una diseminación delgada del material sobre la lámina de vidrio para su coloración y visualización.  Frotis de materiales espesos, granulares o mucoides: el material opaco debe diseminnarse en forma delgada, de forma tal que se deposite una moonocapa de material en algunas áreas. Lo mejor esque hayan capas delgadas y gruesas. Si hay granulos estos debeen triturarse con la ayuda de otra lámina.  Frotis de líquidos claros: orina, LCR y trasudados; deben colocarse een la lámina en forma dee gota y no ser diseminados. Se deb marcar el área de la gota. La centrifugación es la técnica preferida para este tipo de espécimen. Si el líquido es turbio u opaco se debee diseminar en la placa o utilizar el método anterior.  Preparaciones de citocentrífuga: método excelente para líquidos no viscosos. Este deposita loss elementos celulares y los microorganismo de la muestra en la superficie. Lo cual facilita su observación. La tinción da un color artificial a los elementos del frotis. Existen muchos tipos de coloración como las simplles, diferencialess y las mediadas por sonda. Algunas coloraciones se utilizan como montajes húmedos en especímenes líquidos, como la tinta china para el LCR. El examen de especímenes debe comenzar conn una evaluación macroscópica y luego ir avanzando en el nivel de aumento necesario para la identidicación de un patógeno o incluso su ausencia. El caballo de battalla de un laoratorio es el microscopio de campo claro.
  • 12. 12 La coloración de Gram o la coloración ácido-alcohol resistente es el método más rápido y menos costoso para lograr un diagnóstico presuntivo en contextos clínicos comunes. Hay más de 10 a la 5 unidades formadoas. De colonias de oorrganismos infecciosos porr milimetro en la infecciones clínicamente visibles. Es impoortantte que se distingan las infecciones monomicrobianas de las polimicrobianas. Las presentaciones polimicrobianas requieren de un mayor análisis, y estas generalmente surgen de la microbiota desplazada o alterada, casi siempre se presenta en la región cutánea, la orofarínge, gastrointestinal y la vaginal. Siempre se debe revisar la lámina a simple vista y reealizar anotaciones de su consistencia y distribución del material. Los especímenes pueeden ser homogéneos o heteregéneos y pueden contener patógenos distribuidos de manera regular a lo largo del espécimen o limitados a un campo visuall. Debeb seguirse una línea de veriificación mental de iinquietuudes hasta que se desarrolle el hábito sistemático de búusqueda en la lámina. Los restos amorfos usualmente constituyen el remanente de tejido mezclado con los productos de degradación o los líquidos de la inflamación aguda, estos siempre deben someterse a una búsqueda de organismos. Se deben tomar en cuenta estructuras inesperadas como la espiral de Curschmann, un tapón de moco encontrado con facilidad en los pacientes con asma y se reconoce con mucha más facilidad en observaciones de bajo aumento. Todos los gránulos o granos, y el transfondo debn examinarse de manera cuidadosa. Debn mantenerse criterios estrictos ooara los morfotipos microbianos. Se debn evitar istracciones por una tinción Gram positiva muy precipitada o por la presencia de gránulos, queratohialinos u otros artefactos. Deben evaluarse los microorganismos para evaluar su morfología y reacción a Gramm. Bacterias con una pared celular dañada, muertas o tratadas con antimicrobianos pueden presentar una coloración Gram negativa falsa. El examen microscópico tambien puede revalar la utilidad de una muestra para el diagnóstico el manejo del cultivo. El procesamiento e interpretación del cultivoo de estos especímenes no representativos puede llevar a un retrasos en el tratamiento debido aun falso negativo o a una terapia antimicrobiana inapropiada, secundaria a un falso positivo proviniente del crecimiento de biota normal o biota alterada por antimicrobianos. Se han derivado varios sistemas de gradación o clasificación para ayudar al científico a llegar a decisiones relacionadas con el cultivo del espécimen. El puntaje Q de Barlett de las muestras de esputo y el método de Murray Washington para la evaluación de contaminación de una muestra documenta la asociación de 10-20 células epiteliales escamosas por campo de aumento de 100X con especímenes inacptables y 10-25 PMN por campo a 100X con especímenes significativos. Sistema de puntuación de Nugent para los frotis vaginales coloreados con Gram se utiliza para el diagnóstico de la vaginois bacteriana. Los materiales contaminantes se reconocen como materiales no provenientes del sitio de recolección, no aportados por la respuesta inflamatoria de los tejidos o sin probabilidad de contener el organismo infectante. Los materiales contaminantes más molestos son
  • 13. 13 aquellos que contienen microorganismos que crecerán en el cultivo y confundirán potencialmente la interpretación del mismo. Algunos criterios son que debe haber menos de 25 células PMN por campo de bajo aumento y más de 10 células epiteliales o bacterias mixtas por LPF. Los materiales contaminantes se cuantifican coomo 1+ (leves), 2+ (moderados), 3+ (moderadamente abundantes) o 4+ (abundantes). En caso de contaminación debe pedirse un cultivo nuevo utilizando una técnica de recolección cuidadosa. En cuanto a la evaluación de la suceptibilidad a antimicrobianos excepto para los patógenos primarios, no es apropiado realizar estas evaluaciones. Los materiales locales, son aquellos que se observan menos de 25 leucocitos PMN por LPF y menos de 10 células epiteliales contaminantes por LPF, junto con elementos celulares y líquidos locales del área muestreada. La biota microbiana local se cuuanntifica como 1+ a 4+. Pueden usarse la designación de microbiota usual o una descripción presuntiva breve de crecimiento tipo colonia. Ninguna prueba de susceptibilidad a antimicrobianos es apropiada. La purulencia; menos de 25 leucocitos PMN por LPF y ninguna o pocas células epiteliales menor a 10 con bacterias mixtas por LPF, puede haber moco o material proteináceo espeso. Solo se cuantifican los organismos asociados íntimamente con WBC, moco exudado proteináceo. El crecimiento de colonias debe correlacionarse con el frotis coloreado con Gram. Los materiales mixtos consisten en exudado purulento, materiales contaminantes y materiales locales en un solo frotis. Menos de 25 leucocitos PMN por LPF y menos de 10 células epiteliales o bacterias contaminantes por LPF, pueden haber secreciones locales. Solo se cuantifican los organismos asociados de manera íntima con el exudado purulento, las cantidades de otros materiales también se cuantifican. Debe solicitarse uun cultivo nuevo si se exhibe purulencia y no pueden interpretarse los resultados cultivos. Deben establecerse pautas para purulencia en la evaluación de los organismos que parezcan ser significativos. Los reportes de los resultados del examen directo del espécimen deben ponerse a disposición tan pronto sean culminados. Estos reportes deben ser simples e incluir todos los elementos informativos que necesite el médico para entender el reporte.
  • 14. 14 IIB. Análisis Las indicaciones sobre la realización del frotis son muy específicas y estas dependen del tipo de muestra que se haya enviado al laboratorio. Aunque el médico no participe mucho en esta parte del procesamiento de las muestras, pero por un lado es necesario que conozca los principales principios de las pruebas con el fin de que se identifiquen los posibles obstáculos para el diagnóstico definitivo. Aparte de ello, vemos que cada tipo de muestra posee un método de realizamiento específico para evitar errores al momento de observar los materiales que esta muestra contenga, lo que determina la observación de una cantidad adecuada de microorganismos y también de materia contaminante. Debido a la gran variabilidad de muestras que pueden ser sólidas, semisólidas o líquidas; aunque al igual el médico no posee mucha interferencia en esta parte del diagnóstico, si puede ayudarlo en caso de que las pruebas puedan ser erróneas a dar una pista de las razones por la cual los resultados no ffueran correctos o verídicos del todo. Se nos presentan muchos indicadores de niveles de contaminación en las muestras, muchas pueden tener diversos materiales que pueden llegar a confundir al personal de laoratorio; para evitar estos casos es necesario que se conozcan los elementos que pueden ser considerados contaminantes y cuales son diagnósticos, esto se logra mediante el estudio de las morfologías de los patógenos que se quieran encontrar, al igual que depende de factores como una buena elaboración del frotis y la experencia laboral.
  • 15. 15 III. Uso de morfología de las colonias para la identificación presuntiva de microorganismos. IIIA. Resumen La importancia de la capacidad para rreconocer y describir la morfología de las colonias de los aislados recuperados en medios de cultivo, así como la interpretación de los frotis de especímenes clínicos teñidos con Gram, nunca se enfatiza lo suficiente.la descripción de las carácterísticas fisicas del crecimiento de los microorganismos en los medios de laboratorio facilita los procesos de identificación inicial. La capacidad del microbiólogo para proporcionar una identificación presuntiva; extiende la utilidad del diagnóstico mucho más allá de la identificación, se puede aportar una identificación presuntivva para el médico reduciendo el tiempo que conlleva preparar la muestra y esperar los resultados, aumenta la calidad de la atención al paciente mediante el reporte rápido de los resultados y el incremento de la relación costo-efectividad de las pruebas de laborotario y jugar un papel significativo en el control de calidad especialmente de los procedimientos automatizados y otros sistemas de identificación diponibles a nivel comercial. La siembra primaria se refiere a la inoculación del espécimen clínico en medios de laboratorio. Generalmente, se observan la morfología de las colonias de organismos aislados en cultivos primarios luego de 18-24 horas de incubación. Este tiempo. Puede diferir de acuerdo a las especies y el tipo de medio que se utilice. Se debe estar conciente de factores que puedan alterar la morfología de los organismos; estos comprenden el medio de cultivo naturaleza inhibitoria de los organismos, agentes antimicrobianos que pueden alterar el medio. La interpretación de los cultivos primarios, referida como lectura de placa, es un examen comparativo de las morfologías de las colonias de microorganismos que crecen en diversos medios de cultivo. Cada tipo de placa de agar se examina en reelación a otra. Se lleva a cabo un examen comparativo del crecimiento de las colonias de un espécimen en un grupo de medios de cultivo. Algunos medio de cultivo pueden ser selectivos o diferenciales; en los medios selectivos se añaden agentes para inhibir el crecimiento de algunas bacterias, lo que permite una mejor recuperación de las bacterias patógenas que son resistentes a agentes inhibitorios; lo medios diferenciales permiten diferenciar entre cepas bacterianas con base en la morfología de las colonias, se basan en la capacidad de algunas bacterias para utiliza sustrato que produce con frecuencia un cambio en el pH que se detecta por el cambio de color. Estos medios ayudan a realizar una distinción inicial entre los aislados Gram positivos y los Gram negativos. Medios como el agar SBA y el agar CHOC apoyan el crecimiento de varios organismos exigentes, así como de organismos no tan exigentes.
  • 16. 16 Por lo general, los organismo que crecen en agar SBA lo hacen en agar CHOC, aunque no todos los organismos que crecen en agar CHOC crecen en agar SBA. El crecimiento en agar SBA y CHOC, así como en ausencia en agar MAC, es indicativo de un aislado Gram positivoo o de bacilos/cocos Gram negativos exigentes. Los bacilos Gram negativos se describen mejor en agar MAC debido a que estos organismos producen colonis de aspecto similar en el agar SBA y en el agar CHOC. En estos últimos dos agares, los bacilos Gram negativos producen colonias grandes de color gris y de aspecto algunas veces mucoides; cuando son hemolíticos se aprecia la presencia de hemolísis en SBA. El agar MAC es muy util para identificar bacterias fermentadoras de lactosa de aquellas que no lo son, las fermentadoras provocan un cambio en el pH de su medio cambiando el colorr a tonos rosados. Las colonias no fermentadoras por otro lado, no cambian el color de su medio y conservan un aspecto claro e incoloro. Esta diferenciación es particularmente importante en el tamizaje de patógenos entéricos en los cultivos de heces. En el SA, la hemolísis observada en el medio que rodea o se encuentra inmeediatamente por debajo de una colonia constituye una reacción ocasionada por la actividad enzimática o de toxinas de las bacterias. La hemólisis en el SBA es útil para la ideentificación presuntiva. Es importante determinar si la decoloración del medio es consecuencia de una verdadera hemolísis causada por el organismo en crecimiento en la placa. Muchas veces se debe remover la colonia con el fin de observar el patrónn hemolítico o por transiluminación.  La alfa hemolísis representa el lisado parcial de los eritrocitos en una placa de SBA alrededor y por debajo de la colonia, lo que provee de una decoloración verde del medio.  La ß-hemolísis representa el aclarado completo de los eritrocitos en el SBA alrededor o por debajo de las colonias debido a la lisis completa de los RBC. Se dividen en grupos: o Grupo A se presenta una decoloración de zona ancha y profunda. o Grupo B producen uuna zona difusa y estrecha cerca de la colonia. Estas características son indicios útiles para la identificación de ciertas especies bacterianas. El agar CHOC no muestra hemolísis debido a que los RBC presentes en el medio han sido lisados durante la preparación del medio. Los organismos que son alfa hemolíticos o beta hemolíticos en SBA casi siempre exhiben una coloración verde alrededor de la colonia en agar CHOC. Pero esta coloración no debe ser considerada como una característica hemolítica. Las colonias se describen como grandes, medianas, pequeñas o puntiformes. Rara vez se mide la colonia. El tamaño casi siempre es una comparación visual entre géneros y especies. Debe observarse el borde de las colonias y debe describirse la forma o margen como:
  • 17. 17  Liso  Filamentoso  Rugoso/rizoide  Irregular Ciertos organismos pueden formar un ejambre que es un manto borroso de crecimiento, situado en la superficie, que se extiende mucho más allá de las líneas de siembra. Los difteroides producen colonias que tienen una apariencia reseca. Ciertas levaduras producen colonias que pueden ser cremosas, blancas con superficie mate; los estafilococos producen colonias húmedas, cremosas, de color blanco a amarillento. La elevación debe determinarse al inclinar la placa de cultivo y observar la parte lateral de la colonia; puede ser convexa, plana, umbilicada o umbonada. Los estreptococos beta hemolíticos generalmente producen colonias planas. La densidad de de la colonia puede ser transparente, traslúcida u opaca. Para apreciarla es útil recurrir a la transiluminación. En contraste con la pigmentación el color es un término usado para describir un género en particular en forma general. Las colonias pueden ser blancas, grises, amarillas o colorantes. La consistencia se determina al tocar la colonia con un asa estéril. La consistencia de una colonia puede ser quebradiza, cremosa, seca/cerosa, incluso pegajosa. La producción de pigmento es una característica inherente de un organismo específico, confinada por lo general a la colonia, aunque algunos pigmentos se pueden difundir por el medio. Casi siempre la producción de pigmento se aumenta al hacer crecer el cultivo a temperatura ambiente. Los pigmentos pueden ser azules, púrpuras, verdes metálicos o incluso negro. Debe determinarse el olor cuando se retira la tapa del cultivo y el olor se disipa en el ambiente circulante. Nunca se debe inhalar la placa directamente. Los olores que se pueden llegar a percibir en algunas colonias de especies específicas son: olor similar a frutas (uvas), calcetines viejos, pútrido, olor a nido de ratón. Las colonias pueden adoptar múltiples de estas características mencionadas. También se pueden detectar indicios importantes para la identificación de un organismo mediante la observación del crecimiento del mismo en medios líquidos como el tioglicolato. Las serpentinas o enredaderas y bolas algodonosas se asocian con ciertas especies de estreptococos. La turbidez, que se refiere a la nubosidad del medio debida al crecimiento, es producida por muchas Enterobacterias.
  • 18. 18 IIIB. Análisis Las características morfológicas de muchas bacterias al producir colonias en cultivos de dictados al diagnóstico puede ayudar en la identificación de los géneros y especies de cada familia bacteriana. Es importante, que estas características sean tomadas como una fuente rápida mediante la visualización de la colonia para qué terminal a primera vista, cuál es la identificación o patógeno causante de la sintomatología. Aunque el médico tampoco participa en esta parte del diagnóstico, el microbiólogo puedo utilizar éstas características para agilizar el proceso, y al agilizarlo podemos informar a los médicos de forma más rápida acerca de la identidad del patógeno. Al agilizar, el diagnóstico también, se agiliza el proceso o asignación de un tratamiento. Podemos ver que cada una de las características morfológicas observables a simple vista, son distintas para cada una de las especies e incluso pueden llegar a mostrar varias de estas características en una sola muestra; lo cual nos ayuda a confirmar de forma rápida no entra sospechas acerca de lo de entidad del patógeno. Características con el color, el olor, la forma, elevación, densidad; son características propias de las bacterias y aunque muchas veces como estudiantes solamente se ve el atractivo visual que esto provoca, no señalan no sólo la identidad del patógeno, sino también sus características patológicas picados en este tipo de lesiones en los cultivos y por lo tanto también en tejidos; por lo cual pueden provocar cambios tisulares y grandes escalas en aquellos afectados por la acción o presencia de estos organismos. Así que no sólo se trata de una característica física percibíble por los sentidos, sino qué forma una señal o signo que nos puede indicar el modo de actuar o de acción del microorganismo al momento de infectar un tejido o célula; Y si nos dan Esta información, podemos imaginar o armar un rompecabezas de la posible estructura bacteriana que presenta el patógeno, Dándonos la oportunidad de analizar y crear un esquema de esta posible estructura con el fin de encontrar las diversas debilidades de este estructura y por lo tanto encontrar, los posibles tratamientos o mecanismos para la eliminación del patógeno en el organismo.
  • 19. 19 IV. Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas. IVA. Resumen Las pruebas bioquímicas se basan en el fenotipo de los microorganismos y detectan características observables y cuantificables. Se realizaba al principio en tubos de ensayo, aunque estos medios eran complejos y generalmente utilizaban mucho tiempo para la preparación y final obtención de resultados. Por ello, se han desarrollado métodos automatizados que permitan un proceso más eficaz y rápido. Luego de la inoculación un sistema computarizado, realiza un análisis en su base de datos e identifica al patógeno. Los sistemas automatizados pueden proporcionar identificación y patrones de susceptibilidad a antimicrobianos preliminares en pocas horas. La serotipificación, se utiliza en ocasiones con las pruebas bioquímicas para identificar diferentes cepas de bacterias dentro de una especie. Esta usa anticuerpos para detectar antígenos específicos localizados en la superficie bacteriana. Los análisis de biología molecular se basan en el genotipo del organismo y se cree que son más precisos que los exámenes de fenotipo. Los ensayos de ácido nucleico, basados en la secuencia de ácidos nucleicos, son sumamente sensibles, específicos y rápidos, proporcionando resultados en pocas horas después del inicio de la prueba genotipica. Entre las bacterias hay una gran diversidad en la capacidad de usar el carbohidrato, sin embargo, la prueba de determinación de carbohidratos más importante es la determinación del uso de lactosa. Se necesitan dos moléculas esenciales para que una bacteria capte la lactosa: lactosa permeasa que sirve como enzima de transporte que facilita el ingreso de la la molécula de lactosa a través de la membrana de la bacteria; la otra molécula, es la beta galactosidasa la enzima hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa, luego la primera queda disponible para el metabolismo en su mayor parte a través de la vía de EMP, también llamada como el proceso glicólisis. Algunas bacterias solo son capaces de utilizar los carbohidratos en su forma más simple que es la glucosa, por lo que no son capaces de atacar el disacárido lactosa. De forma muy similar las especies bacterianas que no pueden fermentar glucosa, son incapaces de utilizar la lactosa. Algunas bacterias son totalmente incapaces de utilizar cualquier carbohidrato; en su lugar, llegan a utilizar otras moléculas orgánicas como lo son los aminoácidos, para poder producir energía y también como una fuente de carbono. Este tipo de organismos fueron bautizados como asacarolíticos.  Pruebas de oxidación-fermentación: Las bacterias pueden utilizar carbohidratos mediante oxidación, fermentación o por ambas vías, esta es importante para la identificación de la bacteria. Estas pruebas determinan la capacidad de fermentar carbohidratos en un medio basal. Después de la glicólisis, el resultado final es un ácido o ácido con gas. Por lo que indicadores de pH determinan la presencia de un ácido. Hay bacterias que producen un solo ácido y orras que son fermentadores de ácidos mixtos. En cuanto a la oxidación, se requiere de un medio aeróbico y produce dióxido de carbono; la fermentación produce mucha más acidez en comparación con la oxidación pero la fermentación genera menos energía en
  • 20. 20 comparación. El medio basal O/F contiene 1% de carbohidratos y es utilizada para realizar este tipo de pruebas de identificación.  Agar triple azúcar hierro: el agar TSI y el agar Kliger Hierro KIA son útiles para la identificación presuntiva de bacterias entéricas Gram negativas, particularmente en el tamizaje de patógenos intestinales. Poseen la misma preparación excepto que el agar TSI contiene lactosa, sacarosa y glucosa. Ambos agares son utiles para detectar la capacidad de los microorganismos de fermentar carbohidratos para producir gas a partir de la fermentación de azúcares y para detectar la producción de H2S. Es importante que las reacciones se lean en un periode incubación de 18 a 24 horas; de lo contrario es posible obtener resultados erróneos. Reacciones que pueden ser observadas: o Sin fermentación: pueden degradar peptonas pero no fermentar u oxidar. o Fermentación solo de glucosa o Fermentación de lactosa/sacarosa o Producción de H2S o Producción de gas o ausencia de la misma  Prueba de orto-nitrofenil-B-D-galactopiranósido: los organismos que son dLF aparecen como colonias no fermentadorasen el medio de aislamiento primario. En este caso el organismo carece de la enzima B-galactósido permeasa, pero posee B-galactosidasa. Metabolismo de la glucosa y sus productos metabólicos:  Prueba rojo metilo: las bacterias se incuban en un medio caldo que contiene glucosa. Debe incubarse por 3 a 5 días a 35ºC. Luego se pasa la mitad del caldo a un tubo limpio para la pruebade VP. Si la glucosa se metaboliza por vía de fermentación ácido mixta que lleva a un pH bajo que con la adición de pH MR se vuelve rojo y si es negativa permanecen amarillos.  Prueba de Voges-Proskauer: en algunas bacterias, los ácidos formados durante la fermentación pueden metabolizarce todavía más a 2,3-butanediol a través de la acetoína intermedia. Luego de incubación, se añade alfa-naftol como intensificador de color, luego se se añada KOH y 40% de NaOH y luego se agita para promover la oxidación. En presencia de estos compuestos el diacetilo se torna rojo con pH neutral, lo que es un resultado positivo. Una bacteria nunca puede ser positiva para ambos, MR o VP. Utilización de aminoácidos:  Pruebas de descarboxilasa y dihidrolasa: las pruebas de descarboxilasa determinan si una bacteria posee enzimas capaces de descarboxilar aminoácidos específicos presentes en el medio de prueba. Los productos de la descarboxilación son moléculas de amina o diamina y CO2 con producción de alcalinidad. La prueba para detectar la descarboxilación utiliza medio base de descarboxilasa de Moeller, es un caldo que contiene glucosa, peptonas, 2 indicadores de pH, púrpura bromocresol y rojo cresol, un aminoácido específico con una concentración de 1%. Si el organismo produce la descarboxilasa específica y se ataca el aminoácido
  • 21. 21 en el medio, la liberación de los productos aminas ocasiona un cambio en el pH alcalino, lo que lleva a la aparición de un color púrpura que señala un resultado positivo. Si no se produce descarboxilasa, el color se mantiene amarillo y la prueba sería negativa.  Prueba de la desaminasa: aminoácidos pueden ser metabolizados por las desaminasas. La prueba de la fenilalanina desaminasa determina si un microorganismo posee la enzima que desamina la fenilalanina a ácido fenilpirúvico. Medio agar inclinado con 0,2% de fenilalanina, se inocula la colonia y si hay reacción de color verde es positivo. Pruebas misceláneas:  Utilización de citrato: determina si un organismo puede utilizar citrato de sodio como única fuente de carbono. Las bacterias capaces de utilizar citrato utilizarán las sales de amonio, con liberación de este compuesto, lo que resulta en un pH alcalino que cambia el medio de verde a azul.  DNasa: DNasa bacterianas en su mayoría sonendonucleasas que clivan los enlaces internos de fosfodiéster y llevan a la producción de subunidades más pequeñas. El medio de prueba casi siempre contiene ADN al 0,2%. El ADN no hidrolizado es insoluble en HCl y forma un precipitado. Los oligonucleótidos formados por la acción de la DNasa se disuelven en el ácido y forman un halo alrededor del inóculo que se comprende como un resultado positivo.  Producción de indol: productos de degradación de triptofano. Se inoculan bacterias en caldo triptófano o peptona. Prueba de indol de Ehrlich, si hay indol se desarrolla un color rojo.  Agar inclinado de lisina hierro: contiene aminoácido lisina, glucosa, citrato de amonio férrico y tiosulfato de sodio. Indicador de pH es púrpura bromocresol. Se utiliza en su mayor parte para determinar si las bacterias descarboxilan a la lisina.  Agar motilidad-indol-ornitina: medio agar semisólido que se usa para detectar la presencia de motilidad, la producción de indol y ornitina descarboxilasa. La motilidad se muestra por la nubosidad del medio o diseminación del crecimiento de la línea de crecimiento. La descarboxilación de la ornitina se indica por presencia de color púrpura en todo el medio.
  • 22. 22 IV.Análisis En este capítulo, se profundizan Acerca de las características bioquímicas de organismos Gram negativos; que poseen características muy interesantes en el área de la química. Muchas de estas, forman parte de sus métodos de acción para la causa de patologías en los hospedadores. Si bien, éstas no solamente se limitan a eso, sino que son un objeto de análisis para la realización de estudios de laboratorio bioquímicos para el diagnóstico de enfermedades. El estudiante de medicina, no tiende a practicar mucho estas pruebas, excepto en prácticas de microbiología, puede resultar interesante para el estudio de las características propias de cada bacteria. Es curioso que en este capítulo solo se incluyera a las bacterias Gram negativas y no a las positivas, lo cual puede deberse a la gran variabilidad de las propiedades bioquímicas de el grupo de bacterias Gram negativas. No hay mucho que especificar de este capítulo, además, de resaltar estos puntos de interés. Vemos también que la coloración es un punto clave para detectar de forma simple si la reacción es positiva o negativa; sin el uso de pigmentos, la observación o identificación de la producción de una reacción de fermentación u oxidación sería muy compleja y requeriría mucha experiencia y práctica; sin embargo, esta simplifica el proceso de identificación al señalar una reacción por un sencillo cambio de color. Para lograr, este tipo de identificación identificación, se tuvo que analizar la estructura química de muchos componentes que forman parte de las reacciones y que pudieran reaccionar como un pigmento principalmente de acuerdo a los niveles de pH de una reacción bioquímica, como es en el caso de la fermentación y oxidación ya sea de carbohidratos o aminoácidos; esto nos quiere decir, que la microbiología no solamente es el estudio de microorganismos por sí solo, sino que integra otras de otras disciplinas que pueden ayudar para el reconocimiento y análisis de estos organismos que llegan a causar patologías y que por ello lo presentan elementos muy importantes en la disciplina de la medicina, integrando los conocimientos de estas tres disciplinas ya sea la medicina por sí misma, en conjunto con la microbiología y ésta a su vez con la bioquímica y muchas otras disciplinas más que ayudan en el estudio correcto y también en la ampliación de los conocimientos previos que tenemos de esta rama de la ciencia. La integración de tecnologías, para los sistemas automatizados de diagnóstico; deben ser resultados ya que le presentan un gran avance para agilizar los procesos de diagnóstico y por lo tanto para la asignación de un tratamiento adecuado y efectivo; en un límite de tiempo muy corto a comparación de otros métodos de laboratorio para el diagnóstico de enfermedades causadas por bacterias gran negativas.
  • 23. 23 V. Inmunodiagnóstico de las enfermedades infecciosas VA.Resumen En 1896 se descubrió el fenómeno de la aglutinación bacteriana en el suero humano y rápidamente fue reconocido como una herramienta muy poderosa. Se determino que el suero no solo era de gran ayuda para la serotipificación, sino también para evaluar la capacidad de aglutinación de las bacterias. La reacción del suero de los pacientes con bacterias era indicativa de una exposición previa al organismo, también determina el nivel de la respuesta inmune y la protección contra el agente infeccioso. Los anticuerpos son proteínas que produce el suero humano como resultado de una infecc por bacterias o virus. La serología estudia estas proteínas y su reacción con antígenos. Las pruebas serológicas se referian originalmente a muestras corporales como el suero o la sangre, pero hoy en día también incluyen LCR y orina. También se utilizan enzayos inmunológicos basados en los principios de las reacciones antígeno-anticuerpo para detectar y cuantificar analitos, como proteínas séricas, hormonas, y fármacos. La mayor ventaja de los estudios serológicos es la posibilidad de estudiar y detectar organismos que son prácticamente imposibles de cultivar. También se pueden utilizar como una herramienta que determinara el pronóstico o la monitorización de terapias. Una de las grandes desventajas es el tiempo que se debe esperar para obtener resultados satisfactorios, para medir la respuesta inmune del huésped frente a un organismo denen pasar alrededor de 10 a14 días luego del inicio de la infección. También, el anticuerpo que se va a detectar puede haberse producido contra otro organismo y se puede observar una prueba con un falso positivo. Anticuerpos en pruebas serológicas Antígenos: muchos son específicos y de bajo peso molecular. El anticuerpo policlonal representa una mezcla de múltiples anticuerpos derivados de múltiples células contra varios epítopes encontrados en un antígeno o dirigidas frente a diferentes antígenos. Primera respuesta inmune IgM, seguida de una respuesta inmune anamnésica con IgG. Las pruebas serológicas que están diseñadas para detectar anticuerpos IgG e IgM por separado toman ventaja de las diferencias en la producción de IgM entre la respuesta inmune primaria y una secundaria. A menos que una prueba serológica se diseñe para medir anticuerpos específicos de tipo IgM e IgG en un solo espécimen de suero, el diagnóstico serológico de una enfermedad infecciosa requiere de la medición de la concentración total de anticuerpos en especímenes de suero tanto en fase aguda como de fase convaleciente. Las desventajas de las pruebas séricas agudas y convalecientes incluyen múltiples visitas para la extracción de sangre del paciente, así como el tiempo necesario para detectar una elevación en el título de anticuerpos. Se pueden recolectar sueros demasiado temprano en el curso de la enfermedad dando como resultado falsos positivos, en este caso la muestra de la fase convaleciente sería positiva y la de fase aguda sería negativa; esto se denomina seroconversión que toma lugar entre 2 a 3 semanas luego
  • 24. 24 del comienzo de la enfermedad. Los problemas con los anticuerpos policlonales pueden reducirse al utilizar anticuerpos monoclonales, estos rara vez aparecen de manera natural y casi siempre se asocian con algún tipo de proceso anormal de enfermedad inmune. Tienen avidez y son muy específicos. Si una población bacteriana contiene una forma alterada o mutada del antígeno puede que no reaccione con el antígeno monoclonal y de un falso negativo. La mayoría de las reacciones antígeno-anticuerpo tienen una especificidad elevada, esto es, los sitios de fijación de antígeno en la molécula de anticuerpo reaccionan con epítopes específicos y no con otros antígenos que contienen diferente epítopes. Los anticuerpos producidos en respuesta a una molécula que reacciona también contra un antígeno de una fuente no relacionada se denominan anticuerpos heterófilos. Debido a la reactividad cruzada del anticuerpo, muchas veces es mejor llevar a cabo una batería de pruebas serológicas con organismos que se sabe que mostrarían una reactividad cruzada y hacerlas con sueros pareados. Una prueba serológica ideal debería tener una precisión diagnóstica del 100%, en la práctica estas no cumplen este ideal. Con el objeto de determinar el porcentaje de individuos expuestos o infectados con anterioridad por los agentes en un área geográfica, pueden realizarce pruebas serológicas para un agente infeccioso en específico o una batería de agentes. En algunas situaciones, puede llegar a ser muy importante determinar si un individuo es inmune a una enfermedad infecciosa específica. Las pruebas serológicas se utilizan con frecuencia para ayudar a diagnosticar infecciones congénitas en un recién nacido. Algunos agentes infecciosos tienen la capacidad de cruzar la placenta y ocasionar infección en el feto. Dichas infecciones pueden ocasionar sólo síntomas mínimos en la madre durante el embarazo y pueden pasar desapercibidas en ese momento. Sin embargo, si la madre ni es inmune, la infección puede ser significativa para el feto. La evaluación del suero de la madre para detectar anticuerpos IgG es inútil a menos que haya sido sometida a tamizaje prenatalmente o al comienzo del embarazo y los resultados de las pruebas de anticuerpos hayan sido negativos. La detección de anticuerpos IgM en el suero neonatal es el método de elección para el diagnóstico serológico de la infección congénita. La detección de anticuerpos puede requerir una gran cantidad de tiempo para hacerse positiva. Las muestras se adquieren de casi cualquier fluido corporal. La reacción de precipitación se encuentra en los ensayos que involucran la difusión de un antígeno y anticuerpo soluble. La reacción de precipitación tiene su mayor estabilidad cuando se llevan a cabo en gel de agarosa.  Inmunodifusión doble: también llamada difusión en gel de Ouchterlony. Esta se utiliza con mayor frecuencia para detectar exoantígenos micóticos o anticuerpos séricos. Las reacciones pueden tomar 48 a 72 horas para desarrollarse.  Inmunodifusión radial simple: se utiliza para cuantificar la concentración del antígeno, aunque no se usa con mucha frecuencia hoy en día. Es muy lenta.  Floculación: variación de las pruebas de precipitación. La reacción antígeno- anticuerpo forma un aglutinado. Detecta anticuerpos reagina.
  • 25. 25 Ensayos de aglutinación (pasiva/activa)  Aglutinación de latex: la fuerza y rapidez de la reacción varían según las condiciones de la prueba y según la concentración del antígeno del espécimen.  Coaglutinación estafilocócica: utiliza un anticuerpo unido a partículas para realzar la visibilidad de las reacciones antígeno-anticuerpo. Utiliza S.aureus. Es en extremo específica, aunque puede ser menos sensible que la LA para detectar pequeñas cantidades de antígeno.  Hemaglutinación: pasiva o indirecta. Los antígenos microbianos se unen a eritrocitos por medio de una sustancia que promueva la unión cruzada de los antígenos.  Inhibición de la hemaglutinación  Aglutinación mediada por liposomas Ensayos de neutralización se basan en la interracción de un antígeno biológicamente activo con anticuerpos que pueden bloquear o inactivar la actividad biológica del antígeno. Inmunoensayos marcados:  Ensayos inmunofluorescentes: método rápido. Anticuerpos marcados son llamados conjugados. Pueden ser marcados directos o indirectos.  Inmunoensayos unidos a membrana : las características del flujo y el área de superficie grande de la nitrocelulosa, el nailon y otras membranas, aumentan la velocidad y sensibilidad de las reacciones de EIA.  Inmunoensayos ópticos: se basa en la interracción de los complejos antígeno- anticuerpo sobre superficies inertes.  Prueba de fijavión del complemento: Han sido reemplazadas por pruebas más rápidas y sensibles.  Western Blot: permite la caracterización de múltiples anticuerpos con diferentes idiotipos para un agente infeccioso al separar primero de forma electroforética los antígenos microbianos o virales y transferirlos a una membran de nitrocelulosa.  Dot blot: sigue los principios de WB pero las proteínas se purifican y aplican de manera directa a localizaciones específicas sobre la superficie solida.
  • 26. 26 VB.Análisis En este capítulo se hace incapie en la materia de inmunología, la cual es muy importante en la formación de médicos. Si bien un médico no realiza estas pruebas, su estudio y comprensión permitiran comprender la interracción del sistema inmune como la invasión patógena, lo cual determina el avance de la enfermedad. Los usos de estas pruebas van mucho más alla de considerarse simplemente diagnóstica, pueden ayudar al médico a predicir la posible evolución de una infección, determinar el estado inmune en contraste con la acción del patógeno; sus usos en la epidemiología son vastos para determinar el grado de infección en poblaciones en estudio, lo cual es de claro interes al estar frente a casos masivos de una enfermedad o infección en particular, como es el caso actual con la pandemia a causa del Covid-19. A parte de ello se nos recalca que en muchos casos puede darse la presencia de falsos positivos o negativos, por lo que se debe estar atento al estado del paciente para determinar que tipo de muestra se debe ordenar para confirmar el diagnóstico; una prueba realizada antes de tiempo o demasiado tarde puede alterar las concentraciones de anticuerpos o antígenos, alterando los resultados finales de los cuales depende el futuro del tratamiento. La importancia que poseen en casos de mujeres embarazadas y en el recién nacido, ayuda a la prevención de enfermedades que pueden transmitirse de forma congénita. Muchas de estas pruebas son muy específicas como lo ha determinado este capítulo, pero, muchas de ellas llegan a ser muy sensibles y especialmente específicas en ciertas enfermedades como lo es el VIH por ejemplo; gracias a esta particularidad se pueden agilizar las pruebas de confirmación y diagnóstico de enfermedades que tienden a debilitar el sistema inmune y poder dar el tratamiento o prevención poblacional adecuada.
  • 27. 27 VI. Mecanismos de acción antibacterial y mecanismos de resistencia de las bacterias. VI.Resumen Los agentes antimicrobianos incluyen a los antibacterianos, antimicóticos, antisépticos, antibióticos, preservantes, esterilizantes y desinfectantes; todos tienen la capacidad de de eliminar o suprimir el crecimiento de los microorganismos. Son un componente esencial de la práctica médica, que se utilizan para tratar, prevenir y controlar la diseminación de los patógenos en el tejido y en fómites. En la medicina clínica se utilizan aproximadamente 23 clases únicas y 18 subclases de antibacterianos útiles desde el punto de vista clínico. Los agentes antimicrobianos se dirigen contra procesos celulares anabólicos como la síntesis de la pared celular, la síntesis del folato, la replicación de ADN, la transcripción de ARN y la traducción de ARNm. Estas son consideradas dianas críticas.  Inhibición de la biosíntesis de la pared celular bacteriana: el peptidoglicano es un constituyente mucopolisacárido único de la pared celular bacteriana. La localización y cantidad varia dependiendo del tipo de bacteria. La biosíntesis del peptidoglicano tiene cuatro etapas mayores: síntesis de los precursores en el citoplasma, transporte de los precursores unidos a lípidos a través de la membrana citoplasmática, inserción de las unidades de glicano en la pared celular y el enlace y maduración transpeptidación. Los Inhibidores actúan principalmente en las estapas 3 y 4. Especialmente los B-lactámicos que incluyen a la penicilina.  Inhibición de la síntesis del folato: la ruta del ácido fólico proporciona las moléculas precursoras esenciales necesarias para la biosíntesis del ADN de las bacterias. La ruta esta mediada por dos enzimas clave, la dihidropteroato sintetasa y la dihidrofolato reductasa, que median la formación del tetrahidrofolato a partir de dihidrofolato. El sulfametoxazol bloquea el paso que lleva a la formación de 7,8-dihidropteroato al inhibir de manera competitiva la fijación del análogo estructural ácido aminobenzoico con la dihidropteroato sintetasa. El trimetoprim bloquea el paso que lleva a la formación de THF al prevenir el reciclado de las coenzimas del folato mediado por la dihidrofolato reductasa. Estas son moléculas completamente sintéticas.  Interferencia con la replicación de ADN: las enzimas necesarias para la replicación del ADN incluyen las topoisomerasas I, II, III y IV. Las quinolonas son fármacos antibacterianos que afectan la replicación del ADN al dirigirse hacia la topoisomerasa II y IV, enzimas consideradas importantes en el control de la topología, replicación y decatenación de, ADN al final del ciclo de replicación del ADN bacteriano. La resistencia a las fluoroquinolonas se correlaciona con el uso del agente en la población humana y se debe principalmente a mutaciones cromosómicas.  Interferencia con la transcripción del ADN: la transcripción es mediada por ARN polimerasa. La rifampina, un derivado sintético de la rinfampina B, tiene como diana principal la transcripción del ADN. Las rifamicinas combinadas con
  • 28. 28 ciprofloxacina y clindamicina se reportan como útiles para el tratamiento de las infecciones bacterianas que se han relacionado con la guerra biológica o el bioterrorismo.  Interferencia de la traducción del ARNm: la biosíntesis proteica requiere la unión secuencial de las subunidades ribosomales 30S y 50S al ARNm. Puesto que la síntesis proteica es central para la función celular, constituye una diana excelente para el desarrollo de un producto terminado antibacteriano. Es una diana principal para muchos fármacos que se dirigen hacia la subunidad 30S, mientras que otros atacan la subunidad 50S. Entre los Inhibidores ribosomales, los aminoglucósidos derivados naturalmente son la única clase con espectro bactericida amplio. Los aminoglucósidos son moléculas catiónicas contentivas de carbohidratos y su carga positiva proporciona la base para su interracción con una región específica del ARN 16S en la subunidad 30S. La fijación de los aminoglucósidos al sitio de unión A de la subunidad 30S impide el acoplamiento del aminoacil-tRNA, lo que lleva a la traducción errónea y la producción subsecuente de proteínas aberrantes.  Mecanismos de acción combinados: aun cuando los agentes antibacterianos pueden tener varios mecanismos de acción, por lo general predomina uno de ellos. Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos, las bacterias usan dos estrategias para evitar ser eliminadas por los agentes antimicrobianos: la resistencia y la tolerancia. La tolerancia es una propiedad de las bacterias latentes o persistente. Los mecanismos de formación de bacterias persistentes incluyen una caída en la concentración de ATP y la inactivación de las toxinas que detienen procesos celulares esenciales. Se ha mostrado que bacterias persistentes tienen mutaciones en los genes promotores. La resistencia se divide en mecanismos intrínsecos o en resistencia adquirida. Los mecanismos intrínsecos son una característica innata del microorganismo y se transmite a la progenie en forma vertical, se considera una característica natural y heredada de forma consistente en un grupo, género o especie en particular. Los mecanismos adquiridos de resistencia se deben a cambios en la composición genética usual de un microorganismo que llevan a una alteración en la fisiología y estructua celular, puede ser una característica asociada solo a ciertas cepas de una especie. Casi siempre son ocasionadas por mutaciones genéticas, adquisición de genes de otras especies o por combinación de eventos mutacionales. Mecanismos intrínsecos de resistencia  Biopelículas: son comunidades sésiles de microorganismos que están unidas de manera irreversible a una superficie sólida y están incrustados en una matriz de exopolisacáridos. Parecen carecer de factores de resistencia innatos y factores de resistencia incluidos.  Impermeabilidad: para que los antimicrobianos logren alterar la célula microbiana deben lograr traspasar la pared celular. El flujo de entrada depende de la naturaleza química del agente. Las porinas son un claro ejemplo de como funciona la impermeabilidad en conjunto con los LPS.  Eflujo: las bombas de eflujo funcionan como proteínas transportadoras para la extrusión de sustancias tóxicas y agentes antimicrobianos desde el interior de la
  • 29. 29 célula al ambiente externo. Se presentan de forma natural y se encuentran tanto en microorganismos susceptibles como en los resistentes. Se clasifican en 5 superfamilias; facilitador mayor, de resistencia/nodulación/y división celular, MDR pequeña, casete de fijación de ATP.  Inactivación enzimática:las bacterias pueden producir enzimas que destruyen a los agentes antimicrobianos antes de que estos sean capaces de alcanzar sus dianas. Como la B-lactamasas que hidrolizan antibióticos B-lactámicos. Mecanismos de resistencia adquirida  Eflujo: algunos genes de la bomba de eflujo se han trasladado a plásmidos, que pueden adquirirse por intercambio genético horizontal.  Modificación del sitio diana: puede reducir la afinidad de fijación del agente antimicrobiano a la diana. Estos tienen lugar principalmente mediante mutaciones cromosómicas, como se observa en los antimicrobianos quinolonas y oxazolidinonas, así como mediante la alteración enzimática de los sitios diana de los antibióticos macrólidos, glucopéptidos y B-lactámicos.  Adquisición de nuevas dianas: los microorganismos también se adaptan y se hacen resistentes al adquirir dianas celulares con afinidad reducida por el agente antimicrobiano.  Inactivación enzimática de los agentes antimicrobianos: es uno de los principales mecanismos de resistencia identificados en las bacterias y constituye una estrategia exitosa utilizada por muchos microorganismos. Se utilizan enzimas con el fin de inactivar la acción del fármaco, como es el caso de las B-lactamasas. Debido a la existencia de B-lactamasas que inhiben a los fármacos de más utilidad, se han creado diverosos medios que inhiban la acción de esta enzima. Extienden de este modo el rango de bacterias suceptibles a los B-lactámicos. Se aplican en conjunto con fármacos B-lactámicos, como por ejemplo el ácido clavulánico en conjunto con amoxicilina y el sulbactam en conjunto con ampicilina.
  • 30. 30 VI.Análisis Este capítulo es de gran interés médico. La etapa más importante en el desarrollo y estudio clínico de una enfermedad, después del diagnóstico, es el tratamiento. Las enfermedades causadas por bacterias son comunes en nuestra vida diaria, hemos escuchado de personas que han muerto debido a la acción de un microbio, una lesión en la rodilla de un niño que evoluciona a una gran complicación debido a la acción de una bacteria. Desde la antigüedad han estado presentes y por ello es necesario que se posean tratamientos efectivos, que eviten y controlen el crecimiento y acción de los microorganismos. Aunque este fin, cada vez es más difícil; como todo ser vivo, las bacterias tienden a evolucionar, a adaptarse con el fin de sobrevivir, algo natural en cualquier ser vivo. Por ello, tienden a mutar y modificar sus componentes y métodos de acción con el fin de evitar su destrucción a causa de fármacos. Cada día muchos de los antibióticos utilizados para tratar infecciones bacterianas, son inutiles o no poseen el mismo efecto que antes era notorio. La resistencia y tolerancia a antibióticos por parte de las bacterias, poco a poco se convierte en un problema de salud pública, al que se le debe buscar una solución. Para encontrar esta solución se debe estudiar los mecanismos que utilizan las bacterias en contra de los fármacos y a su vez crear medios que eviten o engañen estas defensas. De la misma forma que muchas bacterias buscan un punto débil en nuestro sistema inmune, el médico debe buscar la debilidad de la bacteria y atacar esta debilidad hasta destruirla. Por ello, se necesita de la investigación activa, principalmente en los estudiantes, con el fin de encontrar soluciones en conjunto con la evolución de los microorganismos y de la población. El estudiante solo puede llegar a colaborar en estos procesos, siendo conocedor de los mecanismos, actualmente conocidos, que inhiben la acción de los antibióticos.
  • 31. 31 VII. Aplicaciones del diagnóstico molecular VII.Resumen El diagnóstico molecular representa un avance significativo en el laboratorio de microbiología clínica. Las pruebas diagnósticas moleculares proporcionan una detección rápida de ciertos agentes infecciosos y son en particular utiles para los agentes que son difíciles de cultivar o que toman mucho tiempo en crecer en medios de cultivo. Los ensayos diagnósticos moleculares les proporcionan a los médicos respuestas rápidas para las opciones de tratamiento y, de este modo, se ahorra un tiempo valioso cuando se trata de una infección que amenaza la vida. El acoplamiento de moléculas complementarias de una sola hebra es un componente clave para muchas de las pruebas. Las dos moléculas de ácidos nucleicos de una sola hebra utilizadas en las técnicas de hibridación reciben diferentes nombres. Una de estas se conoce como diana. La hebra diana es la secuencia de ADN o ARN que será identificada por el método de diagnóstico molecular aue se utilice. La molécula de diana de ácido nucleico se inmoviliza en un medio de soporte sólido o se suspende en una solución. La otra hebra involucrada en los métodos de hibridación es llamada sonda que es usualmente un oligonucleótido de ADN o ARN de una sola hebra marcado con una molécula reportera que puede detectarse de manera visual o mediante un instrumento; la sonda va a señalar a la diana. Diversas variables afectan el resultado de una reacción de hibridación, estas incluyen la temperatura, la composición base de nucleótidos de la sonda, la longitud de la misma, su concentración, el grado de complementariedad entre la diana y la sonda, la potencia iónica y el pH. La selección de la sonda adecuada para las reacciones de hibridación es de suma importancia.  Hibridación de soporte sólido: blotting, el ácido nucleico diana se transfiere a una membrana compuesta por nitrocelulosa o nylon y se inmoviliza. Luego se hibrida la sonda marcada con ácido nucleico inmovilizado y se utilizan pasos de lavado para remover el exceso de sonda y aclarar la señal. Los resultados se observan por sondas colimétricas o sondas quimioluminiscentes. o Southern blot: electroforesis en gel de agarosa. o Northern blot: se usa para detectar moléculas de ARNque casi siempre son transcriptos.  Hibridación in situ: el transcripto de ADN o de ARN puede detectarse de manera directa en los tejidos con sondas marcadas. También llamada amplificación in situ.  Hibridación en solución: es la que se utiliza con mayor frecuencia en el laboratorio. Por lo general se basan en quimioluminiscencia.
  • 32. 32 Procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tienen una mayor utilidad clínica. Puede usarse para incrementar la cantidad del ácido nucleico del microorganismo diana en una muestra en poco tiempo. La amplificación también se usa en algunos ensayos para incrementar la magnitud de la señal luego de hibridar una sonda con el ácido nucleico de un microorganismo. Muchas de estas pruebas combinan rapidez con una sensibilidad y especificidad elevadas. Aunque si bien estas requieren un costo económico muy alto, equipos especiales para su realización, un espacio bien equipado para evitar contaminación y un equipo de personal muy capacitado.  Reacción en cadena de polimerasa: PCR. Puede amplificar una sola copia de ADN diana en una cantidad exponencial de producto de ácido nucleico en el curso de 25 a 40 ciclos de reacción. Cada ciclo consta de tres pasos que son la desnaturalización del ADN diana, anillo cebador a la secuencia diana, extensión del cebador. Esta también posee varios componentes como la ADN polimerasa, un amortiguador para la polimerasa, cebadores, los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos, además de una fuente de ADN molde. Se requiere de un termociclador. Se han descrito varias variaciones de PCR como: o RT-PCR (Reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa): técnica más sensible disponible para detectar y cuantificar el ARNm. o PCR multiplex (Reacción en cadena de polimerasa multiplex): se utiliza para detectar de manera simultánea dos o más dianas a partir de un tubo de PCR. o PCR anidada (Reacción en cadena de polimerasa anidada): es sumamente sensible y específica que sirve como una forma de control interno que garantiza la especificidad. Consiste en dos ensayos consecutivos y diferentes. El primero es un PCR normal y el segundo es una parej de cebadores es complementaria con una región interna del amplicón derivado del primer ensayo de PCR. Puesto que la PCR es demasiado sensible, pequeñas cantidades de ácido nucleico extraído o amplicones remanentes de ensayos de PCR previos pueden contaminar los ensayos futuros. Lo cual puede llevar a falsos resultados, ya sean positivos o negativos. Se utilizado con mucho éxito a la uracilo-N-glicosilasa para reducir los remanentes de los ensayos de PCR. El análisis de los amplicones de la PCR puede lograrse mediante diferentes procedimientos. La electroforesis en gel de agarosa toma 1 a 2 horas para separar los productos de la PCR, genera desperdicios peligrosos y requiere de un sistema imaneológico.
  • 33. 33 La PCR en tiempo real fue un adelanto muy importante para la detección de los productos de la PCR. Los amplicones se detectan a medida que se acumulan durante la PCR en tiempo real luego de cada ciclo. De este modo, se puede observar con rapidez un resultado positivo, muchas veces mientras el ensayo todavía está corriendo. Esta técnica no utiliza un gel agarosa, usualmente no acumula residuos peligrosos y el sistema de imágenes forma parte de la instrumentación en tiempo real. Esta utiliza un colorante reportador fluorescente, muchas veces en forma de sondas o balizas marcadas, denominadas fluoróforos. La fluorescencia se mide mediante la monitorización directa del incremento de esta o, indirectamente, mediante transferencia de energía de resonancia de fluorescencia. Algunas plataformas de PCR en tiempo real pueden proporcionar un análisis de la curva de fusión para determinar los resultados del ensayo o verificar la pureza del producto de la PCR y determinar si están presentes cebadores-dímeros. Otras reacciones de amplificación de ácidos nucleicos:  Amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos: NASBA es un procedimiento isotérmico, osea, todas las reacciones se dan en una misma temperatura. No requiere de un termocilador. Utiliza tres enzimas: AMV transcriptasa reversa, ribonucleasa H y T7 ARN polimerasa.  Amplificación mediada por transcripción: TMA utiliza una transcripción reversa con RNasa H y actividad T7 ARN polimerasa.  Reacciones de amplificación de señal Muchas veces se usan técnicas de tipificación de cepas para comparar las cepas locales y determinar si un brote local es ocasionado por un solo tipo de muestra o por múltiples tipos. Métodos de tipificación no amplicados:  Análisis del perfil de plásmidos  Southern blotting  Análisis del ADN cromosómico con enzima de restricción  Electroforesis en gel de campo pulsado  Electroforesis enzimática de múltiples locus Métodos de tipificación amplificados  Técnicas del ADN polimórfico amplificado aleatorio  Reacción en cadena de polimerasa de elementos extragénicos palindrómicos repetitivos  Análisis de múltiples locus del número variable de repeticiones en tándem  Tipificación de secuencia de múltiples locus
  • 34. 34 VII.Análisis La tecnología cada día avanza, y con toda la teoría estudiada muchas veces se olvida el papel que juega el desarrollo de nuevas tecnologías para la medicina y como depende en gran manera de ella para una práctica adecuada de la medicina. La prueba de ello, esta en las pruebas diagnósticas que cada día avanzan, dejando atrás herramientas y métodos que antes eran muy utilizados; en su gran mayoría esto pasa gracias a la necesidad de observar resultados de forma más rápidas, no existe espacio para margenes de error o retrasos. Esto ha impulsado la busqueda de nuevas técnicas como lo es el PCR, para aumentar las probalidades de obtener un diagnóstico adecuado y que deje libre de dudas al personal médico acerca de lo que presenta el paciente y que necesita. Aunque claro, todo posee desventajas en algún momento, y en este caso el punto débil de la PCR es sus altos costos; ya sea de forma económica o en la presencia de un personal correctamente preparado para la utilización de las herramientas requeridas para este tipo de prubas. Por ello, se deben considerar la creación de nuevas técnicas para reducir costos y dar la posibilidad a muchos otros centros de salud de poder adquirir un medio rápido y fiable para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y que requieren una intervención rápida.
  • 35. 35 VIII. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos VIII.Resumen Estas pruebas se realizan en bacterias y hongos aislados de especímenes clínicos para determinar cuales pueden ser los agentes antimicrobianos efectivos en el tratamiento de las infecciones ocasionadas por estos organismos. Solo deben evaluarse aquellos organismos con probabilidad de contribuir a una infección pues la evaluación de organismos que no están involucrados en una infección puede ser confusa para el médico y puede llevar a una infección más seria con desarrollo de resistencia a antimicrobianos. Factores que se deben tomar en cuenta para determinar si se requiere evaluación, además de la susceptibilidad impredecible de un patógeno potencial se debe incluir:  El sitio corporal donde se aisló la bacterio  La presencia de otros organismos y la calidad de la muestra donde se logró el crecimiento del organismo.  El estado del huesped No se realizan pruebas de susceptibilidad en bacterias que son predeciblemente susceptibles a los agentes antimicrobianos utilizados de forma habitual para tratar infecciones ocasionadas por estas bacterias. En la actualidad se usan más de 50 agentes antimicrobianos para el tratamiento de las infecciones bacterianas y micóticas, entre los cuales muchos tienen una eficacia clínica comparable. Cada laboratorio debe determinar cuáles son los agentes apropiados para evaluación de rutina contra diversos organismos en su contexto. Es importante que los fármacos evaluados por el laboratorio se equiparen lo más posible con el formulario institucional. Desde la perspectiva del laboratorio, el factor limitante para el número de fármacos evaluados casi siempre es el número que puede probarse de manera práctica con un método específico. La población de pacientes debe considerarse en la elección de los agentes antimicrobianos a ser evaluados. Por lo general, un laboratorio definirá una batería de 10 a 15 agentes antimicrobianos para la evaluación de rutina de Enterobacteriaceae, bacilos Gram begativos no exigentes, estafilococos y enterococos. En ocasiones se lleva a cabo una batería separada para los aislados urinarios que representan fármacos apropiados para el tratamiento de las infecciones del tracto urinario. Los laboratorios que encuentran un número significativo de bacterias resistentes a los antimicrobianos utilizados con mayor frecuencia pueden incluir una batería suplementaria que contenga agentes antimicrobianos con actividad aumentada. Puesto que algunas veces se desconoce la identidad del aislado bacteriano cuando se lleva a cabo la evaluación de la susceptibilidad, pueden probarse algunos fármacos que son inapropiados para ese aislado. En esos casos, no debe reportarse de manera indiscriminada un fármaco poruqe los resultados pueden ocasionar confusión. Los protocolos de reporte deben desarrollarse luego de la discusión con los médicos de enfermedades infecciosas, con los farmacéuticos y con aquellos con experiencia clínica con las prácticas de terapia antimicrobiana de la institución. Un principio fundamental de la terapia antimicrobiana es utilizar agentes menos tóxicos, con mayor relación costo- efectividad y más efectivos desde el punto de vista clínico, así como abstenerse de utilizar
  • 36. 36 aquellos agentes costosos y de espectro más amplio, aunque muchas veces es difícil lograr que el médico cumpla con ese objetivo. Como pauta general se sugiere que, dentro de una clase antimicrobiana, se reporten primero los agentes primarios del grupo A y solo se reporten los agentes secundarios del grupo B si existe una de las siguientes condiciones:  El aislado es resistente a los agentes primarios  El paciente no puede tolerar los agentes primarios  La infección no ha respondido a los agentes primarios  Un agente secundario sería una mejor elección clínica para la infección  El paciente tiene bacterias aisladas de otro sitio y un agente secundario puede ser útil para el tratamiento de ambas infecciones. También puede reportarse un agente secundario si el paciente tiene una infección polimicrobiana y es más probable que un agente secundario sea efectivo contra todos los patógenos presentes. De manera similar, puede reportarse un agente secundario si el paciente tiene una infección diseminada y un agente secundario puede ser efectivo en todos los sitios. Los agentes con actividad de muy amplio espectro o de potencia aumentada o de grupo C pueden evaluarse y reportarse por las razones enumeradas para los agentes secundarios. Pueden considerarse para la evaluación de rutina si una institución particular encuentra grandes números aislados resistentes a los agentes del grupo A y del grupo B.  Preparación del inóculo: uno de los pasos más críticos en la evaluación de susceptibilidad. Se preparan al añadir células de cuatro a cinco colonias aisladas de morfologías de colonia similar que crecen en un medio de agar no inhitorio a un caldo, lo que permite que crezcan hasta la fase logarítmica.  Estándares de turbidez de McFarland: debe estanderizarce la concentración del inóculo de bacterias a ser evaluadas pues, si se evalúan muy pocas bacterias, puede haber resultados falsos de susceptibilidad, del mismo modo que los resultados falsamente resistentes pueden deberse a la evaluación de demasiadas bacterias.  Estandarización del inóculo: la suspensión es demasiado densa si es más difícil de ver las lineas a través de la suspensión del inóculo que a través del estandar 0,5 de McFarland, en este caso el inóculo se diluirá con caldo o solución salina estéril adicional. Si la suspensión de la prueba es demasiado clara, se añaden más organismos o se vuelve a incubar la suspensión hasta que la turbidez alcance el estándar de McFarland. Métodos de dilución para la evaluación de la susceptibilidad se usan para determinar el MIC, o la concentración más baja de un agente antimicrobiano requerida para inhibir el crecimiento de la bacteria . Se añaden varias concentraciones de un agente antimicrobiano al caldo o medio agar.  Soluciones patrón de antimicrobianos  Pruebas de macrodilución en caldo (dilución en tubo)  Pruebas de microdilución en caldo  Paneles para concentración inhibitoria mínima de punto de corte  Pruebas de dilución en agar
  • 37. 37 Pruebas de difusión de disco (prueba de Kirby-Bauer) se basa en colocar con hisopo sobre la superficie de una placa estandarizada de agar Muller-Hinton una suspensión estandarizada de McFarland 0,5 de bacterias y se colocan sobre la superficie inoculada discos de papel que contienen concentraciones específicas del agente antimicrobiano. Luego de 16 a 18 horas de incubación se miden los diámetros de las zonas producidas por la inhibición del crecimiento bacteriano por el antimicrobiano y el resultado se interpreta como no susceptible, susceptible, intermedio o resistente a un fármaco particular de acuerdo con los criterios preestablecidos. En un punto crítico, la cantidad del fármaco en una localización específica en el medio es incapaz de inhibir el crecimiento del organismo de prueba y se forma una zona de inhibición, las cuales están relacionadas con las MIC y esta relación es la que se ha utilizado para determinar los puntos de corte para la interpretación de la medición de la zona particular que indique si el aislado es no susceptible, susceptible o resistente. El caldo y el agar de Mueller-Hinton constituyen los medios estándar usados para las pruebas rutinarias de susceptibilidad por dilución y por difusión de disco. Pero, estos medio no soportan el crecimiento de todas las bacterias que requieren evaluación; en consecuencia, los métodos de rutina deben modificarse para la evaluación de bacterias exigentes que requieren nutrientes suplementarios, condiciones de incubación modificadas o ambos. Algunos de estos organismos son:  Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp.  Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae  Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis  Helicobacter pylori y Campylobacter spp. Deben utilizarse procedimientos especiales para detectar la resistencia clínicamente significativa en algunas bacterias no exigentes.  Detección de la resistencia a la oxiciclina en los estafilococos  Resistencia o susceptibilidad disminuida a la vancomicina en el Staphylococcus aureus  Resistencia inducible a la clindamicina en estafilococos  Detección de resistencia de alto nivel a aminoglucósidos en los enterococos  B-lactamasas de espectro extendido
  • 38. 38 VIII.Análisis En la sección 6 de este dossier, se tocaron los mecanismos de resistencia que pueden usar los microorganismos para evitar la acción de ciertos fármacos, dependiendo del modo de acción de estos. Si bien podemos estudiar los mecanismos de resistencia y predecir o deducir que fármacos veran afectado su funcionamiento debido a estos; no podemos establecer por simple deducción los fármacos específicos que no poseeran efecto en los microorganismos. Para ello necesitamos exponer a la bacteria a la acción del fármaco y registrar su susceptibilidad a los efectos del mismo. Muchas bacterias han creado medios en los que varios fármacos muy utilizados ya no poseen afecto alguno, por lo tanto se necesita la creación de nuevos fármacos con un espectro más amplio que puedan combatir a la bacteria. Pero la forma de comprobar la acción de estos fármacos, es exponiendo a la bacteria y confirmar o negar su efecto. Si bien es muy útil, puede llegar a crear resistencia adquirida en las bacterias por su continua exposición a los antibióticos o antimicrobianos; situación que representa un alto riesgo biológico tanto para el microbiólogo, médicos y pacientes. Para evitar esta situación, se debe reducir el número de exposiciones que se realiza al microorganismo, algo complicado gracias a que es el único medio fiable por el momento para confirmar su acción. Así que por el momento solo se pueden aplicar las medidas de bioseguridad para evitar la fuga de especímenes que puedan exparcirse y aumentar el número de cepas o incluso especies resistentes a antimicrobianos, reduciendo las opciones de tratamiento. Es importante resaltar, por esta razón la búsqueda de nuevos antimicrobianos para adelantarse a los posibles mecanismos de resistencia más fuertes que puedan ser desarrollados por los microorganismos.
  • 39. 39 Conclusión En estos resúmenes y análisis, podemos ver la amplia gama de información que debe ser estudiada para la correcta aplicación de las diversas de los diversos métodos de laboratorio de microbiología para el estudio de microorganismos. Si bien cómo podemos señalar en muchos análisis, éste tipo de prácticas no son directamente relacionadas con la práctica médica, si son muy importantes para definir los diagnósticos y el procedimiento o forma en la que se deba llevar el tratamiento y el curso de la enfermedad. Por ello es necesario que el estudiante de medicina, pueda comprender y aplicar estos conocimientos con el fin de agilizar los procesos de diagnóstico para dar como resultado un tratamiento eficaz. Hoy en día con la tecnología, aplicada al campo de la medicina, A podido reducir el tiempo en el que antes se estimaba que se observarían resultados de estas pruebas de diagnóstico; lo cual es muy importante, debido al que reducir el tiempo de espera para un diagnóstico de confirmación, podemos aplicar de forma rápida un tratamiento que sea conocido que es el indicado para el caso, el tiempo en esta forma salvaría vidas, qué es el objetivo de la medicina.
  • 40. 40 Bibliografía Murray, P. R., Rosenthal, K. S., & Pfaller, M. A. (2014). Microbiología médica (7th ed., Vol. 1). Elsevier. Mahlen, S. D. (n.d.). Aplicaciones del diagnóstico molecular. In A. Kumar (Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (Vol. 1, pp. 219–244). Marsik, F. J. (n.d.). Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. In P. Mister (Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 268–302). Roberts, L. (n.d.). Recolección y procesamiento del espécimen. In Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 106–118). Mahon, C. R. (n.d.). Examen microscópico de materiales provenientes de sitios infectados. In Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 121–130). Mahon, C. R. (n.d.-b). Uso de la morfología de las colonias para la identificación presuntiva de microorganismos. In G. Manuselis (Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 162–173). Lehman, D. C. (n.d.). Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas. In Técnicas de laboratorio de microbiología(pp. 174–188). Lehman, D. C. (n.d.-b). Inmunodiagnóstico de las enfermedades infecciosas. In Técnicas de laboratorio de microbiología(pp. 191–217). Marsik, F. (n.d.). Mecanismos de acción antibacterial y mecanismos de resistencia de las bacterias. In A. Kumar (Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 247–265).
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