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Effet de température sur l'activité enzymatique

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Effet de température sur l'activité enzymatique

  1. 1. IIème série de Manipulations : Effet de température croissante sur la cinétique invertasique : I. Introduction : La cinétique de réaction est l'étude de la vitesse des réactionschimiques,et les vitesses de réaction peuvent varier considérablement sur une large gamme d'échelles de temps, Certaines réactions peuvent se déroulerà des vitesses explosives comme la détonation de feux d'artifice et certaines peuvent se déroulent , Pour comprendre la cinétique des réactions chimiqueset les facteurs qui marquent la cinétique,nous devonsd'abord examiner ce qui se passe lors d'une réaction au niveau moléculaire. Selon la théorie des collisions de la réactivité, les réactionsse produisent lorsque les molécules réactives« entrent effectivement en collision ». Pour qu'une « collision efficace » se produise, les molécules de réaction doivent être correctement orientées dans l'espace pouraccélérerla rupture et la formation de liaisons et le réarrangement des atomesqui entraînent la formation de moléculesde produit, Lors d'une collision moléculaire, les moléculesdoivent également posséder une quantité minimale d'énergie cinétique pour qu'une collision efficace se produise. Cette énergie varie pour chaque réaction et est connue sous le nom d'énergie d'activation (Ea). La vitesse de réaction dépend donc de l'énergie d'activation ; une énergie d'activation plus élevée signifie que moins de molécules auront suffisamment d'énergie pour subir une collision efficace, l’une des facteurs qui vont influencer cette collision moléculaire, Une augmentation de la température augmente généralement la vitesse de réaction, Une augmentation de la température augmentera l'énergie cinétique moyenne desmolécules de réactif. Par conséquent, une plus grande proportion de molécules aura l'énergie minimale nécessaire pour une collision efficace. On outre, au coursde cette manipulation, on ait utilisé un catalyst enzymatique qui est l’invertase, on a suivi la réaction catalysée au fur et à mesure l’augmentation de température de milieu réactionnelle,en principe, selon le modèle de collision moléculaire, la température va influencer la cinétique sans aucun plot décroissante au cours de temp, ce qui va formuler l’objectif de cette manipulation qui est l’effet de température sur la réaction catalysée par l’invertase.
  2. 2. II. Principe/Résultats : Approche protocolaire :  Préparation de série de 8 tubes à vice contenant chacun 1 ml de saccharose 0,1 M et I ml de tampon acétate 50 mM pH 4,70.  Effectuation de la mise en température de ces tubesà : 0 (glace +sel) : 10 (eau froide + glace); 20(tº ambiante) et aux BM:30-40 50-60-70°C.  Apres la mise de la solution purifiéesdepuisl’autolysat d’invertase, on céder la DNS au chaud, le développement de coloration, la lecture de Do comme un « output » de mesure de l’activité enzymatique correspondantes à chaque température.  La lecture des résultatsa révélé la cinétique au temp 5min comme suite, les valeurs colorées indiquent une dilution ponctuelle pour chaque absorbance par1/2 :  La représentation graphique montre et recapitulent cesvaleurs en f (T c) =v(Mm SH).  Pour examiner et rapporter la dépendance à la température par rapport la cinétique, il faut calculer le coefficient de température « Q10 » selon la mesure de la vitesse a des différentes températures, Q10 sans unité. C'est le facteur par lequel le taux augmente lorsque la température est augmentée de dix degrés.Si la vitesse de la réaction est T 0 10 20 30 50 60 70 DO 0,461 0,756 0,942 0,71 0,894 1,11 0,39 [C]MM (SH) 1,6069202 2,52649626 3,10629676 2,38310474 2,95667082 3,62998753 1,3855985 [C]MM(FD*) 1,6069202 2,52649626 3,10629676 4,76620948 5,91334165 7,25997506 2,77119701 V MM/MIN 0,32138404 0,50529925 0,62125935 0,9532419 1,18266833 1,45199501 0,5542394 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Enzyme under denaturation Optimum temperature Kinetic energy gain
  3. 3. complètement indépendante de la température,le Q10 résultant sera de 1,0.Si la vitesse de réaction augmente avec l'augmentation de la température,Q10 sera supérieur à 1. Ainsi, plus un processus est dépendant de la température, plus sa valeur Q10 sera élevée.  Pour les réactions chimiques typiques, les valeurs Q10 sont ~2. Pour de nombreux processus biologiques, en particulier ceux qui impliquent deschangements de conformation desprotéines/enzymatique à grande échelle, les valeurs Q10 sont supérieures à deux.  Pour le calcul, il faut mesurer avec des différentesvitesses avec un écart de 10 dégrées de températuresparcette équation. K1 (Vitesse au moment) K2( Vitesse au moment t2)  Les valeurs Q10 prennent une sorte de niveau variétale entre la température 60-70 dégrées avec un plot de stabilisation a la valeur 1.22 pour toutesles températures qui ne dépassent pas60 degrés celcuis.  Une interprétation possible donc sera tirée comme suivant : T© 10 20 V MM/MIN 0,50529925 0,62125935 T© 50 60 V MM/MIN 1,18266833 1,45199501 T© 60 70 V MM/MIN 1,45199501 0,5542394 Q10 = (0.621/0.505) × (10/20-10) = 1.229 Q10 = (1.452/1.182) × (10/60-50) = 1.227 Q10 = (0.554/1.452) × (10/70-60) = 0.38
  4. 4.  Pour mieux comprendre cette variation en activité jusqu'à la détention totale,Ea est considéré comme une meilleure approche selon Arrhenius.  La détermination de l'énergie d'activation aide à comprendre les besoins énergétiques de l'enzyme-substrat pour obtenir de l'énergie et initierune agitation qui améliore les chances de collisions moléculaires.  La loi d’Arrhenius peut s’écrire comme suit : k=Aexp(–E a/RT) lnk=lnA – (Ea/RT)  Pour la représentation graphique,il faut adopter cette équation comme suite : Ln(V) = -(Ea/R) × 1/T + ln (A), ln(A) c’est un facteur de proportionnalités. Q10 > 1, significant dependence between velocity and temperature Q10 < 1, significant independence between velocity and temperature, might be as a result of enzymedenaturation -1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 Ln(V) 1/T(K) Zone des températures pas trop élevées où la dénaturation est négligeable pendant les mesures Zone des "hautes" températures où la dénaturation est non négligeable y = -1278,4x + 3,8431 -1278,4 = -Ea/R,Coeff directeur
  5. 5.  La résolution de cette équation « -1278,4 = -Ea/R » va nous permettre de déduire l’’énergie d’activation, donc :  Ea=1278.4×8.314=10.6 KJ.mol-1 - Des études on étés faites(1) / (2), suggèrent qu’au-delà de 10 C, l'enzyme a besoin l'énergie maximale pours'activer - Selon une approche mathématique à partir de la loi d’arrenheus : - La problématique observée c’est qu’a un moment donné (60 dégrées Celsius), l’augmentation de la température n’obéit pas l’approche mathématique qui déclare on aura normalement la diminution de la Ea avec augmentation de T, c’est totalement le contraire. - On révèle donc premièrement que l’enzyme a besoin d’énergie plus important proche de l’Ea maximale aux basses températures - Deuxièmement, la mise en évidence de la sensibilité enzymatique,en quelque sorte cette n’est pas thermostable. III. Conclusion : - Comme réponse a la problématique initiale, nous devons conclure que l’activités invertasique,comme tous les enzymes qui ne sont pas thermostables(3), se présentent un seuille ou un plot décroissante perturbées lorsqu’on atteindre une certains dégréesde température,donc dans les systèmes biologiques, on ne peut pas parler du modèle de collision moléculaire avec un sens strict, mais plutôt avec cette exception trouvée au cours de cette études. IV. Références : Signification des flèches : Au température basse, l’énergie d’activation va d’être importante, si on veut de diminuer cette énergie, tous simplement il faut augmenter la température pour que ce rapport tend vers la diminution de Ea.
  6. 6. (1)A. E. Stearn. (1949) Kinetics of Biological Reactions, p. 25-41. In Advances in Enzymology and Related areas of Molecular Biology, Vol. 9. Edited by F. F.Nord.,Fordham Uni. N.Y. Interscience Publishers. (2) Benzinger, T. H. (1971), Thermodynamics, Chemical reactions and molecular biology. Nature (London). 229; 100-102 (3) Daniel, R. M., Danson, M. J., Eisenthal, R., Lee, C. K., & Peterson, M. E. (2008). The effect of temperature on enzyme activity: new insights and their implications. Extremophiles, 12(1), 51-59. -

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