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Electroforesis capilar

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ELECTROFORESIS CAPILAR



Técnicas avanzadas de análisis
PROGRAMA: ELECTROFORESIS CAPILAR

INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTOS BÁSICOS EN
 ELECTROFORESIS CAPILAR

 INSTRUMENTACIÓN BÁSICA

TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
¿Qué es la electroforesis?


Técnica de separación que se basa en la diferencia de movilidad o
velocidad de migración de partículas cargadas debido a la acción de
un campo eléctrico.



  Campo eléctrico E



Voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación.

                                                     E   v

                                      Conductor de la corriente eléctrico
   Medio de separación
                                     Controla la carga eléctrica
ELECTROFORESIS – EVOLUCIÓN
        HISTÓRICA
REUSS (1809) describe el fenómeno Elektro = electricidad y
phoresis = acción de llevar.

TISELIUS (1930), Uso de Electroforesis en disolución libre
en tubos verticales en forma de U

MARTIN & EVERAERTS (1967)
 Electroforesis en tubos abiertos de vidrio y rellenos con
hidroximetilcelulosa

HJERTEN (1967)
Electroforesis en tubos de 3.0 mm

VIRTANEN (1969)
 Electroforesis en tubos de 200 y 500 μm

JORGENSON (1981)
 Electroforesis Capilar. Columnas de 75 μm
 y utilización de elevados voltajes

ACTUALIDAD
Electroforesis

 Técnica de separación basada en el movimiento de los
  analitos en un medio conductivo en respuesta a la
  aplicación de un campo eléctrico.

 El medio conductivo es generalmente una disolución
  tampón.

 En ausencia de otros factores, las especies catiónicas
 migran hacia el cátodo (electrodo -) y las especies
 aniónicas migran hacia el ánodo (electrodo +).

 La velocidad de migración es una relación directa entre
  el tamaño y la carga de cada especie.
Electroforesis
Dependiendo de la presencia o ausencia de
  soporte o
medio de estabilización, podemos hacer dos
  claras
divisiones en las Técnicas electroforéticas:

Métodos en solución libre

 La muestra se introduce en un tubo en forma de
  U el cual está rellenado de una disolución
  tampón.

 No existe sistema    de   soporte   o   medio   de
  estabilización.

 Cuando se aplica el campo eléctrico las
  especies migran en función de su relación
  carga/masa.

 Tiselius en 1948 recibió el Premio Nobel por la
  aplicación en la purificación de proteínas.

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Electroforesis capilar

  • 2. PROGRAMA: ELECTROFORESIS CAPILAR INTRODUCCIÓN FUNDAMENTOS BÁSICOS EN ELECTROFORESIS CAPILAR  INSTRUMENTACIÓN BÁSICA TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
  • 3. ¿Qué es la electroforesis? Técnica de separación que se basa en la diferencia de movilidad o velocidad de migración de partículas cargadas debido a la acción de un campo eléctrico. Campo eléctrico E Voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación. E v Conductor de la corriente eléctrico Medio de separación Controla la carga eléctrica
  • 4. ELECTROFORESIS – EVOLUCIÓN HISTÓRICA REUSS (1809) describe el fenómeno Elektro = electricidad y phoresis = acción de llevar. TISELIUS (1930), Uso de Electroforesis en disolución libre en tubos verticales en forma de U MARTIN & EVERAERTS (1967) Electroforesis en tubos abiertos de vidrio y rellenos con hidroximetilcelulosa HJERTEN (1967) Electroforesis en tubos de 3.0 mm VIRTANEN (1969) Electroforesis en tubos de 200 y 500 μm JORGENSON (1981) Electroforesis Capilar. Columnas de 75 μm y utilización de elevados voltajes ACTUALIDAD
  • 5. Electroforesis  Técnica de separación basada en el movimiento de los analitos en un medio conductivo en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico.  El medio conductivo es generalmente una disolución tampón.  En ausencia de otros factores, las especies catiónicas migran hacia el cátodo (electrodo -) y las especies aniónicas migran hacia el ánodo (electrodo +).  La velocidad de migración es una relación directa entre el tamaño y la carga de cada especie.
  • 6. Electroforesis Dependiendo de la presencia o ausencia de soporte o medio de estabilización, podemos hacer dos claras divisiones en las Técnicas electroforéticas: Métodos en solución libre  La muestra se introduce en un tubo en forma de U el cual está rellenado de una disolución tampón.  No existe sistema de soporte o medio de estabilización.  Cuando se aplica el campo eléctrico las especies migran en función de su relación carga/masa.  Tiselius en 1948 recibió el Premio Nobel por la aplicación en la purificación de proteínas.
  • 7. Electroforesis Métodos con soporte o medio de estabilización  Presencia de un medio soporte como papel, gel o un material empaquetado.  La muestra es colocada físicamente sobre el soporte.  Existe una disolución que cubre totalmente el soporte o medio de estabilización.
  • 8. ELECTROFORESIS EN PAPEL El soporte utilizado en este caso es un papel  El papel está introducido en una disolución acuosa tamponada.  La muestra se sitúa en un punto determinado del soporte.  Un potencial de corriente continua (100-1000V) es generalmente aplicado durante la separación (las corrientes medidas suelen ser del orden de mA).  Las especies iónicas migran hacia puntos específicos del soporte.  Después de un tiempo apropiado para la separación el soporte es retirado y secado.  En caso de ser necesario, el papel es tratado con un agente colorante con el fin de observar las bandas de desplazamiento
  • 10. ELECTROCROMATOGRAFÍA EN PAPEL Es posible desarrollar una separación continua con una orientación adecuada del papel. Introduciendo la muestra en la parte superior, las fracciones pueden ser recogidas en la parte inferior.
  • 14. Inconvenientes de la electroforesis convencional Son técnicas lentas y laboriosas Tienen tendencia a ser poco reproducibles No permiten la automatización.
  • 15. Principios Electroforesis Capilar Movilidad electroforética νEP = µEp E µEp = q 6 πηr • Flujo electroosmótico
  • 16. TEORÍA DE ELECTROFORESIS CAPILAR Dos son los factores que causan la movilidad de los solutos: Movilidad Electroforética  Específica para cada soluto o analito.  Dependiente de la relación carga/tamaño.  Los cationes migran hacia el cátodo, los aniones al ánodo y los compuestos neutros no se ven afectados por el campo eléctrico. Flujo Electrosmótico  Movimiento general de todo lo existente en el interior del capilar como consecuencia del campo eléctrico aplicado.  Bajo condiciones normales, el movimiento global es hacia el cátodo.  Su componente de velocidad es mayor, en general, que las componentes electroforéticas de los solutos a separar.
  • 17. MOVILIDAD ELECTROSMÓTICA  Los cationes del tampón son atraídos hacia la pared del capilar, resultando la formación final de una doble capa de cationes.  La capa interna “capa fija”, está constituida por cationes fuertemente enlazados al capilar.  La capa externa “capa móvil”, es una capa con un enlace más débil.  Al aplicar el campo eléctrico, la capa móvil migra hacia el cátodo.  La disolución que rellena la columna es arrastrada por esta capa móvil en la dirección del cátodo.
  • 18. Fenómenos electrocinéticos: Movilidad electroforética Flujo electroforético Movilidad electroforética efectiva µe ELECTROMIGRACIÓN
  • 19. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS Capilar (donde se produce la separación) Sílice fundida
  • 20. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS Capilar con la pared cargada negativamente
  • 21. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS Se introduce el tampón de separación Las cargas (+) del tampón se unen a las (-) de la pared
  • 22. Fenómenos electrocinéticos: ELECTROOSMÓSIS Al aplicar campo eléctrico El resto de las cargas (+) se mueven hacia el polo (-) Se genera un flujo de tampón que arrastra todo lo que hay en el interior del capilar Movilidad electroosmótico µ eo ELECTROÓSMOSIS
  • 23. FENÓMENOS ELECTROCINÉTICOS Electroforético ± Electroósmosis Movilidad electroforética aparente µa
  • 24. Características EC Elevada eficacia, alcanzándose de 105 a 106 platos teóricos. Las separaciones pueden complementarse en periodos cortos de tiempo. La puesta a punto de métodos de análisis es simple y bastante rápida. El consumo de muestras y reactivos es mínimo y prácticamente no genera residuos. Es una técnica relativamente barata y de bajo impacto ambiental. Es una técnica muy adecuada para el análisis de muestras de pequeño tamaño, células vivas y ensayos de microdiálisis.
  • 25. Limitaciones de EC Relativa sensibilidad. Relativa reproducibilidad en análisis cuantitativo. Problemas a escala micropreparativa.
  • 26. Componentes básicos de un sistema de EC
  • 29. FUENTE DE ALTO VOLTAJE  La migración (separación) comienza una vez se aplica el campo eléctrico.  Cuando el campo eléctrico utilizado se elevado, se obtienen tiempos de análisis cortos, buenas separaciones y las mejores resoluciones.  Cuando se disminuye el tamaño del capilar, los voltajes aplicados pueden ser cada vez más altos. El máximo voltaje es de 40 kV.  Las corrientes son del orden de los microamperios.  Las fuentes permiten invertir la polaridad fácilmente.
  • 32. INTRODUCCIÓN DE MUESTRA Introducción básica de muestra  El capilar es inicialmente rellenado con una disolución tampón.  La muestra se introduce por uno de los extremos de la columna, el cual se ha sumergido en la disolución que contiene la muestra, provocando que la muestra se introduzca posteriormente en el capilar, de dos posibles formas:  Introducción hidrodinámica  Introducción electrocinética
  • 33. SISTEMAS DE DETECCIÓN Prácticamente los mismos que los utilizados en HPLC. Los más utilizados:  Absorción UV/vis: directa e indirecta  Fluorescencia: directa e indirecta  Fluorescencia inducida por Láser  Espectrometría de Masas  Amperométrica Los menos utilizados:  Conductividad  Potenciométrica  Índice de refracción  Radiométricos
  • 35. MODOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA LIBRE ISOTACOFORESIS ISOELECTROENFOQUE ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES O REDES POLIMÉRICAS CROMATOGRAFIA ELECTROCINÉTICA MICELAR
  • 36. 1. ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA  Capilar vacío  Separación en función q/m  Separa iones (+) y (-)  No partículas neutras No separa compuestos por Pm Problemas de ADSORCIÓN (capilar neutro)
  • 37. ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA La más simple de las técnicas  Un tubo capilar se rellena de una disolución tampón, la muestra es cargada en uno de los extremos del tubo capilar. Tras esto se coloca de nuevo la columna en sendos viales que contienen el mismo tampón y se aplica el campo eléctrico.  En condiciones normales, la muestra se sitúa en el ánodo, y los solutos migran hacia el cátodo.  Usualmente los cationes migran los primeros. Siendo los más rápidos los que tienen mayor carga y menor tamaño, y los últimos los de menor carga y gran tamaño.  Los elementos neutros aparecen englobados en una sola señal.  Los aniones, son los últimos. Su orden es el contrario al de los cationes
  • 40. VARIACIÓN DEL FLUJO ELECTROSMÓTICO Voltaje Aplicado: Su aumento provoca un aumento del flujo electrosmótico. El aumento indiscriminado produce Efecto Joule. Electroferogramas mostrando el efecto del voltaje aplicado sobre el tiempo de migración. El pico 5 no es mostrado a 10 kV. Tampón: 0.06M SDS, 0.06M borato sódico, pH 8.92 en 85% agua/15% metanol. Capilar de sílice, 75 μm d.i., 50 cm de longitud efectiva. Detector: UV a 214 nm. Temperatura 25ºC. Picos: 1. Niacinamida, 2. Cianocobalamina, 3. Clorhidrato de Piridoxina, 4. Niacina, y 5. Clorhidrato de tianamina
  • 41. ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA Efecto de la concentración del tampón de separación
  • 43. ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA El orden de elución puede invertirse tras la adicción de sales de alquilamonio. La “cabeza” polar de las sales de alquilamonio es atraida por las paredes de la columna. La parte no polar, “cola” de la sal forma una barrera hidrofóbica, a la que se une una nueva capa de moléculas de sal, generando un cambio en la carga de la pared de la columna. El resultado final es que la pared de la columna capilar tiene una carga final de tipo positivo.
  • 44. 2. ISOTACOFORESIS Electrolito frontal Electrolito terminal Formato “sandwich” analito  Pequeño margen de movilidades  Se utiliza como técnica de concentración de muestra.  Solutos orgánicos e inorgánicos de Pm ¯
  • 45. ISOTACOFORESIS CAPILAR  Electroforesis basada en desplazamiento a igual velocidad.  La muestra en el interior de la columna se rodea, en forma de sandwich, por un tampón líder y un tampón terminal.  Los cationes y los aniones no pueden ser separados en un solo análisis.  En condiciones normales el flujo electrosmótico es nulo. Los iones se mueven a la misma velocidad que los iones del tampón líder.  La señal obtenida es totalmente diferente al resto de los tipos de electroforesis capilar. La señal es en forma de escalera.
  • 46. 3. ISOELECTROENFOQUE Aplicación principal: análisis de proteínas Separación por puntos isoeléctricos Capilar neutro: no hay FEO Procedimiento: - Introducción de mezcla de anfolitos (diferente pH) - Preenfoque de los anfolitos (gradiente de pH) y separación - Presión
  • 47. ISOELECTROENFOQUE CAPILAR  La separación está basada en la diferencia entre puntos isoeléctricos.  Su principal aplicación es la separación de proteínas.  La columna se rellena de una disolución de anfolitos y la muestra, tras la aplicación del voltaje se genera un gradiente de pH en el interior de la columna capilar.  Una vez alcanzado el enfoque, las proteínas se sitúan en zonas de pH igual a su punto isoeléctrico, se produce el movimiento de toda la disolución hacia el detector. Se mantiene el voltaje de separación.
  • 48. EJEMPLOS CIEF Separación por CIEF de una mezcla estándar de proteínas Capìlar recubierto de poliacrilamida
  • 49. 4. ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES Separación basada en Pm Gel en el interior del capilar actúa como tamiz molecular
  • 50. ELECTROFORESIS CAPILAR DE GELES  Combinación de la electroforesis en geles con la instrumentación y principios de la Electroforesis Capilar.  La separación se basa en la diferencia de tamaños y cargas.  Para la misma relación carga/tamaño, la separación está basada únicamente en el tamaño.  La introducción de muestra, generalmente, es electrocinética.  Aplicada a la separación de grandes biomoléculas, como fragmentos de
  • 51. 4. ELECTROFORESIS CAPILAR EN GELES Problemas de los geles de poliacrilamida - resistencia - durabilidad - reproducibilidad - burbujas Sustitución por redes poliméricas - polímero disuelto en tampón - interacción entre moléculas de polímero formando red - se introduce en cada separación (reproducibilidad mayor) Aplicaciones principales proteínas, ADN, polisacáridos
  • 52. Ejemplos CGE Separación en escalera por CGE de 1 kbp utilizando un gel minimamente entrelazado de poliacrilamida Condiciones: Bis-poliacrilamida entrecruzada (3% T, 0.5% C), Tampón Tris- Borato 100 mM pH 8.3, E=250 V/cm, L= 40 cm, l= 30 cm, i.d.= 75 μm, λ= 260 nm
  • 53. 5. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA MICELAR  Separación de mezclas con partículas neutras  Incorporación de tensoactivos o surfactantes al tampón de separación con formación de micelas (CMC)  La separación se basa en la diferente afinidad de los analitos entre las micelas y el solvente
  • 54. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA CAPILAR MICELAR  Combina la separación cromatográfica y el movimiento por electroforesis capilar.  Capacidad de separar compuestos neutros.  Aditivos más comunes utilizados como fase semiestacionaria: surfactantes.  Orden de migración: compuestos hidrofílicos , menos hidrofóbicos, más hidrofóbicos.
  • 55. CROMATOGRAFÍA ELECTROCINÉTICA CAPILAR MICELAR  Puesto que las micelas están negativamente cargadas migrarán hacia el cátodo, a menos velocidad que los cationes.  Las especies neutras alcanzarán un equilibrio de partición entre las micelas y el tampón. Las especies neutras a ser separadas, deberán tener cierta solubilidad entre las micelas y la disolución tampón. Si no son solubles en ellas, se moverán como en CZE
  • 57. MEKC-CICLODEXTRINAS: EJEMPLOS SEPARACIÓN DE DNS-dl-AMINOÁCIDOS DNS-L-Glu, 2 DNS-D-Glu, 3 DNS-L-Ser, Condiciones: 4 DNS-D-Ser, Tampón: 100 mM Tris-250 mM 5 DNS-L-Leu, Borato pH 8.3 con 7 M urea. 6 DNS-D-Leu Gel: 5% T, 3.3.% C adicionado en el tampón a) Sin β-ciclodextrina b) Con 75 μM β-ciclodextrina Capilar: 150 mm x 75 μm Potencial: 400 V/cm Detección UV a 254 nm
  • 58. EJEMPLOS CEC Separación de esteroides Separación de drogas de características ácidas
  • 59. Modos de separación Acrónimo Principio de separación Electroforesis capilar en zona ECZ Carga/tamaño Cromatografía capilar Interacción hidrofóbica/iónica CCEM electrocinética micelar con micelas del surfactante Formación de complejos Electroforesis capilar quiral ECQ estereoespecíficos. Electroforesis capilar por Interacciones moleculares ECA afinidad entre ligandos y analito. Cromatografía capilar Mecanismos electroforéticos electrocinética micelar con CCEMM y reparto cromatográfico. microemulsiones Electroforesis capilar en gel ECG Tamaño molecular Isoelectroenfoque capilar IEEC Punto isoeléctrico Capacidad de migración entre Isotacoforesis capilar ITFC tampones de distinta naturaleza Movilidad en una solución Electrocromatografía capilar ECC libre y retención cromatográfica.
  • 60. Semejanzas entre EC y HPLC Ambas Técnicas utilizan sistemas de detección que recogen la señal respuesta frente el tiempo. Ambas emplean diferentes modos y existe un paralelismo entre los modos electroforéticos y los modos en HPLC. Ambos pueden ser automatizados.
  • 61. Diferencias entre EC y HPLC Capacidad para facilitar la separación de macromoléculas en disolución. Mayor eficacia. No hay correlación entre tiempos de retención y tiempos de migración. Volumen de fase móvil utilizado. La longitud del paso de luz en la celda de detección en HPLC es de mm y en EC es de µm La correlación del área en función del tiempo de migración es necesaria para llevar a cabo el análisis cuantitativa mediante la EC.
  • 62. Perfil de flujo en EC EC HPLC
  • 63. APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS CAPILARES  En general se cubre un amplio abanico de posibilidades gracias a los diferentes tipos de Electroforesis Capilar existentes  Compuestos cuya relación carga/tamaño sea diferente, separados por CZE.  Compuestos neutros con diferente hidrofobicidad, separados por MEKC.  Compuestos de tamaño diferente con la misma relación carga/tamaño, separados por CGE.  Biomoléculas de tamaño similar y similar relación carga/tamaño, con diferentes puntos isoeléctricos, separados por CIEF.
  • 64. MINIATURIZACIÓN DE SISTEMAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR
  • 65. MINIATURIZACIÓN DE SISTEMAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA EN UN μ-TAS DE ELECTROFORESIS CAPILAR CON DETECCIÓN UV Introducción electrocinética: 250 V entre B y C durante 30 s, Voltaje de separación 3 kV entre A y C Tampón Tris-Borato 50 mM de pH 8.5 Concentración de muestra 20 μM
  • 66. VARIACIÓN DEL FLUJO ELECTROSMÓTICO Modificaciones de la pared del capilar: Se puede disminuir, anular o invertir el flujo electrosmótico. Electroferograma mezcla de seis componentes: 1 Formiato, 2 Acetato, 3 Propanoato, 4 Butanoato, 5 Pentanoato, 6 Hexanoato. Voltaje: 20 kV. Columna de sílice 75 μm d.i., 40 cm de longitud efectiva, 42 de longitud total. Electrolito 10 mM MES/His a pH 5.9. (a) CZE normal, (b) CZE con polaridad invertida, (c ), igual que b pero tampón conteniendo 0.5 mM de TTAB (Bromuro de Tetradecil Trimetil Amonio). La concentración de todos los componentes es la misma (5.0x10-4 M9.