Resumen descriptivo de la técnica de liofilización para la preservación de microorganismos.

1. PRESERVACIÓN DE MICROORGANISMOS POR LIOFILIZACIÓN.
UNAM-EPIAM
Cinthia Samanda Anco Mena
ANTECEDENTES HISTORICOS
El proceso de liofilización tuvo su origen en el imperio Inca, alrededor del año 200 a.C., en la zona del altiplano andino a
4.000 msnm, el cual era utilizado para la fabricación del chuño (papa deshidratada) y charqui (carne de llama deshidratada);
posteriormente, los vikingos utilizaron este proceso para la conservación de pescado; con el fin de obtener comida hipercalórica,
ultraliviana e imputrescible para sus tropas militares (Santelices S. & Castro F., s.f.). Una referencia histórica más cercana a nuestros
tiempos fueron los primeros trabajos de Louis Pasteur y otros investigadores durante la segunda mitad del siglo XIX, intentando
realizar estudios metódicos de la naturaleza de material virulento, observaron la necesidad de innovar las técnicas de secado con el
fin de preservarlo sin destruirlo. También resultó claro que se necesitaban medios para hacer más lentas las reacciones químicas de
modo que pudieran ser estudiadas durante un período de tiempo o empleadas posteriormente bajo ciertas condiciones controladas
(Ramirez-Navas, 2007).
LIOFILIZACIÓN Y SU APLICACIÓN PARA PRESERVAR MICROORGANISMOS
Es un proceso de estabilización en el cual el material primero se congela y se concentran el solvente, comúnmente agua,
reduciéndolo mediante sublimación y desorción, de tal manera que no sostengan más el crecimiento biológico o las reacciones
químicas (Grauer, Grunberg, & Zardo, 2015). Algunas ventajas de la liofilización es que tiene un bajo costo de mantenimiento, el
microorganismo no necesita ser cultivado previo al despacho, en cuanto a la desventaja se debe mencionar que el equipo es muy
costoso y el proceso el lento y laborioso, y hay microorganismos que no toleran este procedimiento, por lo que la viabilidad no es
muy alta (Santelices S. & Castro F., s.f.).
EQUIPOS NECESARIOS
Liofilizador. - La deshidratación de una muestra por sublimación se realiza
en un liofilizador, equipo que puede tener múltiples configuraciones. Se
compone de cuatro partes fundamentales: la primera es una cámara de
secado, que por lo general se encuentra a temperatura ambiente, y es el lugar
donde se produce la sublimación del solvente contenido en la muestra
congelada, bajo condiciones de vacío. La segunda es un condensador, lugar
donde ocurre la condensación del vapor del solvente sublimado en la cámara
de secado, y corresponde a un recipiente de acero inoxidable que se
comunica con la cámara de secado y que, dependiendo de las
especificaciones del equipo, puede alcanzar una temperatura de -50 °C. La
tercera parte es un sensor de temperatura y presión que permite monitorear
estos parámetros en tiempo real. La cuarta parte, y sólo en el caso de un
liofilizador de bandejas, corresponde a una manivela ubicada en la parte
superior del equipo y que está conectada a un tornillo sinfín. La manivela permite bajar las bandejas superiores y sellar los viales
que se encuentran dentro del equipo.
Otros equipos requeridos. - Para preservar microorganismos por medio de
liofilización se requieren viales de vidrio de 2 mL, que necesitan de una tapa
de goma para cerrarlos (A). Posterior al proceso de liofilización, los viales
son sellados con una tapa metálica (B) para evitar la entrada de aire al
material biológico contenido dentro del vial, lo cual se realiza con un alicate
llamado crimpador manual de viales (C). Las muestras requieren ser
congeladas antes de introducirlas en el liofilizador, por lo que se requiere de
un congelador que alcance temperaturas de -20 °C (D). Se recomienda
utilizar para la rotulación de los tubos, etiquetas adhesivas con el número (o
código) correspondiente u otra información relevante (E).
ETAPAS DEL PROCESO DE LIOFILIZACION
A. Formulación. - Una de las consideraciones más importantes a la hora de liofilizar es la formulación, ya que la misma sin un
adecuado procedimiento de formulación da como resultado tasas de supervivencia muy bajas. La formulación es necesaria para
optimizar la eficiencia de la liofilización, la estabilidad, la seguridad y la fácil aplicación del producto y se define como la
combinación de las células con los ingredientes necesarios para formar una preparación adecuada y así obtener un producto seco
con las características deseadas (Asa, 2009).
Figura 1. Equipos para liofilización de cultivo microbiano
y partes que lo componen. Fuente: (Santelices S. &
Castro F., s.f.).
Figura 2 Insumos y equipos requeridos para el proceso de
liofilización. Fuente: (Santelices S. & Castro F., s.f.).

2. B. Proceso de Liofilización. - El procedimiento consiste principalmente en tres pasos: congelado, secado primario (sublimación),
y secado secundario (desorción), obteniendo así el producto seco final con el contenido de humedad deseado.
• Congelación. - Es considerado como el primer paso del proceso de liofilización y el desempeño de la misma depende
significativamente de esta etapa. El congelado permite la inmovilización de los componentes en solución, reduce la
desnaturalización del producto por calor en el secado y a la hora de aplicar el vacío previene la ebullición evitando así la
formación de espuma. Para facilitar el paso siguiente, el secado, es importante que se forme una estructura cristalina de
hielo en la muestra. La formación de esta estructura también establece el comportamiento durante la liofilización y la
morfología final de la muestra seca (Glyn N. & John G., 2007).
• secado primario. - El secado primario, sublimación, es el paso en el
cual se eleva la temperatura de la muestra congelada y se da la
migración del agua desde la misma (Diagnostics, 2015). Bajo
condiciones atmosféricas, al calentar el agua en estado líquido se
convierte en vapor, proceso conocido como evaporación. Sin
embargo, existe un punto, el punto triple (aproximadamente 0,00603
atm a 0°C) en el cual los tres estados del agua coexisten: hielo,
líquido y vapor. Por lo tanto, a presiones subatmosféricas el hielo
puede convertirse directamente en vapor mediante sublimación.
• secado secundario. - Durante el segundo secado o “desorción
isotérmica” la humedad residente ligada es removida para lograr una
estructura seca. El agua restante durante el secado secundario se
encuentra unida más fuertemente, lo que requiere más energía para
su eliminación (Glyn N. & John G., 2007). Al ser removida la
humedad residual, la muestra alcanza un estado estable. La
desorción es favorecida por el aumento de la temperatura bajo condiciones de vacío. Se debe mantener la temperatura por
debajo de la temperatura de colapso y de esta forma evitar la pérdida de la estructura de la muestra (Pramod, 2019).
C. Sellado. - Tras el secado secundario, los viales deben ser sellados al vacío para evitar la entrada de reactivos, gases atmosféricos
y aire húmedo que puedan desestabilizar o contaminar el producto.
D. Almacenamiento. - Una de las principales razones de liofilizar es mejorar la estabilidad a largo plazo de un producto durante el
almacenamiento. Sin embargo, un correcto proceso de liofilización no asegura una larga vida útil en condiciones ambientales. La
estabilidad del producto decrece durante el almacenamiento, y se alcanza mayor supervivencia cuanto menor sea la temperatura de
almacenamiento. Por lo tanto, los factores que hay que tener en cuenta para lograr un ambiente controlado son: temperatura, procesos
oxidativos, exposición a la luz y humedad relativa (Grauer, Grunberg, & Zardo, 2015).
CONCLUSIONES
La preservación de microorganismos es una tarea fundamental en una colección de cultivos microbianos. En ella se debe
asegurar que la viabilidad y pureza de los microorganismos sea mantenida durante décadas. Para cumplir con este objetivo existen
varias técnicas de preservación, siendo la liofilización un método que cumple con los requisitos exigidos por la Federación Mundial
de Colecciones de Cultivo (WFCC). Uno de los principios básicos de la liofilización es la interrupción del crecimiento microbiano,
donde prevalece la viabilidad y estabilidad genética del cultivo por un período prolongado.
BIBLIOGRAFÍA
Asa, S. (2009). A dry phase of life: Freeze-drying and storage stability of Lactobacillus coryniformis Si3 in sucrose-based formulations. Obtenido de
https://pub.epsilon.slu.se/2000/1/Schoug_a_20090507.pdf
Diagnostics, O. (2015). Bacteria Freeze Drying Protocol. Obtenido de https://opsdiagnostics.com/notes/ranpri/rpbacteriafdprotocol.htm
Glyn N., S., & John G., D. (2007). Cryopreservationand Freeze-Drying Protocols. Obtenido de
https://www.academia.edu/9542819/Cryopreservation_and_Freeze_Drying_Protocols
Grauer, A., Grunberg, K., & Zardo, S. (2015). Puesta a punto de un protocolo de Liofilización para la creacion de bancos Bacteriano. Obtenido de
https://dspace.ort.edu.uy/bitstream/handle/20.500.11968/3172/Material%20completo.pdf?sequence=-1&isAllowed=y
Pramod, K. (2019). LYOPHILIZATION: AN IMPORTANT FORMULATION TECHNIQUE. Obtenido de
https://pdfs.semanticscholar.org/23b0/112b2c22fe864426290ef701aff0454bb5b3.pdf?_ga=2.241305927.494780795.1652067611-
2142054704.1652067611
Ramirez-Navas, J. S. (2007). Liofilizacion de Alimentos. Obtenido de https://www.researchgate.net/publication/259620189_Liofilizacion_de_alimentos
Santelices S., C., & Castro F., J. (s.f.). Preservacion de Microorganismos por liofilización. Obtenido de
https://biblioteca.inia.cl/bitstream/handle/20.500.14001/6945/NR42412.pdf?sequence=11&isAllowed=y#:~:text=preservar%20microorganism
os,l%C3%ADquido%20(Figura%206.2.).
Figura 3.Etapas del proceso de liofilización: congelado,
secado primario y secundario. Fuente: (Grauer,
Grunberg, & Zardo, 2015).