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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN GENOMICO DE E. COLI.pdf

Ingeniería Genética: Extracción y purificación de ADN genómico de E. Coli.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN GENOMICO DE E. COLI.pdf

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UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL
“FABIOLA SALAZAR LEGUÍA” DE BAGUA
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS
CARRERA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA
CURSO:
INGENIERÍA GENÉTICA I
TEMA:
EXTRACCIÓN Y PURIFICACION DE DNA GENOMICO – E coli
DOCENTE:
Mg. ROMEL IVAN GUEVARA GUERRERO
ESTUDIANTES:
DARWIN EUCLIDES VALVERDE CALVO
CICLO ACADEMICO:
VII CICLO
Bagua, 02 de mayo del 2023.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA GENOMICO – E coli
OBJETIVO
El objetivo de esta práctica es que el alumno conozca los fundamentos de la extracción y
purificación de ADN genómico a partir de Escherichia coli y que sea capaz de describir y explicar
cada una de las etapas del protocolo.
INTRODUCCIÓN
Este laboratorio se centra principalmente en la extracción de ADN genómico de una célula
procariota. El ADN genómico se refiere a todo el ADN presente en la célula de un organismo.
Para llevar a cabo la extracción del ADN genómico utilizaremos técnicas moleculares, las cuales
se pueden utilizar para caracterizar, aislar y manipular componentes celulares. Algunos
ejemplos de estas técnicas moleculares son: Reacción en cadena de polimerasa (PCR),
Clonación, Geles de electroforesis y Southern Blot (Universidad de Puerto Rico, 2010, p. 1).
Extracción de ADN genómico
Uno de los métodos que nos ayudan en la identificación y diferenciación de bacterias es la
tinción gram. La misma nos permite determinar si una bacteria desconocida es gram positiva o
negativa. Una bacteria gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano, mientras que la
gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano seguida hacia el exterior por una
membrana externa. Esta pared y membrana protegen el interior de la célula, que es donde se
encuentra el ADN genómico. Para poder extraer el mismo, debemos utilizar agentes químicos
y/o físicos que debiliten la pared y membrana de la célula. Por ende, es importante conocer el
tipo de gram a la hora de realizar una extracción de ADN genómico, ya que debemos determinar
qué agentes utilizar para el rompimiento efectivo de la célula (Universidad de Puerto Rico, 2010,
p. 1-2).
MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales
1. Bacterias E coli
2. 3 unidades, Vaso de precipitado 250 ml
3. Micropipeta 10 – 100 𝜇𝑙
4. Hielo
5. Tubos eppendorf
6. Puntas desechables de micropipetas
Equipos
1. Centrifuga
2. Estufa
Soluciones
1. Isopropanol
2. Etanol al 80%
3. Agua bidestilada estéril.
4. Buffer 1, Buffer 2 y Buffer 3
Composición del buffer
• Buffer 1: Tris HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, Sucrosa 15% y lisozima 1mg/Ml
• Buffer 2: SDS al 1%
• Buffer 3: Acetato de sodio 3M pH 5.
NOTA:
1 unidad de absorbancia equivale a 50 ug de DNA
PRINCIPIO
El primer paso consiste en la lisis de las células cuyo DNA se desea purificar. Este paso se
realiza mediante un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura
celular se lleva a cabo en presenciade “conservantes”, que garantizan la integridad del DNA;
esto es, que impideno limitan la acción de las DNAsas presentes en las células o contaminantes
delmedio. El RNA presente se elimina mediante tratamiento con RNAsa. A continuación, se
eliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante precipitación salina (que
sustituye al tratamiento clásico con disolventes orgánicos tóxicos). Finalmente, el DNA
genómico se aísla medianteprecipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o en una
solución tamponada que puede contener “conservantes” del DNA (Dorado Pérez, 2018).
Aislamiento del ADN Genómico
Nota: Como es habitual, la manipulación del material biológico se debe realizar bajo las
oportunas condiciones de esterilidad, a fin de evitar contaminaciones o degradación de las
muestras.
3
Preparación de las muestras
Nota: el cultivo se obtiene inoculando una colonia previamente aislada en medio rico Luria–
Bertani (LB) sólido, en 10 ml de medio rico LB líquido. La agitación es importante para
incrementar la aireación del cultivo y así poder obtener las 0,5 a 1,5 x 109 células/ml típicos de
los cultivos estacionarios bacterianos.
PROTOCOLO
1. Se toma 1mL de caldo LB conteniendo bacterias E coli y se procede a trasferir a un
tubo eppendorf.
2. Se centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, descartar el sobrenadante.
3. Se añade al pellet 100 uL de buffer 1, se procede a homogenizar por agitación, llevar a
hielo 2 minutos, se procede a dejar reposar a temperatura ambiente por 8 minutos.
4. Agregar 100 uL de buffer 2, homogenizar, llevar a 37º por 5 minutos, homogenizar y
llevar a hielo por 10 minutos.
5. Se agrega 100 uL de buffer 3, homogenizar por inversión y regresar al hielo por 10
minutos.
6. Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos.
7. Se transfiere 250 uL del sobrenadante a un tubo eppendorf y se agrega 200 uL de
isopropanol, luego se mezcla por inversión, dejar 5 minutos a temperatura ambiente.
8. Centrifugar a 8000 rpm por 15 minutos.
9. Descartar el sobrenadante, lavar el pellet con etanol al 80% helado, centrifugar a 8000
por 5 minutos.
10. Descartar el sobrenadante, secar el pellet.
11. Redisolver el pellet con 50 uL de agua bidestilada estéril.
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  • 1. UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL “FABIOLA SALAZAR LEGUÍA” DE BAGUA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y APLICADAS CARRERA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA CURSO: INGENIERÍA GENÉTICA I TEMA: EXTRACCIÓN Y PURIFICACION DE DNA GENOMICO – E coli DOCENTE: Mg. ROMEL IVAN GUEVARA GUERRERO ESTUDIANTES: DARWIN EUCLIDES VALVERDE CALVO CICLO ACADEMICO: VII CICLO Bagua, 02 de mayo del 2023.
  • 2. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE DNA GENOMICO – E coli OBJETIVO El objetivo de esta práctica es que el alumno conozca los fundamentos de la extracción y purificación de ADN genómico a partir de Escherichia coli y que sea capaz de describir y explicar cada una de las etapas del protocolo. INTRODUCCIÓN Este laboratorio se centra principalmente en la extracción de ADN genómico de una célula procariota. El ADN genómico se refiere a todo el ADN presente en la célula de un organismo. Para llevar a cabo la extracción del ADN genómico utilizaremos técnicas moleculares, las cuales se pueden utilizar para caracterizar, aislar y manipular componentes celulares. Algunos ejemplos de estas técnicas moleculares son: Reacción en cadena de polimerasa (PCR), Clonación, Geles de electroforesis y Southern Blot (Universidad de Puerto Rico, 2010, p. 1). Extracción de ADN genómico Uno de los métodos que nos ayudan en la identificación y diferenciación de bacterias es la tinción gram. La misma nos permite determinar si una bacteria desconocida es gram positiva o negativa. Una bacteria gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano, mientras que la gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano seguida hacia el exterior por una membrana externa. Esta pared y membrana protegen el interior de la célula, que es donde se encuentra el ADN genómico. Para poder extraer el mismo, debemos utilizar agentes químicos y/o físicos que debiliten la pared y membrana de la célula. Por ende, es importante conocer el tipo de gram a la hora de realizar una extracción de ADN genómico, ya que debemos determinar qué agentes utilizar para el rompimiento efectivo de la célula (Universidad de Puerto Rico, 2010, p. 1-2). MATERIALES Y EQUIPOS Materiales 1. Bacterias E coli 2. 3 unidades, Vaso de precipitado 250 ml 3. Micropipeta 10 – 100 𝜇𝑙 4. Hielo 5. Tubos eppendorf 6. Puntas desechables de micropipetas Equipos 1. Centrifuga 2. Estufa
  • 3. Soluciones 1. Isopropanol 2. Etanol al 80% 3. Agua bidestilada estéril. 4. Buffer 1, Buffer 2 y Buffer 3 Composición del buffer • Buffer 1: Tris HCl 25 mM pH 8, EDTA 10 mM, Sucrosa 15% y lisozima 1mg/Ml • Buffer 2: SDS al 1% • Buffer 3: Acetato de sodio 3M pH 5. NOTA: 1 unidad de absorbancia equivale a 50 ug de DNA PRINCIPIO El primer paso consiste en la lisis de las células cuyo DNA se desea purificar. Este paso se realiza mediante un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Dicha rotura celular se lleva a cabo en presenciade “conservantes”, que garantizan la integridad del DNA; esto es, que impideno limitan la acción de las DNAsas presentes en las células o contaminantes delmedio. El RNA presente se elimina mediante tratamiento con RNAsa. A continuación, se eliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante precipitación salina (que sustituye al tratamiento clásico con disolventes orgánicos tóxicos). Finalmente, el DNA genómico se aísla medianteprecipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener “conservantes” del DNA (Dorado Pérez, 2018). Aislamiento del ADN Genómico Nota: Como es habitual, la manipulación del material biológico se debe realizar bajo las oportunas condiciones de esterilidad, a fin de evitar contaminaciones o degradación de las muestras. 3
  • 4. Preparación de las muestras Nota: el cultivo se obtiene inoculando una colonia previamente aislada en medio rico Luria– Bertani (LB) sólido, en 10 ml de medio rico LB líquido. La agitación es importante para incrementar la aireación del cultivo y así poder obtener las 0,5 a 1,5 x 109 células/ml típicos de los cultivos estacionarios bacterianos. PROTOCOLO 1. Se toma 1mL de caldo LB conteniendo bacterias E coli y se procede a trasferir a un tubo eppendorf. 2. Se centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, descartar el sobrenadante. 3. Se añade al pellet 100 uL de buffer 1, se procede a homogenizar por agitación, llevar a hielo 2 minutos, se procede a dejar reposar a temperatura ambiente por 8 minutos. 4. Agregar 100 uL de buffer 2, homogenizar, llevar a 37º por 5 minutos, homogenizar y llevar a hielo por 10 minutos.
  • 5. 5. Se agrega 100 uL de buffer 3, homogenizar por inversión y regresar al hielo por 10 minutos. 6. Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos. 7. Se transfiere 250 uL del sobrenadante a un tubo eppendorf y se agrega 200 uL de isopropanol, luego se mezcla por inversión, dejar 5 minutos a temperatura ambiente.
  • 6. 8. Centrifugar a 8000 rpm por 15 minutos. 9. Descartar el sobrenadante, lavar el pellet con etanol al 80% helado, centrifugar a 8000 por 5 minutos. 10. Descartar el sobrenadante, secar el pellet. 11. Redisolver el pellet con 50 uL de agua bidestilada estéril.
  • 7. 12. Se leyó cada ADN extraído en un espectrofotómetro Fluorescence, se evaluó la relación A260/A280 para determinar su pureza en cuanto a la cantidad de proteínas y sales contenidas. Para determinar la calidad del ADN extraído. Prendemos y aplastamos en la opción de DsDNA, pero de 1mm, luego nos saldrá los factores que serán usados en la prueba y nos pedirá que coloquemos el blanco, en este caso la muestra de DNA con la que vamos a trabajar. Procedemos a color el blanco en aparato tipo usb, para proceder hacer la lectura.
  • 8. RESULTADOS La evaluación de la pureza son las variables claves para definir el protocolo más confiable para la extracción de ácidos nucleicos. Los resultados obtenidos con cada método se resumen en la Tabla N.º 1. Tabla N.º 1. Cuantificación y medición A260/A280 del ADN obtenido a partir de las muestras Escherichia Coli Espectrofotometría Protocolo A260 Relación A260/A280 E. Coli 5,0 1,7 CONCLUSIONES El método evaluado mostro un buen comportamiento, se obtuvo una buena pureza (relación A260/A280 de 1,7). No obstante. El método de extracción por fenol-cloroformo es una alternativa más económica y sencilla en comparación con cualquier kit comercial. Además, se puede realizar en un menor tiempo, si se le compara con un cultivo microbiano convencional. El ADNextraído tiene la calidad óptima para ser aplicado a una metodología de PCR. Una comparación de diferentes métodos de cuantificación de ADN muestra la importancia de utilizar múltiples métodos para evaluar la cantidad y calidad del ADN genómico purificado. Cada método tiene su propia precisión y sensibilidad y debe seleccionarse cuidadosamente según el propósito del experimento y el tipo de muestra que se analizará. Es importante evaluar cuidadosamente los resultados de cada métodode cuantificación para asegurar la confiabilidad de los datos obtenidos.
  • 9. RECOMENDACIONES Las soluciones de DNA puro presentan una relación OD260 / OD280= 1,6–2,0. Valores menores de 1,6 son típicamente causados por contaminación proteica. Valores mayores de 2,0 generalmente se deben a contaminación con RNA. El kit empleado genera DNA de alta calidad, con una relación OD260 / OD280 > 1,7. Para mayor información sobre problemas con la calidad del DNA, rendimiento, etc, consultar el manual original del “Puregene DNA Isolation Kit”. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ❖ Dorado Pérez, G. (s/f de junio de 2018). Purificación y Análisis de ADN cromosómico bacteriano. Obtenido de Departamento de Bioquímica y Biología Molecular: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol- mol/pdfs/43%20PURIFICACION%20ANALISIS%20DNA%20BACTERIANO.pdf ❖ Universidad de Puerto Rico. (s/f de abril de 2010). Modulo I. Extracción de ADN genómico. Obtenido de biology.uprm.edu: http://biology.uprm.edu/files/modulo_i_extraccion_de_adn.pdf ❖ Palomino-Camargo C, González-Muñoz Y. Técnicas moleculares para la detección e identificación de patógenos en alimentos: Ventajas y limitaciones.Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2014;31(3):535–46. ❖ Fernandez A, García C, Saéz J, Valdezate S. Métodos de identificaciónbacteriana en el laboratorio de microbiología. In: Procedimientos enMicrobiología Clínica. 2010. p. 52. ❖ Tamagnini LM, Paraje MG. ¿Qué son las bacterias viables no cultivables? RevFac Ciencias exactsa, Físicas y Nat. 2015;2(2):2013–6. ❖ Rodriguez-Herrera R, Aguilar-Gonzalez C., Ayala-Labarrios L., Rocha-Revilla J., Padilla-García V, Espinosa-Hernández T. DETECCIÓN DEMICROORGANISMOS MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES. AQM Rev Divulg científica [Internet]. 2009;1(1). Available from: http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No. 1/AQMmicroorganismos.html Links ❖ https://docs.google.com/document/d/1lJva8K2Zzdr6B4XprVcxNtc1_9gShh7VrJysVg Cox34/edit#.