Microbiología

1. TOMA DE MUESTRAS Y LABORATORIO
EN INFECCIONES ORALES

2. TEMARIO: CONSIDERACIONES
 Infecciones asociadas : 
 Agentes asociados: 
 Metodología de búsqueda etiológica
 Identificación y susceptibilidad

3. INFECCIONES
 Manifestaciones orales de enfermedades sistémicas
 Locales:
 Caries
 Periodontitis
 Ulceras orales
 Candidiasis
 Actinomycosis
 Tuberculosis y otras

4. AGENTES
Dificil
identificación
 Porphyromonas gingivalis*
 Tannerella (Bacteroides) forsythia
 Aggregatibacter actinomycetencomitans*
 Streptococcus spp (hasta nivel especie)
 Etc etc

5. BACTERIAS - TINCION DE GRAM
POSITIVAS NEGATIVAS
COCACEAS BACILOS COCACEAS BACILOS
En racimo:
Staphylococcus sp
coagulasa: (+) S. aureus
(-) S. coag. neg.
S. saprophyticus
S. epidermidis
Tetradas:
Micrococcus sp
En pares o cadenas:
Enterococcus sp
Streptococcus
hemólisis: () S. pneumoniae
() S. viridans
() muchas
() S. pyogenes (A)
() S. agalactiae (B)
() S. grupo C (mitis)
() S. grupo D (bouis)
() S. grupo F
() S. grupo G
Otros:
Peptoestreptococcus
Peptococcus
Leuconostoc
Aerococcus
Lactococcus
Pediococcus
Difteromorfos:
Corynebacterium
Propionibacterium*
Grandes, con esporas:
Clostridium*
Bacillus
Ramificados:
Nocardia
Actinomyces*
Otros:
Listeria
Lactobacillus
Micobacterias
Diplococos:
Neisserias
Branhamella
Cocaceas anaer:
Veionellas*
Cocobacilos:
Acinetobacter
Kingella
Pasteurella
Brucella
Enterobacterias: Fermentan glucosa
Oxidasa -
L(+): E. coli
K. pneumoniae
Enterobacter sp
Citrobacter sp
L(-): Proteus sp
Providencia sp
Serratia sp Morganella sp
Salmonella** Shigella**
Yersinia**
No fermentadores:
Acinetobacter sp
Pseudomonas sp
Alcaligenes sp
Flavobacterium sp
Stenotrophomonas
Burkholderia sp
Fastidiosos:
Haemophilus sp
Aggregatibacter
Cardiobacterium
Eikenella
Kingella
Capnocytophaga
Bordetella
Fermentadores glucosa Oxidasa +
Vibrio**
Aeromonas**
Otros:
Bacteroides*
Fusobacterium*
Prevotella*
* Anaerobios
** Enteropatógenos
Medicina

6. EXÁMENES
 Generales :
 Hemograma
 Proteina C Reactiva/VHS
 Hemocultivos
 Locales:
 Gram /Cultivo tejido corriente/hongos
 Reacción polimerasa en cadena
Sospecha de infección
sistémica: derivar para
manejo conjunto con
infectologos

7. DILEMAS
Dificultades de carácter técnico :
1. Muestra no exenta de contaminación con fluido
oral y/u otro contaminante
2. Medios de cultivo óptimos para el desarrollo de
los verdaderos patógenos no siempre disponible
3. Identificación precisa de ellos limitada
1. Bioquímica tradicional
2. Bioquímica comercial (semi/automatizada)
3. PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
4. Determinación de susceptibilidad (no)
estandarizada para todos.
5. Susceptibilidad in vitro v/s biopelículas
Microbiología endodóntica:
últimos avances.
Rev. Estomatológica visión
dental Vol9 N°3 2006 Lima Peru.
Luis Chavez de Paz, U. de
Malmö, Suecia.

8. METODOLOGÍAS
1. Cultivo
 Ampliamente distribuido en laboratorios clínicos
 Identifica y apoya con determinación de susceptibilidad
 Tiempos de espera entre 48 a 96 hrs o más si se
incluyen anaerobios (7 días).
 Requiere conocimiento de microbiología oral para hacer
dgco apropiado… laboratorios de hospitales no
preparados para ello!
 Identificación limitada a métodos utilizados:
 Clásico (batería bioquímica): generalmente hasta género
en muchos patógenos orales
 Semi-automatizado: regular concordancia, requiere
confirmaciones (ej. galerías API)
 Automatizado: buena concordancia, algunas especies no
posible identificar

9. METODOLOGÍAS
2. Biología molecular
 Limitado a laboratorios especializados y algunos
adicionados a laboratorios clínicos de rutina
 Métodología que permite identificar la mayor diversidad
bacteriana en boca
 Métodos diversos a revisar:
 PCR tiempo real
 PCR multiple
 Identificación por ARNr16S
 Arrays

10. QUÉ ES LA BIOLOGÍA
MOLECULAR O PCR
El proceso de detección de un agente infeccioso por
amplificación genética se desarrolla de manera
habitual en tres etapas:
1° Extracción y purificación de los ácidos nucleicos
del microorganismo de la muestra biológica
2° Amplificación de un segmento seleccionado del
genoma del microorganismo mediante
reacción en cadena de la polimerasa, es decir,
la PCR propiamente dicha.
3° Detección de los fragmentos amplificados en la
PCR (amplicones) por electroforesis en gel de
agarosa o mediante hibridación con sondas
específicas. En general todo este proceso suele
durar aprox 24 h .

11. PCR TIEMPO REAL
Los procesos de amplificación y detección se producen de
manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin
necesidad de ninguna acción posterior.
Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la
amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada
momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la
reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado.
Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la
reacción de amplificación.
Al ser simultánea se acortan los tiempos. Promedio 50 minutos. ..
Puede ser múltiple además.

12. PCR MULTIPLE
Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en
un único tubo diferentes secuencias diana,
permitiendo la detección e identificación simultánea de
distintos genes de interés.
Usos en dgco de sindromes clínicos como neumonia
comunitaria, meningitis, etc.

13. ARRAYS
Los chips o arrays de ADN son una serie de sondas de ADN
unidas a un soporte sólido en una disposición regular y
prefijada.
El ácido nucleico diana que será detectado puede ser ADN o ARN
y previamente a la hibridación debe ser marcado con una
sustancia fluorescente o radiactiva.
La principal ventaja con respecto a PCR es que pueden
detectarse en un único procesamiento miles de genes.
 Investigación de la patogenia bacteriana
 análisis de la evolución bacteriana y epidemiología
 estudio de los mecanismos de acción y de resistencia de los
antibióticos
 diagnóstico microbiológico No disponible de las enfermedades infecciosas.
clinicamente

14. ANÁLISIS DEL ARN
RIBOSOMAL 16 S
Molécula muy antigua, presente en todas las bacterias
actuales.
Estructura y función constantes durante un tiempo muy
prolongado, de modo que las alteraciones en la
secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios .
El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500nt)
minimiza las fluctuaciones estadísticas.
Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr
16S existen bases de datos amplias, en continuo
crecimiento que se compara con lo obtenido
Directo de cultivo puro o de muestra tejido/fluido estéril.
Útil en no cultivables o emergentes.

15. LIMITACIONES BIOLOGÍA
MOLECULAR
 No disponible en laboratorios clínicos generales
 Identifica MO vivos y muertos
 No posible relacionar rol patógeno
 No reproducible en cultivo
 No permite determinación susceptibilidad
 Riesgos contaminación toma muestra y procesamiento
 Patógeno único? --- PCR múltiple? ---numerosas PCR?
 Identifica con mayor precisión y rapidez
 Permite cuantificar

16. PCR DISPONIBLES
Virus: herpes, enterovirus
papiloma
Bacterias diversas:
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
Actinomyces israelii
Bacteroides fragilis
Campylobacter rectus
Capnocytophaga spp.
Eikenella corrodens
Enterococcus spp.
Fusobacterium nucleatum
Fusobacterium spp.
Mycobacterium avium-intracellulare
Mycobacterium tuberculosis
Neisseria gonorrhoeae
Peptostreptococcus anaerobius
Peptostreptococcus micros
Porphyromonas gingivalis
Porphyromonas spp.
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella spp.
Streptococcus intermedius
Streptococcus mutans
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Treponema pallidum

17. TOMA DE MUESTRAS
 Preparación:
 Reunir material, realizar órdenes de exámenes,
etiquetar tubos.
 Higiene de manos y colocación de guantes
(precauciones estándar que puede incluir gafas y
mascarilla).
 4 manos

18. TOMA DE MUESTRAS
 Sitio exacto de la lesión
 No poner en contacto con antisépticos
 Rápido
 Idealmente aspirar abscesos cerrados por punción o
raspado, cureta (preferir por sobre hisopado) o trozo
tejido biópsico (sin preservantes).
 Previo a inicio de tto ATB (idealmente).
 Inocular en medio de transporte aerobio/anaerobio
 Transporte t° ambiente inmediato (excepto virus 4°C)

20. DERIVACIÓN SEGÚN AGENTE
BUSCADO

21. VIRUS: DETECCIÓN DIRECTA
detección elemento viral directamente desde la muestra
(fase aguda 5-7 días)
frotar con fuerza mucosa para desprender células infectadas con
hisopo. Conservación 4°C hasta 48 hrs o 7 días a -70°C.
 Microscopía óptica+tinción: visualización de él en células
humanas por técn.inmunológicas (IF), enzimas (ELISA) o
isótopos radiactivos (RIA). No disponible virus orales.
 Cultivo viral: cultivos celulares en forma de monocapas a partir
de tejidos animales o humanos. Detección viral se efectúa por
1. Efecto citopático o su neutralización con sueros con Ac
frente al virus sospechado.
2. Adición de Ac para detección mediante
inmunoflurorescencia (identifica Ag). Shell vial.
3. Biología molecular.

22. VIRUS
PCR para los virus
sospechados desde
muestra o cultivo viral
Disponible toda la
familia Herpes
VHS 1 y 2
VVZ
CMV
VEB
HHV-6 y 8
Echo
Coxsakie

23. Celulas no infectadas de
riñón de conejo
VHS-1
Celulas infectadas de
riñón de conejo

24. HONGOS
1. Cultivo hongos (toma y transp similar a bacterias)
 Filamentosos: lento crecimiento.
 Levaduriformes: rápido crecimiento, contaminantes/flora
v/s patógenos.
 Ojo con: dermatofitos, dimórficos como Histoplasma (no
forman parte de la rutina de laboratorios)
 Metodología:
 Siembra en agar sabouraud c/s CAF
 Morfología colonias, micromorfología.
 Levaduras: medios cromógenos, galerías identificación: API,
ID 32C; Sistemas automatizados: Vitek .
 Filamentosos: morfología colonia, tinción de colonia con
azul de lactofenol-

25. CHROMagar Candida.
C. albicans ATCC 90028 (arriba)
C. krusei ATCC 6258 (derecha)
C. glabrata (abajo),
C. tropicalis (abajo izq)
C. parapsilosis ATCC 90018 (arriba izq)

26. Candida krusei

27. BACTERIAS
1. Cultivo corriente:
 Siembra en medios sólidos enriquecidos y
diferenciales (ASC-ACH-MC) y caldos (tioglicolato).
 Adicionar anaerobios si lo solicitan y muestra no está
aireada.
 Identificación a nivel especie solicitada.
2. Antibiograma:
 La mayoría de los lab: difusión con disco, insuficiente
para estomatología.
 Requerido por tipo de patógenos orales: CIM dilución
o bien E test por difusión.

28. IDENTIFICACION
BACTERIANA
Identificación automatizada: sistema Vitek
 Alrededor de 94% identificación especies cocáceas
 Bajo nivel discriminación en alrededor 5%
 Menos 1% sin identificar
 Además incluye susceptibilidad con CIM
 Optimo para laboratorios clínicos no moleculares.

29. SUSCEPTIBILIDAD
BACTERIANA
1. Susceptibilidad por difusión en agar:
1. Con discos
2. E-test (CIM)
2. Susceptibilidad por dilución
1. En placa (agar)
2. En caldo (tubos)
3. Microdilución

30. SUSCEPTIBILIDAD
BACTERIANA
1. Susceptibilidad por difusión en agar:
1. Con discos
2. E-test (CIM)
2. Susceptibilidad por dilución
1. En placa (agar)
2. En caldo (tubos)
3. Microdilución

32. ANTIBIOGRAMA: NORMA
CLSI
1. ANAEROBIOS: CIM
1. Beta lactámicos sólos y en combinación
2. Lincosamidas (clindamicina)
3. Carbapenémicos
4. Quinolonas (moxifloxacino)
2. STREPTOCOCCUS no beta hemolíticos (CIM)
1. Penicilina
2. Cefalosporinas 3° gen
3. Lincosamidas (discos)
4. Quinolonas (discos)
3. Otros: de acuerdo a la rutina de laboratorio

33. CONCLUSIONES
 Diagnostico de laboratorio de infecciones
estomatológicas limitado a:
 Automatización y tecnologías del Laboratorio
 Conocimiento de patógenos orales de profesionales del
laboratorio
 Solicitud expresa de búsqueda de patógenos puntuales
por odontólogos
 Comunicación directa entre ellos oportuna
 Toma de muestra de buena calidad

34. Gracias