Metodi u dijagnostikovanju, eksperimentalnim i kliničkim istraživanjima dijabetes mellitus-a

1. Metodi u dijagnostikovanju, eksperimentalnim i
kliničkim istraživanjima dijabetes mellitus-a
Studijski istraživački rad 1
Univerzitet u Nišu
Prirodno-matematički fakultet
Departman za biologiju i ekologiju
Student: Mentor:
Dimitrije Spasić Prof. dr Perica Vasiljević
Br. indexa 512

2. Hormonska kontrola glukoze u krvi
 Hormonska kontrola glukoze u krvi u velikoj meri zavisi od
endokrinog pankreasa.
 Pankreas se sastoji od dva glavna tipa tkiva:
 Acinarnih ćelija
 Izlučuju digestivne sokove u duodenum
 Langerhans-ova ostrvca
 luče hormone koji regulišu glukozu u krvi:
 beta ćelije luče insulin - snižava koncentraciju glukoze u krvi
olakšavajući kretanje glukoze u telesna tkiva;
 alfa ćelije luče glukagon - održava nivo glukoze u krvi
povećanjem oslobađanja glukoze iz jetre u krv;
 delta ćelije luče somatostatin - inhibira oslobađanje insulina
i glukagona.

3. Insulin
 Insulin koji luče beta ćelije ulazi u portalnu cirkulaciju i putuje
direktno u jetru, gde se koristi ili razgrađuje približno 50%.
 Insulin, koji se brzo vezuje za periferna tkiva ili ga uništavaju jetra ili
bubrezi, ima poluvreme eliminacije od približno 15 minuta nakon što
se pusti u opštu cirkulaciju.

4. Dijabetes mellitus
 Dijabetes je poremećaj metabolizma ugljenih hidrata, proteina i
masti koji je rezultat neravnoteže između dostupnosti insulina i
potrebe za insulinom.
 Može predstavljati:
 absolutnu insulinsku rezistenciju,
 poremećeno lučenje insulina iz pankreasnih beta ćelija
 Neadekvatne ili defektne receptore insulina
 produkciju neaktivnog insulina ili insulina koji biva uništen pre
nego što uspe izvršiti svoju funkciju
 Osoba sa nekontrolisanim dijabetesom nije u stanju da transportuje
glukozu u masne i mišićne ćelije; usled toga ćelije tela izgladnjuju, a
razgradnja masti i proteina se povećava.

5. Klasifikacija
 I. Tip 1 (Uništavanje beta ćelija obično dovodi do apsolutnog
nedostatka insulina)
 A. Imunološki posredovani
 Autoimuno uništavanje beta ćelija
 B. Idiopatsko
 Nepoznati uzroci
 II. Tip 2
 Može se kretati od pretežno insulinske rezistencije sa relativnim
nedostatkom insulina do pretežno sekretornog defekta sa
insulinskom rezistencijom.

6. Bifazni odgovor insulina na stalni
stimulus glukoze
 Vrh prve faze kod
ljudi je 3 do 5
minuta;
 Druga faza počinje
u drugom minutu i
nastavlja da se
polako povećava
najmanje 60 minuta
ili dok stimulans ne
prestane.

7. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici

8. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici
 β-ćelije igraju ključnu ulogu u održavanju homeostaze glukoze, a disfunkcija β-ćelija
karakteristična je karakteristika mnogih stanja intolerancije na glukozu
 procena funkcije β -ćelija od fundamentalnog značaja u proučavanju metaboličkih
poremećaja, naročito dijabetesa mellitus-a
 Metodologija lučenja insulina in vivo
• Odgovor sekrecije insulina može se jednostavno odrediti iz koncentracije insulina,
ili iz nivoa C-peptida koristeći složenije metodologije
• Razlike u perifernom insulinu ne samo da mogu odražavati razlike u sekreciji
insulina, već i razlike u uklanjanju insulina
• koncentracija C-peptida preciznije odražava istinsko lučenje insulina pankreasa
 Karakteristike β-ćelijskog odgovora na stimulus
• povećanje sekretornog odgovora uglavnom se pripisuje hormonima izlučenim u
crevima koji se nazivaju inkretini, a posebno insulinotropnom peptidu zavisnom od
glukoze (GIP) i peptidu sličnom glukagonu-1 (GLP-1).

9. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici
 Ćelijski procesi odgovora na stimulus glukozom kod β-ćelija
• Molekularni aspekti sekrecije β-ćelija detaljno su razmatrani i dokazani nakon
uspešnih studijskih istraživanja
• Dokazana su dva puta, označena kao okidačka i pojačavačka
• Na putu pokretanja, glukoza aktivira egzocitozu povećanjem koncentracije
citosolnog kalcijuma kroz lanac događaja koji se završava otvaranjem kalcijumovih
kanala i prilivom ekstracelularnog kalcijuma.
• Putem pojačavanja, glukoza modulira lučenje insulina nezavisno od promena
koncentracije kalcijuma

10. Testovi funkcije b-ćelija
(oralni testovi-OGTT)
 Treba napraviti značajnu razliku između intravenoznih i oralnih testova funkcije β-
ćelija
 Unošenje glukoze stimuliše entero-insularnu osu, odnosno kompleksan hormonski
i nervni odgovor koji značajno pojačava lučenje insulina
 OGTT test se izvodi ujutru i to u nekoliko faza. Meri se koncentracija glukoze u krvi
u određenim vremenskim razmacima, nakon ispijanja rastvorene glukoze. U
vremenu: 0 min, 30, 60, 90 i 120 (180) min
 Oralni testovi daju sveobuhvatniju procenu funkcije β-ćelija, ali ne mogu razlikovati
unutrašnje defekte β-ćelija od defekata entero-insularne ose (npr. neispravna
proizvodnja GLP-1 ili oštećena neuronska stimulacija).
 Oralnim testovima se sekretorni stimulus (npr. koncentracija glukoze) ne može
standardizovati, pa procena funkcije β-ćelija zahteva odgovarajuće metode za
normalizaciju lučenja insulina na stimulus.

11. Testovi funkcije b-ćelija
(intravenozni testovi-IVGTT)
 IVGTT je tipičan test za prvu fazu lučenja insulina, iako je prisutna i druga faza
 Glukoza se intravenozno injektira i nivo glukoze u krvi se meri u prvih 5 minuta. U
poređenju sa OGTT-om, uzorak glukoze – obično je 50% rastvor glukoze - ne mora
da prolazi kroz digestivni sistem, a to omogućava veću osetljivost u testu.
 Koncentracije glukoze, insulina i često C-peptida se mere u čestim intervalima (12-
30 uzoraka) tokom 3-4 sata.
 Tipičan indeks sekrecije prve faze je akutni odgovor na insulin (AIR), odnosno
prosečna inkrementalna koncentracija insulina dobijena u prvih 5-10 minuta testa
 Lučenje druge faze insulina se izračunava pomoću empirijskih indeksa, obično
izračunatih iz područja ispod krive koncentracije insulina i glukoze

12. Stezaljka za hiperglikemijsku glukozu
 Hiperglikemijska stezaljka glukoze procenjuje lučenje insulina u prvoj i drugoj fazi
 Tehnika stezanja glukoze je metoda za kvantifikovanje sekrecije insulina i otpora
 Koristi se za merenje bilo koliko dobro pojedinac metabolizira glukozu ili koliko je
pojedinac osetljiv na insulin
 Hiperglikemijska stezaljka, koja zahteva održavanje visoke razine šećera u krvi
perfuzijom ili infuzijom glukoze, način je za kvantifikovanje brzine reakcije beta-
ćelija na glukozu.
 Koncentracija glukoze u plazmi akutno se povisuje na 125 mg / dl iznad bazalnog
nivoa kontinuiranom infuzijom glukoze
 Budući da se koncentracija glukoze u plazmi održava konstantnom, brzina infuzije
glukoze indeks je izlučivanja insulina i metabolizma glukoze
 Hiperglikemijske stezaljke često se koriste za procjenu sposobnosti lučenja insulina

13. Ostale metode za procenu funkcije β -ćelija
u kliničkim istraživanjima i dijagnostici
 Gradirani test infuzije glukoze
• mere se koncentracije glukoze i C-peptida i dekoncentracija izračunava lučenje
insulina
• srednje vrednosti sekrecije insulina na kraju svakog koraka su ucrtane u odnos sa
odgovarajućim srednjim nivoima glukoze, čime se dobija individualni odgovor na
dozu β-ćelija
• odgovor na dozu dobijen ovim testom je u vezi sa aktivacijom amplifikacionog puta
• gradirani infuzioni test ne procenjuje lučenje prve faze
 Arginin testovi
• injekcija arginina proizvodi veliki nalet sekrecije insulina za koji se smatra da
predstavlja oblik maksimalnog otpuštanja insulina u prvoj fazi
• sekretorni odgovor na arginin zavisi od preovlađujućih nivoa glukoze i obično je jači
od onog izazvanog injekcijom glukoze, kao što je to kod IVGTT-a.

14. Eksperimentalne metode
istraživanja dijabetesa

15. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
 Autoimuno uništavanje ćelija ostrvaca pankreasa
• metoda uključuje upotrebu nekog patogenog organizma koji može stimulisati
autoimunski odgovor na antigene tkiva pankreasa što dovodi do stvaranja antitela
protiv β-ćelija u kojima 70% životinja razvija dijabetes
• razvija primenom jedinstvenog virusnog proteina, virusnog gena (npr. virusa
encefalomiokarditisa, virusa pacova Kilhama) ili patogena na eksperimentalne
životinje (miševi, pacovi itd.) indukujući autoimune reakcije protiv β-ćelija
pankreasa, što dovodi do poremećene funkcije insulina
 Hirurški pristup eksperimentalnom istraživanju dijabetesa
• uklanjanje tkiva pankreasa (pankreatektomija) je veoma efikasno pri čemu 100%
životinja postiže dijabetes
• da bi se postigla hiperglikemija, laparotomijom je potrebno potpuno ili delimično
uklanjanje tkiva pankreasa
• Langerhansova ostrvca u pankreasu sadrže beta ćelije koje su odgovorne za sintezu
polipeptidnog hormona poznatog kao insulin, ključnog hormona za metabolizam
glukoze

16. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
 Transgeni genetski modifikovani životinjski model sa dijabetesom
• genetski životinjski model sa dijabetesom genetski je proizveden/modifikovan tako
da sa sniženom ekspresijom (nokautom) proteina (gena) odgovornog za
metabolizam ugljenih hidrata kako bi se dobili potomci miša sa održivim povišenim
nivoom glukoze u krvi
• životinje će razviti oslabljenu aktivnost β-ćelija pankreasa sa naknadnim
smanjenim lučenjem insulina i funkcionisanjem
 Terapija steroidima
• steroidi se koriste za izazivanje hiperglikemije smanjenjem osetljivosti insulinskih
receptora na insulin, a takođe mogu antagonizirati periferno delovanje insulina
dovodeći do izmenjenih imunoloških aktivnosti, povećane koncentracije glukoze u
plazmi i hiperglikemije
• ovaj model se koristi za istraživanje dijabetesa tipa 2 i metaboličkog sindroma.

17. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
 Dijeta sa visokim sadržajem šećera i visokim sadržajem masti
• hronična izloženost ishrani sa visokim sadržajem masti povezana je sa povećanjem
telesne težine i promenama u metaboličkim biomarkerima
• tranziatorno povećanje nivoa glukoze u krvi bez oštećenja pankreasa ili jetre
primećuje se uglavnom nakon osmonedeljnog izlaganja ovakvoj dijeti
• perzistentna hiperglikemija će dovesti do dijabetesa 2 tipa kod eksperimentalnih
životinja, poput primata
 Hemohromatoza terapijom gvožđem
• uključuje intraperitonealnu primenu feritnog nitrilotriacetata dnevno tokom 60 dana
• hiperglikemija se javlja kao rezultat upalnog oštećenja i blokade β-ćelija koje luče
insulin usled taloženja gvožđa na ostrvcima pankreasa, što dovodi do smanjenja
sekrecije i dejstva insulina.

18. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
 Spontane dijabetičke vrste/modeli
• posebna grupa životinjskih modela koja ima potencijal da bude gojazna i razvije
rezistenciju na insulin, zbog smanjene osetljivosti na insulin od strane svojih
receptora
• razvijene su iz selektivnog uzgoja tokom mnogih generacija loše tolerancije na
glukozu i osetljivosti na dijabetes tipa 1 i 2
• životinje pokazuju poremećenu toleranciju glukoze (IGT) i oslabljen test glukoze pre
jela (IFG) što se povezuje sa smanjenjem broja i veličine Langerhansovih ostrvaca
 Normalni životinjski model (normoglikemijska životinja)
• normalna zdrava normoglikemijska životinja koja se koristi u eksperimentu za
ispitivanje potencijalnog efekta supstance ili agensa na metabolizam glukoze

19. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
 Citotoksične hemikalije
• Aloksan
- selektivno inhibira sekreciju insulina izazvanu glukozom svojom specifičnom
inhibicijom glukokinaze kako bi blokirao fosforilaciju glukoze i sprečio oslobađanje
energije u ćelije ostrvaca
- aloksan je u stanju da indukuje stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika kroz ćelijski
metabolizam ksenobiotika redoks ciklusom sa dijaluričnom kiselinom u Fentonovoj
reakciji
• Streptozotocin
- koristi se za inhibiranje sekrecije insulina uništavajući β-ćelije ostrvaca Langerhans
pankreasa, dovodeći u stanje dijabetesa
- selektivno se akumulira u β-ćelijama pankreasa putem niskog afiniteta za vezivanje sa
transportorom glukoze GLUT2 u plazma membrani, a njegova toksičnost zavisi od
aktivnosti alkilacije DNK

20. Zaključak
 Najbitnije je da su dostupne metode u kliničkoj praksi za procenu funkcije β-ćelija
 Postojanje nekoliko pristupa u velikoj meri je diktirano činjenicom da je odgovor β-ćelija
složen i da nijedan test nije dovoljan za potpunu karakterizaciju funkcije β-ćelija
 Budući da svaka metoda ima svoja neizbežna ograničenja, izbor treba voditi kritičkim
ispitivanjem karakteristika testa u odnosu na potrebe i ograničenja istraživača
 Nova istraživanja takođe mogu utvrditi nove potencijalne farmakološke ciljeve ili reakcije
na simptome kod hipoglikemije
 Budući pravci će takođe uključivati istraživanje uloge inkretina u modulaciji
hipoglikemijskih odgovora
 Usavršavanjem istraživačkih metoda stvoriće se mogućnosti za dalja istraživanja u
relevantnoj oblasti studija dijabetesa i definitivno napraviti ogroman iskorak ka konačnom
rešenju ovog civilizacijskog problema

21. HVALA PUNO NA PAŽNJI!