More than Just Lines on a Map: Best Practices for U.S Bike Routes
Metodi u dijagnostikovanju, eksperimentalnim i kliničkim istraživanjima dijabetes mellitus-a.ppt
1. Metodi u dijagnostikovanju, eksperimentalnim i
kliničkim istraživanjima dijabetes mellitus-a
Studijski istraživački rad 1
Univerzitet u Nišu
Prirodno-matematički fakultet
Departman za biologiju i ekologiju
Student: Mentor:
Dimitrije Spasić Prof. dr Perica Vasiljević
Br. indexa 512
2. Hormonska kontrola glukoze u krvi
Hormonska kontrola glukoze u krvi u velikoj meri zavisi od
endokrinog pankreasa.
Pankreas se sastoji od dva glavna tipa tkiva:
Acinarnih ćelija
Izlučuju digestivne sokove u duodenum
Langerhans-ova ostrvca
luče hormone koji regulišu glukozu u krvi:
beta ćelije luče insulin - snižava koncentraciju glukoze u krvi
olakšavajući kretanje glukoze u telesna tkiva;
alfa ćelije luče glukagon - održava nivo glukoze u krvi
povećanjem oslobađanja glukoze iz jetre u krv;
delta ćelije luče somatostatin - inhibira oslobađanje insulina
i glukagona.
3. Insulin
Insulin koji luče beta ćelije ulazi u portalnu cirkulaciju i putuje
direktno u jetru, gde se koristi ili razgrađuje približno 50%.
Insulin, koji se brzo vezuje za periferna tkiva ili ga uništavaju jetra ili
bubrezi, ima poluvreme eliminacije od približno 15 minuta nakon što
se pusti u opštu cirkulaciju.
4. Dijabetes mellitus
Dijabetes je poremećaj metabolizma ugljenih hidrata, proteina i
masti koji je rezultat neravnoteže između dostupnosti insulina i
potrebe za insulinom.
Može predstavljati:
absolutnu insulinsku rezistenciju,
poremećeno lučenje insulina iz pankreasnih beta ćelija
Neadekvatne ili defektne receptore insulina
produkciju neaktivnog insulina ili insulina koji biva uništen pre
nego što uspe izvršiti svoju funkciju
Osoba sa nekontrolisanim dijabetesom nije u stanju da transportuje
glukozu u masne i mišićne ćelije; usled toga ćelije tela izgladnjuju, a
razgradnja masti i proteina se povećava.
5. Klasifikacija
I. Tip 1 (Uništavanje beta ćelija obično dovodi do apsolutnog
nedostatka insulina)
A. Imunološki posredovani
Autoimuno uništavanje beta ćelija
B. Idiopatsko
Nepoznati uzroci
II. Tip 2
Može se kretati od pretežno insulinske rezistencije sa relativnim
nedostatkom insulina do pretežno sekretornog defekta sa
insulinskom rezistencijom.
6. Bifazni odgovor insulina na stalni
stimulus glukoze
Vrh prve faze kod
ljudi je 3 do 5
minuta;
Druga faza počinje
u drugom minutu i
nastavlja da se
polako povećava
najmanje 60 minuta
ili dok stimulans ne
prestane.
7. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici
8. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici
β-ćelije igraju ključnu ulogu u održavanju homeostaze glukoze, a disfunkcija β-ćelija
karakteristična je karakteristika mnogih stanja intolerancije na glukozu
procena funkcije β -ćelija od fundamentalnog značaja u proučavanju metaboličkih
poremećaja, naročito dijabetesa mellitus-a
Metodologija lučenja insulina in vivo
• Odgovor sekrecije insulina može se jednostavno odrediti iz koncentracije insulina,
ili iz nivoa C-peptida koristeći složenije metodologije
• Razlike u perifernom insulinu ne samo da mogu odražavati razlike u sekreciji
insulina, već i razlike u uklanjanju insulina
• koncentracija C-peptida preciznije odražava istinsko lučenje insulina pankreasa
Karakteristike β-ćelijskog odgovora na stimulus
• povećanje sekretornog odgovora uglavnom se pripisuje hormonima izlučenim u
crevima koji se nazivaju inkretini, a posebno insulinotropnom peptidu zavisnom od
glukoze (GIP) i peptidu sličnom glukagonu-1 (GLP-1).
9. Metode za procenu funkcije β -ćelija u
kliničkim istraživanjima i dijagnostici
Ćelijski procesi odgovora na stimulus glukozom kod β-ćelija
• Molekularni aspekti sekrecije β-ćelija detaljno su razmatrani i dokazani nakon
uspešnih studijskih istraživanja
• Dokazana su dva puta, označena kao okidačka i pojačavačka
• Na putu pokretanja, glukoza aktivira egzocitozu povećanjem koncentracije
citosolnog kalcijuma kroz lanac događaja koji se završava otvaranjem kalcijumovih
kanala i prilivom ekstracelularnog kalcijuma.
• Putem pojačavanja, glukoza modulira lučenje insulina nezavisno od promena
koncentracije kalcijuma
10. Testovi funkcije b-ćelija
(oralni testovi-OGTT)
Treba napraviti značajnu razliku između intravenoznih i oralnih testova funkcije β-
ćelija
Unošenje glukoze stimuliše entero-insularnu osu, odnosno kompleksan hormonski
i nervni odgovor koji značajno pojačava lučenje insulina
OGTT test se izvodi ujutru i to u nekoliko faza. Meri se koncentracija glukoze u krvi
u određenim vremenskim razmacima, nakon ispijanja rastvorene glukoze. U
vremenu: 0 min, 30, 60, 90 i 120 (180) min
Oralni testovi daju sveobuhvatniju procenu funkcije β-ćelija, ali ne mogu razlikovati
unutrašnje defekte β-ćelija od defekata entero-insularne ose (npr. neispravna
proizvodnja GLP-1 ili oštećena neuronska stimulacija).
Oralnim testovima se sekretorni stimulus (npr. koncentracija glukoze) ne može
standardizovati, pa procena funkcije β-ćelija zahteva odgovarajuće metode za
normalizaciju lučenja insulina na stimulus.
11. Testovi funkcije b-ćelija
(intravenozni testovi-IVGTT)
IVGTT je tipičan test za prvu fazu lučenja insulina, iako je prisutna i druga faza
Glukoza se intravenozno injektira i nivo glukoze u krvi se meri u prvih 5 minuta. U
poređenju sa OGTT-om, uzorak glukoze – obično je 50% rastvor glukoze - ne mora
da prolazi kroz digestivni sistem, a to omogućava veću osetljivost u testu.
Koncentracije glukoze, insulina i često C-peptida se mere u čestim intervalima (12-
30 uzoraka) tokom 3-4 sata.
Tipičan indeks sekrecije prve faze je akutni odgovor na insulin (AIR), odnosno
prosečna inkrementalna koncentracija insulina dobijena u prvih 5-10 minuta testa
Lučenje druge faze insulina se izračunava pomoću empirijskih indeksa, obično
izračunatih iz područja ispod krive koncentracije insulina i glukoze
12. Stezaljka za hiperglikemijsku glukozu
Hiperglikemijska stezaljka glukoze procenjuje lučenje insulina u prvoj i drugoj fazi
Tehnika stezanja glukoze je metoda za kvantifikovanje sekrecije insulina i otpora
Koristi se za merenje bilo koliko dobro pojedinac metabolizira glukozu ili koliko je
pojedinac osetljiv na insulin
Hiperglikemijska stezaljka, koja zahteva održavanje visoke razine šećera u krvi
perfuzijom ili infuzijom glukoze, način je za kvantifikovanje brzine reakcije beta-
ćelija na glukozu.
Koncentracija glukoze u plazmi akutno se povisuje na 125 mg / dl iznad bazalnog
nivoa kontinuiranom infuzijom glukoze
Budući da se koncentracija glukoze u plazmi održava konstantnom, brzina infuzije
glukoze indeks je izlučivanja insulina i metabolizma glukoze
Hiperglikemijske stezaljke često se koriste za procjenu sposobnosti lučenja insulina
13. Ostale metode za procenu funkcije β -ćelija
u kliničkim istraživanjima i dijagnostici
Gradirani test infuzije glukoze
• mere se koncentracije glukoze i C-peptida i dekoncentracija izračunava lučenje
insulina
• srednje vrednosti sekrecije insulina na kraju svakog koraka su ucrtane u odnos sa
odgovarajućim srednjim nivoima glukoze, čime se dobija individualni odgovor na
dozu β-ćelija
• odgovor na dozu dobijen ovim testom je u vezi sa aktivacijom amplifikacionog puta
• gradirani infuzioni test ne procenjuje lučenje prve faze
Arginin testovi
• injekcija arginina proizvodi veliki nalet sekrecije insulina za koji se smatra da
predstavlja oblik maksimalnog otpuštanja insulina u prvoj fazi
• sekretorni odgovor na arginin zavisi od preovlađujućih nivoa glukoze i obično je jači
od onog izazvanog injekcijom glukoze, kao što je to kod IVGTT-a.
15. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
Autoimuno uništavanje ćelija ostrvaca pankreasa
• metoda uključuje upotrebu nekog patogenog organizma koji može stimulisati
autoimunski odgovor na antigene tkiva pankreasa što dovodi do stvaranja antitela
protiv β-ćelija u kojima 70% životinja razvija dijabetes
• razvija primenom jedinstvenog virusnog proteina, virusnog gena (npr. virusa
encefalomiokarditisa, virusa pacova Kilhama) ili patogena na eksperimentalne
životinje (miševi, pacovi itd.) indukujući autoimune reakcije protiv β-ćelija
pankreasa, što dovodi do poremećene funkcije insulina
Hirurški pristup eksperimentalnom istraživanju dijabetesa
• uklanjanje tkiva pankreasa (pankreatektomija) je veoma efikasno pri čemu 100%
životinja postiže dijabetes
• da bi se postigla hiperglikemija, laparotomijom je potrebno potpuno ili delimično
uklanjanje tkiva pankreasa
• Langerhansova ostrvca u pankreasu sadrže beta ćelije koje su odgovorne za sintezu
polipeptidnog hormona poznatog kao insulin, ključnog hormona za metabolizam
glukoze
16. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
Transgeni genetski modifikovani životinjski model sa dijabetesom
• genetski životinjski model sa dijabetesom genetski je proizveden/modifikovan tako
da sa sniženom ekspresijom (nokautom) proteina (gena) odgovornog za
metabolizam ugljenih hidrata kako bi se dobili potomci miša sa održivim povišenim
nivoom glukoze u krvi
• životinje će razviti oslabljenu aktivnost β-ćelija pankreasa sa naknadnim
smanjenim lučenjem insulina i funkcionisanjem
Terapija steroidima
• steroidi se koriste za izazivanje hiperglikemije smanjenjem osetljivosti insulinskih
receptora na insulin, a takođe mogu antagonizirati periferno delovanje insulina
dovodeći do izmenjenih imunoloških aktivnosti, povećane koncentracije glukoze u
plazmi i hiperglikemije
• ovaj model se koristi za istraživanje dijabetesa tipa 2 i metaboličkog sindroma.
17. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
Dijeta sa visokim sadržajem šećera i visokim sadržajem masti
• hronična izloženost ishrani sa visokim sadržajem masti povezana je sa povećanjem
telesne težine i promenama u metaboličkim biomarkerima
• tranziatorno povećanje nivoa glukoze u krvi bez oštećenja pankreasa ili jetre
primećuje se uglavnom nakon osmonedeljnog izlaganja ovakvoj dijeti
• perzistentna hiperglikemija će dovesti do dijabetesa 2 tipa kod eksperimentalnih
životinja, poput primata
Hemohromatoza terapijom gvožđem
• uključuje intraperitonealnu primenu feritnog nitrilotriacetata dnevno tokom 60 dana
• hiperglikemija se javlja kao rezultat upalnog oštećenja i blokade β-ćelija koje luče
insulin usled taloženja gvožđa na ostrvcima pankreasa, što dovodi do smanjenja
sekrecije i dejstva insulina.
18. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
Spontane dijabetičke vrste/modeli
• posebna grupa životinjskih modela koja ima potencijal da bude gojazna i razvije
rezistenciju na insulin, zbog smanjene osetljivosti na insulin od strane svojih
receptora
• razvijene su iz selektivnog uzgoja tokom mnogih generacija loše tolerancije na
glukozu i osetljivosti na dijabetes tipa 1 i 2
• životinje pokazuju poremećenu toleranciju glukoze (IGT) i oslabljen test glukoze pre
jela (IFG) što se povezuje sa smanjenjem broja i veličine Langerhansovih ostrvaca
Normalni životinjski model (normoglikemijska životinja)
• normalna zdrava normoglikemijska životinja koja se koristi u eksperimentu za
ispitivanje potencijalnog efekta supstance ili agensa na metabolizam glukoze
19. Eksperimentalne metode istraživanja
dijabetesa
Citotoksične hemikalije
• Aloksan
- selektivno inhibira sekreciju insulina izazvanu glukozom svojom specifičnom
inhibicijom glukokinaze kako bi blokirao fosforilaciju glukoze i sprečio oslobađanje
energije u ćelije ostrvaca
- aloksan je u stanju da indukuje stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika kroz ćelijski
metabolizam ksenobiotika redoks ciklusom sa dijaluričnom kiselinom u Fentonovoj
reakciji
• Streptozotocin
- koristi se za inhibiranje sekrecije insulina uništavajući β-ćelije ostrvaca Langerhans
pankreasa, dovodeći u stanje dijabetesa
- selektivno se akumulira u β-ćelijama pankreasa putem niskog afiniteta za vezivanje sa
transportorom glukoze GLUT2 u plazma membrani, a njegova toksičnost zavisi od
aktivnosti alkilacije DNK
20. Zaključak
Najbitnije je da su dostupne metode u kliničkoj praksi za procenu funkcije β-ćelija
Postojanje nekoliko pristupa u velikoj meri je diktirano činjenicom da je odgovor β-ćelija
složen i da nijedan test nije dovoljan za potpunu karakterizaciju funkcije β-ćelija
Budući da svaka metoda ima svoja neizbežna ograničenja, izbor treba voditi kritičkim
ispitivanjem karakteristika testa u odnosu na potrebe i ograničenja istraživača
Nova istraživanja takođe mogu utvrditi nove potencijalne farmakološke ciljeve ili reakcije
na simptome kod hipoglikemije
Budući pravci će takođe uključivati istraživanje uloge inkretina u modulaciji
hipoglikemijskih odgovora
Usavršavanjem istraživačkih metoda stvoriće se mogućnosti za dalja istraživanja u
relevantnoj oblasti studija dijabetesa i definitivno napraviti ogroman iskorak ka konačnom
rešenju ovog civilizacijskog problema