1. DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE
R.DALI YAHIA
FACULTÉ DE MÉDECINE D’ORAN
DÉPARTEMENT DE PHARMACIE
1

2. INTRODUCTION
• Le diagnostic bactériologique est un ensemble de moyens permettant de
confirmer une étiologie infectieuse d'origine bactérienne.
• 2 MOYENS:
 Diagnostic direct
• Mise en culture et identification; biologie moléculaire, techniques rapides
de recherche des antigènes ( IFD, agglutination,immunochromatographie).
 Diagnostic indirect
• Mise en évidence de la réponse de l'organisme à l'infection par la
présence d'anticorps spécifiques.
• Basée sur le principe de la spécificité de la réaction Ag-Ac
– Utilise Ag bactériens sous différentes formes
• Corps bactériens entiers (agglutination, IFI)
• Antigènes purifiés (ELISA, WB).
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3. INTRODUCTION
• Les progrès techniques en bactériologie médicale et particulièrement en
biologie moléculaire permettent actuellement un diagnostic direct par la
mise en évidence d'ADN bactérien.
• La biologie moléculaire est devenue le «gold standard» pour certaines
recherches telles que Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis.
• L'interprétation de la sérologie bactérienne est souvent délicate, devient
de plus en plus obsolète en dehors d’un contexte épidémiologique précis.
• Les valeurs prédictives positive et négative des tests dépendent de la
prévalence de la maladie : si la prévalence de la pathologie infectieuse est
faible, la valeur prédictive positive du test est basse et vis versa.
• une sérologie positive a peu de valeur si la prévalence de l'infection est
élevée puisque une grande partie de la population est positive.
• En dehors de contextes cliniques pour lesquels la culture conventionnelle
n'est pas réalisable ou délicate, la sérologie bactérienne n'est plus de mise
dans de nombreuses situations.
3

4. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RÉPONSE AC
• la réponse est hétérogène
• Les anticorps sont sécrétés par les plasmocytes, provenant de la maturation
de lymphocytes B qui ont fixé l'antigène grâce à des récepteurs de surface
spécifiques.
• La fixation seule est suffisante pour activer le lymphocyte
• Un agent infectieux ne constitue pas un antigène unique, c'est une
mosaïque de déterminants antigéniques (épitopes).
• Chaque déterminant antigénique est fixé par une famille de lymphocytes B
dont l'activation fait apparaître une famille d'anticorps : la réponse
immunitaire à l'infection est polyclonale.
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5. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA RÉPONSE AC
• la réponse évolue dans le temps
• Après une phase de latence : activation des lymphocytes B et maturation
des plasmocytes, les premiers anticorps produits sont des anticorps
appartenant à la classe des immunoglobulines M (IgM).
• Ces anticorps cèdent progressivement la place à des anticorps
appartenant à la classe des immunoglobulines G (IgG), qui sont produits
plus longtemps.
• Un second stimulus par le même antigène, déclenchera une réponse dite
secondaire, plus intense, rapide et ne produisant que des IgG (en général)
• Contrairement aux IgG, les IgM ne traversent pas la barrière placentaire.
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6. PARTICULARITÉS DE LA SÉROLOGIE EN BACTÉRIOLOGIE
• Structure antigénique bactérienne :
– Variable selon les conditions extérieures
• Réponse immunitaire complexe
– Proche d’une espèce à l’autre
• Appartenance à une même famille ou structures mal individualisées
• => Nombreuses réactions croisées
• => Problème de spécificité.

7. PARTICULARITÉS DE LA SÉROLOGIE EN BACTÉRIOLOGIE
• Nombreuses bactéries n’entraînent pas de réponse immunitaire
humorale détectable en cas d’infection locale
• Difficulté de dater l’infection
– Détermination de l’isotype d’Ig pas toujours contributive
• Présence d’IgM => infection récente?
– IgM résiduelles/persistantes, faux ⊕ (facteur rhumatoïde),
faux ⊝ (excès d’IgG)
• L’utilisation de 2 sérologies espacées dans le temps pas toujours
adaptée au contexte aigu
– Pas compatible avec délai de mise en route du traitement
antibiotique.

8. INDICATIONS
• Diagnostic de l’infection
– Bactéries suspectées difficilement isolables
T. pallidum, Chlamydia, Rickettsia, Leptospira, Borrelia...
• Présentes en trop faible quantité
• Infection décapitée par un traitement antibiotique précoce
• Bactéries de croissance difficile ou impossible
• Prélèvements trop invasifs
• Diagnostic rétrospectif d’une infection guérie
• Diagnostic des complications immunologiques
– Affections rhumatologiques ou neurologiques
• Syndrome de Guillain-Barré, polynévrites, neurosyphilis….

9. INDICATIONS
• Suivi thérapeutique
– Appréciation de l’évolution du titre en AC
• Apprécier l’efficacité d’une vaccination
– Confrontation aux seuils protecteurs préalablement déterminés
• Enquêtes épidémiologiques
– Evaluation de l’état immunitaire d’une population
– Étude de la séroprévalence d’une infection donnée dans une
population.

10. PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION
• +++ Sang
– 5 à 10 mL de sang veineux
– Tube sec (sans anticoagulant)
• Interférence des anticoagulants
• Plus rarement : LCR, humeur aqueuse.
• Analyse comparative de deux échantillons espacés de 10 à 20 j
– Mettre en évidence une montée du titre des AC
– Réexaminer le sérum antérieur si discordance.
• Conservation des sérums (et autres liquides biologiques)
– Congélation (< -20 °C) d’une aliquote de l’échantillon.
– Durée de conservation selon les capacités du laboratoire.

11. PRINCIPE
• Basé sur les conséquences induites chez l'hôte par l’infection
Production d'anticorps
• Il existe différentes techniques qui reposent toutes sur le même principe :
mise en évidence d’un complexe immun antigène-anticorps
• Il peut être qualitatif, semi quantitatif ou quantitatif.
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12. PRINCIPE
• Des antigènes de la bactéries sont fixés à un support
• le support varie en fonction de la technique ( tube, cupule de microplaque…)
• Si le patient est immunisé, ses anticorps se fixent sur les antigènes
• Les antigènes sont mis en présence du sérum du patient ( anticorps spécifiques?)
• Ils sont mis en évidence par des anticorps anti-IgG ou anti-IgM
Selon la technique utilisée:
 agglutinent les particules : agglutination ou hémagglutination (HA)
 sont marqués par fluorescence : IFI
 sont marqués par une enzyme qui produira une coloration : ELISA
 Fixation du complément (FC)
 Immuno-Blots (IB) ou Western-Blots (WB)
Formation d’un complexe immun = révélation de la réaction antigène-anticorps.
12

13. 13

14. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
• Dialogue clinico-biologique +++
• Sérologie envisagée dans un contexte précis
– Réactions croisées: Wright et Yersinia pseudotuberculosis ou vibrio cholereae.
– Délai d’apparition des AC (8 à 10 jours), pic à 21 jours
– Cinétique des AC
– Persistance des AC au long cours (+++ IgM)
– IgG subsistent pendant plusieurs mois voire années
– La sensibilité et spécificité varient selon le type de technique utilisée:
agglutination, immunofluorescence indirecte ou ELISA…
• Sensible: dépistage
• Spécifique: confirmation
– Cibler la population selon une orientation clinico-épidémiologique (VPP, VPN et
séroprévalence).
– État immunologique du patient
• Immunodéficience, vaccination.

15. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
• Résultats
– Qualitative : +/-
– Quantitative : Titre d’AC
• Taux sérologique d’AC = plus forte dilution d’un sérum donnant une
réaction positive
• Titre d’un sérum = inverse du taux sérologique.
• Éléments sérologiques en faveur d’une infection :
– Séroconversion = apparition d’AC spécifiques
– Élévation significative (x4) du titre des AC dans le 2ème sérum
• Titre identique => infection ancienne.

16. 16
PRINCIPES DES PRINCIPALES
RÉACTIONS

17. RÉACTION D’AGGLUTINATION
• Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé à la surface d’une
particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron.
• C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag
portés par des particules formant ainsi des ponts spécifiques entre ces
particules permettant leur réunion en amas.
17

18.  Agglutination active
• Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag
appartenant à la particule.
• Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame
• Peut être qualitative ou quantitative (la dernière dilution du sérum où l’on
observe encore une agglutination).
18
RÉACTION D’AGGLUTINATION

19.  Agglutination indirecte
• Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant normalement
partie intégrante de la particule, en faisant appel à un artifice
 Ajout au mélange réactionnel de macromolécules qui pontent les Ac
exemple: le Dextran
 Utilisation Ac anti AC.
19
RÉACTION D’AGGLUTINATION

20.  Agglutination passive
• Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble , mais rendu
particulaire par fixation sur un support:
 Les billes de latex
 Les hématies.
20
RÉACTION D’AGGLUTINATION

21. 21
IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

22. 22
Différentes étapes de la réalisation d’une technique d’immunofluorescence
indirecte sont:
- Fixation de l’antigène sur la lame (certaines lames sont commercialisées avec
l’antigène déjà fixé)
- Dépôt du sérum du patient et incubation
- Lavage
- Ajout des anticorps anti-immunoglobulines humaines marqués par le
fluorochrome (fluoresceine, acridine…)
- Lavage
- Lecture dans une chambre noire à l’aide d’un microscope à fluorescence.
IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

23. 23

24. 24
ELISA

25. • La technique ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois,
Peter Perlmann et Eva Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.
Principe
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de
détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée
produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.
Avantages de la technique
L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
• Possibilité de quantifier
• L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
• Facile à réaliser
• La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisés.
• Applicable actuellement à la majorité des sérodiagnostics.
Inconvénients de la technique
• La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de la
lumière.
25
ELISA

26. Le test ELISA indirect
• permet de détecter ou doser des anticorps.
• il se réalise en 4 étapes:
 Le "coating" de l'antigène:
- Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique
de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se
fait électro statiquement.
- Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit.
- Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du
tampon de lavage.
- Commercialisées prêtes à l’emploi ou possibilité de préparation au
laboratoire( techniques maison).
26
ELISA

27.  La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
- On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant
environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur
l'antigène.
- Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès
avec du tampon de lavage.
27
ELISA

28.  La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
- On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection
pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se
fixent spécifiquement sur les anticorps à doser.
- Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en
excès avec du tampon de lavage.
- Les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son
substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grâce à
l'apparition d'une coloration.
 La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
- On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes,
une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme.
- L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de
l'anticorps à doser.
L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc
à la concentration d'anticorps recherché.
28
ELISA

29. LES DIFFÉRENTES GÉNÉRATIONS ELISA
Les tests ELISA de 1ère génération
• ils reposaient sur l’utilisation de lysats viraux comme antigènes, préparés à partir de cultures
virales issues de cellules T humaines, à l’origine de possibles réactions croisées
Les tests ELISA de 2ème génération
• les lysats ont été remplacés par des peptides synthétiques ou des protéines recombinantes,
ce qui a permis d’améliorer la sensibilité et la spécificité de ces tests.
Les tests ELISA de 3ème génération
• ils reposent sur l’utilisation de protéines recombinantes ou synthétiques encore plus
spécifiques . Ils détectent toutes les classes d’immunoglobulines, y compris les IgM.
Les tests ELISA de 4ème génération ou tests combinés
• Ils ont été conçus pour détecter les anticorps et l’antigène de façon simultanée, améliorant
ainsi la sensibilité au cours de la phase de séroconversion
• Application en virologie ++++.
29

30. ELISA Sandwich
30
L'anticorps à doser est pris en "sandwich" entre l'antigène et un anticorps
anti-anticorps marqué.

31. ELISA compétition
31
Dosage d'un anticorps (ELISA compétition)

32. AG - Support Révélation - Lecture Avantages Inconvénients
IFI AG fixés sur une
lame
Fluorescence (excitation
dans l’UV) lue au
microscope
Technique de référence
des intracellulaires
Non automatisable,
personnel qualifié
ELISA AG fixés sur un
support solide
(plaque)
Immuno-enzymatique
(spectro)
Automatisable, très
sensible
Faux ⊕ (facteur
rhumatoïde) et faux
⊝ (excès IgG)
Chimi-
luminescence
Microparticules
paramagnétiques
recouvertes d’AG
Chimiluminescence
(marqueur = acridinium)
Automatisable, rapidité de
la réaction, très sensible
et spécifique
Fixation du
complément
AG en milieu liquide Visuelle (hémolyse
macroscopique)
Robuste, assez spécifique Difficile à standardiser,
manque de sensibilité
Agglutination
passive
Particules (latex ou
GR) sensibilisées
par AG
Visuelle (agglutination
macroscopique)
Simple et rapide Lecteur dépendant,
Phénomène de zone,
peu spécifique, peu
sensible
Immuno-
Empreinte
Protéines de l’AG
sur 1 bandelette de
nitrocellulose
Immuno-enzymatique
(+++)
Distingue plusieurs cibles
antigéniques, très
spécifique, automatisable
Moins sensible
qu’ELISA

33. PRINCIPALES SÉROLOGIES BACTÉRIENNES
• Brucellose:
 agglutination en tubes (Wright)
 Agglutination sur lame: antigène tamponné ou Rose Bengale
• Legionellose
 IFI, ELISA
• Maladie de Lyme
 IFI, ELISA, Western-blot
• Leptospirose
 Agglutination, Martin et Petti
• Syphilis
 TPHA, FTA, TPI, ELISA
• Rickettsioses – Coxiella
 IFI, ELISA
• Mycoplasmes
 ELISA
• Chlamydia
 ELISA
33

34. PRINCIPALES SÉROLOGIES BACTÉRIENNES
• Salmonelloses
 Agglutination Widal-Félix
• Streptocoques du groupe A
• anti-streptolysines O (ASLO)
• anti-strepdornases
• anti-streptokinases
• Yersiniose à Yersinia enterocolitica
 Agglutination
• Listeriose
 ELISA
34

35. PERTINENCE DES RECHERCHES DE SÉROLOGIES
BACTÉRIENNES

36. PERTINENCE DES RECHERCHES DE SÉROLOGIES
BACTÉRIENNES
SEROLOGIES (Grade A) SEROLOGIES (Grade C) SEROLOGIES INUTILES
Bartonella spp. Campylobacter (arthrite, GB) Bordetella pertussis
Brucella spp. Chlamydia trachomatis Haemophilus spp.
Borrelia spp. (confirmation WB) Chlamydia psittaci Klebsiella spp.
Coxiella burnetii Chlamydophila pneumoniae Listeria
Francisella spp. Corynebacterium diphtheriae Mycoplasmes génitaux
Helicobacter pylori (enfant) Clostridium tetani Neisseria gonorrhoeae
Legionella spp. Helicobacter pylori (adulte) Pasteurella spp.
Leptospira spp. S. pneumoniae (explo immunitaire) Shigella spp.
Rickettsies Mycoplasma pneumoniae Staphylocoques
Treponema pallidum Salmonella spp. Streptocoques (ASLO, ASDor)
Yersinia spp. (arthrite, GB) Mycobactéries
P. aeruginosa (mucoviscidose)

37. SÉROLOGIES PERTINENTES
37

38. • Brucellose : maladie à DO
• Clinique : fièvre ondulante sudoro-algique, atteinte ostéo-articulaire
• Diagnostic direct gold standard
– Culture (P3) (sensibilité 80% en phase aigue, diminue rapidement)
• Sérologie
– Indications : infections subaiguës et chroniques, bilan des fièvres au
long cours et EI à hémocultures négatives
– Combinaison de tests sérologiques.
DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE

39. – Agglutination directe : Tests de criblage
• Brucellose aigue ou subaigue
• Wright : IgM
– Seule technique standardisée
– Négative en phase chronique
• Rose Bengale : IgM et IgG
– IFI
• Brucellose chronique ou ancienne avec Wright - et Rose
Bengale +/-
• Confirmation par LNR ( Institut Pasteur Dely Brahim Alger).
DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE

40. DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE
sérodiagnostic de Wright
 Méthode de référence recommandée par l’OMS
 elle fait appel à une suspension de germes tués
 Les agglutinines apparaissent dès le 10e jour de la maladie (IgM,
IgG)
 décroissance jusqu'au 5-8e mois d'évolution.
 L'intérêt de cette technique se situe au stade de la brucellose aiguë
et sub-aiguë.
 Un titre positif correspond à une agglutination complète au 1/80e
(120 UI).
 Si doute ( titre faible), une autre sérologie sera prescrite 1 à 2
semaines plus tard.
40

41. DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE
41

42. 42
Anticorps bloquants
• Ajouter une goutte d'immunsérum anti-Brucella après 24 h d'incubation à
37°C aux trois premières dilutions.
• Une seconde lecture est effectuée après une nouvelle incubation de 24 h
à 37°C.
• L’absence d’agglutination traduit la présence d’Ac bloquants dans le
sérum testé.
DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE

43. DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE
Epreuve à l'antigène tamponné (EAT)= test au rose Bengale.
• Il s'agit d'une variante d'agglutination rapide sur lame avec le
sérum non dilué.
• L'interprétation est similaire à celle de l'agglutination lente en tubes
mais la cinétique des anticorps est décalée (IgG détectés) et plus
longue que celle du sérodiagnostic de Wright.
• Intérêt dans la brucellose chronique.
• Elle est également très utile pour le dépistage et les enquêtes
épidémiologiques.
43

44. DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE
44

45. • Immunofluorescence indirecte (IFI) ou
Immuno-enzymatique (ELISA): mettent en
évidence les IgG et les IgM.
• Elle sont positives dans les formes chroniques
et subaigues.
45
DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE LA BRUCELLOSE

46. Coxiella burnetii
• Clinique: sd pseudo grippal, pneumonie atypique, fièvre Q, EI
• Diagnostic direct
– Culture cellulaire (P3)
– PCR
• Sang, échantillons de valves cardiaques
• Sérologie = outil de 1ère ligne
– Indication : bilan des fièvres au long cours et EI à hémocultures négatives
– Technique : IFI (référence)
• AG « maison » semi-purifiés, obtenus par culture cellulaire
• Dépistage qualitatif
• Si ⊕ : titrage.

47. Coxiella burnetii
– Test ELISA
– Se < celle de l’IFI pour fièvre Q aiguë
• intérêt : dépistage de masse
• Interprétation
– Détection de titres élevés d’AC
• Anti-phase II => infection récente ou aiguë
• Anti-phase I + anti-phase II => évolution chronique (endocardite)
– Persistance des AC plusieurs années (voire « à vie » pour fièvre Q chronique)
– Apparition tardive des AC en 2 à 3 semaines
• Intérêt de la PCR pendant les 2 premières semaines de la maladie +++
• Mais PCR se ⊝ lorsque AC (IgM anti-phase II) apparaissent.

48. Rickettsies
• Clinique : Fièvre boutonneuse, typhus des broussailles,
typhus exanthématique
• Diagnostic direct (P3)
– Culture cellulaire
– PCR
• Sérologie
– IFI : méthode de référence
• Ag obtenus à partir de culture cellulaire
• détection concomittante des IgG et IgM anti R.conorii et R.rickettsi
– Criblage sur 2 dilutions
– Titrage des sérums +
• IgG et IgM anti R.typhi.

49. Bartonella spp.
• Clinique : maladie des griffes du chat, péliose hépatique et angiomatose
bacillaire
• Diagnostic direct (P3)
– Culture difficile et lente, pour Bartonella quintana
– PCR
• Sérologie
– Indications : bilan des fièvres au long cours et EI à hémocultures négatives
– IFI : méthode de référence
• Ag semi-purifiés obtenus à partir de culture cellulaire
• Détection concomitante des Ac anti B.henselae et B.quintana
• Criblage sur 2 dilutions
• Titrage des sérums + (Titres très élevés en cas d’EI)
• Réactions croisées avec Chlamydia spp et Coxiella spp.

50. Francisella spp.
• Maladie DO
• Clinique : Tularémie
• Diagnostic direct
– Culture (P3) (Se = 10% en phase aigue)
– PCR (Se = 90% en phase aigue)
• Sérologie
– Mal standardisée
– ELISA peu utilisé  mal standardisée
– Micro-agglutination
• Seuil : 1/160
• Réactions croisées avec Brucella, Yersinia enterocolitica O:9.

51. Leptospira spp.
• Clinique : syndrome pseudo-grippal, atteinte neuro-méningée,
atteinte pulmonaire
• Diagnostic direct
– Culture : long, incubation 2 mois
– PCR
• Sérologie à partir du 8ème jr
 Réaction d’agglutination sur lame.
 ELISA : détection IgM
• Ag coatés de Leptospira biflexa qui possède des épitopes
communs à tous les sérovars pathogènes.

52. Leptospira spp.
 Microagglutination directe (MAT) : réaction d'agglutination lyse de
Martin et Pettit)
• Méthode de référence
• Mise en présence du sérum à tester avec une culture de
Leptospires, évaluation au microscope à fond noir du degré
d’agglutination des cultures
• Titrage
• Seul test permettant l’identification du sérogroupe
• Titre seuil: 1/100.
• Persistance de taux résiduels plusieurs années
• Réalisée dans les laboratoires de référence seulement.

53. Legionella spp.
• Maladie à DO
• Clinique : pneumopathie
• Diagnostic direct :
– Culture
– PCR
• Sérologie
– IFI : méthode de référence
– ELISA
– Doit être réalisée si antigénurie négative associée à une forte
suspicion de légionellose.

54. Borrelia burgdorferi
• Clinique : maladie de Lyme
• Diagnostic direct :
– Culture
• Bactéries à croissance lente
– PCR
• Indications de la sérologie : phase disséminée ou chronique
– Manque de sensibilité au stade initial de l’infection
– Dépistage ELISA :
• Résultat douteux en IgM à contrôler sur un nouveau prélèvement
– Confirmation par BLOT
• Neuroborréliose : synthèse intrathécale d’IgG anti B.burgdorferi
– Prélèvements sang et LCR : taux rapporté aux Ig du sang
( différence entre passage passif et production locale d’Ac).

55. Treponema pallidum
• Clinique :
– Syphilis Iaire : chancre + ADP satellite
– Syphilis IIaire : manifestations cutanées
– Syphilis IIIaire : gommes syphilitiques, atteinte neuro-méningée,
cardio-vasculaire, viscérale
• Diagnostic direct
– Non cultivable
– Examen direct : microscope à fond noir
– Examen IFD.
• Sérologie
 Dépistage:
– un test tréponémique et un test non tréponémique
• Si dépistage+ : titrage

56. Treponema pallidum
• Tests non tréponémiques : Ac anti cardiolipides = marqueurs d’évolutivité
– VDRL (1)
– RPR
• Tests tréponémiques
– TPHA (1:80)
– FTA (1:200 ou 1:5 si absorption préalable)
• Non automatisable mais permet détection séparée IgM et IgG
• Confirmation de toute discordance entre test tréponémique et non
tréponémique
– ELISA
• Détection séparée IgM et IgG
• Pas de quantification
– Chimioluminescence
• Détection séparée IgM et IgG
• Pas de quantification.
- TPI: Test d’immobilisation des tréponèmes.

57. 57
Treponema pallidum

58. Réactions à antigène non tréponémique :
VDRL (Veneral Disease Reagent Laboratory).
 Principe: agglutination passive avec un antigène cardiolipidique d’origine
animale commun avec T. pallidum = microcristaux de cholestérol sur
lesquels sont adsorbés les molécules de cardiolipide, c’est l’haptène de
wasserman.
 Des particules de charbon sont piégées dans la combinaison pour faciliter
la lecture.
 Les résultats sont rendus en croix (de 1 à 4) en fonction de l'intensité de la
réaction.
 Titrage effectué par dilutions du sérum de raison 2.
58
Treponema pallidum

59. Cinétique des anticorps
• Le VDRL se positive après FTA et TPHA.
• C'est la première technique à se négativer après traitement:
bon marqueur de suivi de l’efficacité thérapeutique.
• Faux positifs : Grossesse , mononucléose Infectieuse,
collagénoses.
59
Treponema pallidum

60. B. Réactions à antigène tréponémique (TPHA, FTA, NELSON, ELISA)
1- TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay)
 Principe: hémagglutination passive d’hématies sensibilisées avec un
antigène extrait de T.pallidum.
 L’Ag utilisé est un lysat de T.pallidum adsorbé sur des hématies
 Résultat obtenu en 1-3 heures.
 Dépistage à la dilution du 1/80, puis titrage de raison 2 en cas de
positivité.
 Cinétique des anticorps: Le TPHA se positive vers 3-4ème semaine
après le début de l’infection (environ 1 semaine après l’apparition
du chancre). Reste le plus souvent positif chez un malade guéri.
60
Treponema pallidum

61. 2- FTA (Fluorescent Treponemal Antibody Test)
 Principe : immunofluorescence de T. pallidum fixés sur lame. Anticorps
détectés par antiglobuline marquée avec un fluorochrome.
 Dépistage au 1/200.
 Technique de confirmation en cas de dépistage positif.
 Sensibilité augmentée par adsorption des sérums par des tréponèmes
saprophytes non pathogènes (souche Reiter) : FTA-Abs.
 Cinétique des anticorps: Cinétique identique au TPHA avant traitement.
Se négative après traitement dans la majorité des cas.
61
Treponema pallidum

62. 3.Test immuno-enzymatique ou ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
• Principe: antigènes purifiés de T.pallidum, ou protéines recombinantes.
Les tests ELISA sont encore assez peu utilisés bien qu’ils aient l’avantage d’être
automatisables.
• Ils se positivent très précocement au cours de la syphilis (surtout les ELISA/IgM)
• mais en cas de positivité, le recours à d’autres tests, non tréponémiques
(VDRL/RPR) et tréponémiques (TPHA, FTA, éventuellement recherche des IgM),
s’avère nécessaire pour faire le diagnostic de confirmation.
• La présence d’IgM permet de confirmer le diagnostic de syphilis active. Cependant
l’absence d’IgM ne permet pas d’exclure ce diagnostic avec certitude.
• La recherche des IgM est particulièrement utile pour confirmer le diagnostic de
syphilis congénitale et de neurosyphilis.
62
Treponema pallidum

63. 4.Test d’immobilisation des tréponèmes (TPI) ou test de Nelson: technique
de référence, mais quasiment plus réalisé (entretien des animaux vivants
infectés).
 Principe: Anticorps spécifiques immobilisant (immobilisines) les
tréponèmes vivants, après addition de complément et en comparaison
avec un tube témoin.
 Résultats qualitatifs exprimés en pourcentage d’immobilisation spécifique.
 Cinétique des anticorps: immobilisines décelées en moyenne un mois
après l’apparition du chancre. Négativation chez la plupart des malades
après traitement.
63
Treponema pallidum

64. • D’autres tests de diagnostic de la syphilis sont également
disponibles sur le marché :
 tests rapides de dépistage = tests immunochromatographiques
 immunoblots.
64
Treponema pallidum

65. Treponema pallidum
• Difficultés d’interprétation
– Sensibilité des techniques varient en fonction du stade de la maladie
– Phase Iaire : sérologie – ou dissociée  à contrôler
– Phase IIaire : sérologie performante quelle que soit la technique
• Pr éviter faux - : tester 2 dilutions
– Phase IIIaire : négativation du VDRL possible
– Sans traitement
– Avec traitement :
• Précoce : négativation des tests
• Tardif : négativation VDRL, cicatrice sérologique pour autres tests.

66. 66
Interprétation de la sérologie de la syphilis

67. SÉROLOGIES INCERTAINES
67

68. Chlamydiae
• Bactéries à développement intracellulaire obligatoire
– Pénètrent dans les cellules sous forme de corps élémentaires
et forment inclusions cytoplasmiques caractéristiques
– Cultivables uniquement en culture cellulaire
• Infections spécifiques d’espèce et de sérovar
• Différentes techniques sérologiques utilisées
• Difficultés d’interprétation :
– Communautés antigéniques entre les 3 espèces
– Persistance AC => cicatrice sérologique ou infection évolutive?

69. Chlamydia trachomatis
• Infections basses  Diagnostic direct (pas de production d’Ac)
– Amplification génique sur échantillons prélevés au site de l’infection
• Diagnostic indirect : sérologie
– Infections hautes ou disséminées +++ (accès difficile au site
infectieux)
– + Ulcération génitale (LGV), bilan d’hypofertilité, arthrite
réactionnelle.
• Technique : ELISA  détection quantitative.

70. Chlamydia trachomatis
• Interprétation :
– Difficulté de dater l’infection :
• IgM : rarement positives chez l’adulte
– Mais ± présentes dans les pneumopathies du NN
• Persistance des AC => pas de suivi sérologique (en cas de
traitement)
– Cas de la LGV rectale (homosexuel) :
• Titres élevés IgG et IgA = argument diagnostique fort.

71. Chlamydophila pneumoniae
• Indication :
– Infection respiratoire basse ou haute communautaire,
atypique
• Diagnostic direct
– Culture cellulaire peu sensible et fastidieuse
– PCR : peu standardisée jusqu’à
PCR triplex « pneumopathies atypiques »
• Méthode de choix = sérologie
– Cinétique lente des AC
• Pic d’IgM en 30 jours et d’IgG en 60 jours
• Persistance des AC pendant plusieurs mois.

72. Chlamydophila psittaci
• Indication :
– Pneumopathie atypique avec contexte de contacts avec oiseaux
• Diagnostic direct
– Culture difficile en P3, PCR mise au point par le CNR
• Technique sérologique : IFI  détection quantitative IgG et IgM
• Interprétation :
– Se ⊕ tardivement => intérêt d’un 2ème sérum à distance.

73. Mycoplasma pneumoniae
• Indication :
– Pneumopathie atypique (+++ enfant et adulte jeune)
• Diagnostic direct
– Difficile
• Prélèvement doit contenir cellules
– Ecouvillonnage de gorge, aspiration naso-pharyngée, BB,
LBA
• Milieu de transport spécifique
– Culture lente, sur milieux complexes (non commercialisés)
– +++ PCR : sensible et précoce
• Triplex « pneumopathies atypiques »

74. Mycoplasma pneumoniae
• Techniques sérologiques
– ELISA  Détection séparée IgM et IgG
• Intérêt +++ pour IgM (résultat qualitatif)
– Apparition précoce et souvent présentes chez enfant
• Médiocre pour IgG : seuil de positivité variable et surtout trop bas.

75. Helicobacter pylori
• Indications
• Diagnostic dans situations où tests de diagnostic direct peuvent être négatifs
• Primo-infection
• Ulcère hémorragique
• Traitement récent par IPP ou antibiotique
• Charge bactérienne faible (atrophie gastrique, KC gastrique)
– Etudes épidémiologiques.

76. Helicobacter pylori
• Techniques sérologiques
– ELISA
• Interprétation
– Persistance des AC, même après traitement antibiotique efficace
• Pas utilisée pour le contrôle de l’éradication
– Ne permet pas de différencier une infection active d’une colonisation
asymptomatique
• Ne confirme pas l’existence d’une maladie gastro-intestinale
• Sérologie classée comme pertinente (grade A) chez l’enfant

77. Campylobacter spp.
• Diagnostic étiologique rétrospectif en cas de pathologie post-infectieuse
• Aucune utilité dans les infections aiguës digestives
– Diagnostic direct dans les selles (culture +++)
• Seul test commercialisé : réaction de fixation du complément
– Pas de distinction d’espèce
– Dosage des anticorps totaux
• Seuil de posivité ≥ 40

78. Salmonella spp.
• Diagnostic rétrospectif de la fièvre typhoïde et paratyphoïde
– Phase secondaire où hémocultures et coprocultures négatives
– Aucun intérêt dans les salmonelloses mineures
• Technique
– Agglutination en tube = test de Widal et Felix
• Recherche AC anti-H et anti-O de S. typhi et S. paratyphi A, B et C (TAB)
– Anti-O en 8 jours disparaissent rapidement ≠ anti-H en 10 jours persistent des années
• Sérologie abandonnée
• Manque de
• Sensibilité → Période d’incubation, pro-zone
• Spécificité → Agglutinines hétérologues (réaction anamnestique), S.
mineures
=> Privilégier le diagnostic direct

79. • Le sérodiagnostic de WIDAL et FELIX permet de détecter la présence dans
le sang d'anticorps dirigés contre les constituants des Salmonella (Typhi,
para A, para B et para C .
• Recherche les anticorps dirigés contre les Ag somatiques et flagellaires H.
• C’est une technique d’agglutination en tubes
• Réaction croisée entre BO et TO (Ag commun)
• le principe du sérodiagnostic de Widal est la recherche des agglutinines O
et H:
– Les anticorps anti-O apparaissent vers le 7-8e jour, atteignent leur
maximum vers le 14e jour, restent ensuite en plateau jusqu'à la 4e
semaine puis disparaissent rapidement. Ils n'atteignent jamais un
taux plus élevé que 1/200e à 1/400e.
– Les anticorps anti-H apparaissent vers le 10e jour, montent
rapidement pour atteindre un maximum de 1/800e à 1/1600e vers le
14e jour, restent en plateau jusqu'à la 4e semaine et diminuent
ensuite. Mais à l'inverse des anticorps anti O, ils ne disparaissent pas
complètement. Ils persistent toute la vie à un taux de l'ordre de
1/200e.
79
Salmonella spp.

80. • L'interprétation des résultats du sérodiagnostic peut être délicate :
– Si un sujet atteint de fièvre typhoïde reçoit des antibiotiques très
précocément, les anticorps anti-O peuvent ne pas apparaître et les anticorps
anti-H n'atteindre qu'un taux faible. Parfois, ni les anticorps anti-O ni les
anticorps anti-H n'apparaissent.
– Chez certains sujets atteints de fièvre typhoïde véritable et qui n'ont pas été
traités précocement, les anticorps anti-O et anti-H peuvent ne pas apparaître.
– La sensibilité de la méthode est médiocre:10 à 30%
– Des récidives de fièvre typhoïde peuvent s'observer même chez des sujets
porteurs de taux élevés d'anticorps anti-O et anti-H (la présence d'anticorps
n'assure pas toujours l'immunité).
– La vaccination par le vaccin TAB (antityphoïde et antiparatyphoïde A et B)
laisse persister des anticorps anti TH, AH et BH.
• - La spécificité est mauvaise du fait de l'existence de réactions croisées avec
d'autres infections ou certaines maladies inflammatoires.
80
Salmonella spp.

81. Yersinia spp.
• Indications :
– Diagnostic étiologique rétrospectif en cas de pathologie post-infectieuse
Erythème noueux
• Aucune utilité dans les infections aiguës digestives
– Diagnostic direct dans les selles (culture +++)
• Techniques utilisées
– Agglutination
• Dépistage, si ⊕ : titrage des AC
• Réactions croisées : Y.enterolitica O3, O5, O9 et Y.pseudotuberculosis
avec F. tularensis, Brucella spp
– Western blot

82. Corynebacterium diphtheriae
• Contrôle vaccinal
• Techniques : → AC anti-toxine diphtérique
– ELISA
• Titre protecteur : ≥ 0,1 UI/ml (critère OMS)
• Réalisée au LNR (IPA)

83. Clostridium tetani
• Indications
– Contrôle vaccinal (plaie souillée)
– Contrôle du fonctionnement immunitaire (post-greffe ou chimio)
• Techniques : → AC anti-toxine tétanique
– ELISA (IgG)
– Référence : neutralisation de la toxine in vivo chez la souris
– TDR : immunochromatographie
• Réponse qualitative, excellente spécificité (98%)
• Utilisable dans l’urgence
• Titre protecteur : ≥ 0,1 UI/ml (critère OMS)

84. Streptococcus pneumoniae
• Exploration de déficit immunitaire
– Patient vacciné avec vaccin 23-valent et faisant une infection
pneumococcique
– Pas contrôle vaccinal (pas de seuil protecteur)
• Technique : ELISA
– Dosage global des IgG dirigées contre les 23 antigènes capsulaires contenus
dans le vaccin polysaccharidique

85. SÉROLOGIES INUTILES
• Neisseria gonorrhoeae Bordetella pertussis
• Mycoplasmes génitaux Listeria monocytogenes
• Shigella spp. Haemophilus influenzae
• Klebsiella spp. Streptocoques
• Pasteurella spp. Staphylocoques
• Mycobactéries
Sérologie inutile!
→ Diagnostic par recherche directe de la bactérie
→ Mauvaises performances des techniques sérologiques disponibles

86. • Les streptolysines O et S sont des hémolysines dont l'effet est observé in vitro sur
gélose au sang (hémolyse ß).
• Ce sont aussi des facteurs de pathogénicité. In vivo, la streptolysine O suscite la
formation d'anticorps antistreptolysine O (ASLO).
• L'élévation du taux d'antistreptolysine O dans les trois semaines qui suivent une
infection à S. pyogenes permet un diagnostic rétrospectif.
• L'élévation du taux des anticorps anti-streptococciques témoigne de la réaction
immunitaire post-streptococcique.
• Le taux normal est inférieur à 200 UI.
• Plus qu'un titre élevé, c'est surtout l'augmentation progressive du taux des ASLO
entre deux examens qui est évocatrice.
• 20% des streptocoques A ne produisent pas de streptolysine O, ce qui justifie la
recherche d'autres anticorps (anti-streptokinase, anti-D-nase).
86
Titrage ASLO

87. Titrage des ASLO
Technique
Dans un 1er temps, sont mis en présence :
 Des quantités connues et croissantes de SLO réparties dans les cupules
 Un volume constant du sérum à titrer.
• Si le sérum contient des Ac anti-SLO (ASLO), ils se fixent grâce à leurs
paratopes sur les épitopes spécifiques de la streptolysine et neutralisent
son activité : réaction de neutralisation de l’activité.
• Si le sérum ne contient pas d’Ac anti-SLO, la streptolysine n’est pas
neutralisée.
Dans un second temps, pour révéler la réaction, on ajoute des globules
rouges de lapin (cibles de la SLO). Après incubation :
– S’il y a hémolyse : la SLO est active, elle n’a donc pas été neutralisée.
Le sérum ne contient pas d’ASLO
– S’il n’y a pas d’hémolyse : la SLO a été neutralisée par les ASLO
présents dans le sérum.
87

88. Titrage ASLO
88
Positif Négatif

89. Conclusion
• Le diagnostic indirect des infections bactériennes n’est utile que dans le
cas où le diagnostic direct est difficile ou impossible.
• Il n’a pas la valeur du diagnostic direct.
• Il est souvent difficile à interpréter.
• Il est parfois nécessaire de combiner plusieurs techniques pour une
meilleure interprétation.
• Il est souvent nécessaire de répéter les prélèvements.
• Il tend à être remplacé par les techniques de biologie moléculaire.
89