TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ
•0 recomendaciones•295 vistas
Denunciar
Compartir
Descargar para leer sin conexión
Recomendados
Más contenido relacionado
La actualidad más candente
La actualidad más candente(20)
Destacado
Destacado(20)
Similar a TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ
Similar a TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ(20)
TOKA-ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΤΥΧΙΑΚΗΣ
- 1. Ο ρόλος της HDL στα μονοπάτια μετάστασης καρκίνου στα οστά Τμήμα Βιολογίας Τόκα Ελπίδα Εργαστήριο Ανατομίας-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας, Ιατρική σχολή Πανεπιστημίου Πατρών
- 2. Οστίτης Ιστός Σημασία οστών Στήριξη και μορφή σώματος Προστασία εσωτερικών οργάνων Κίνηση (μύες & τένοντες) Αιμοποίηση Αποθήκευση ανόργανων συστατικών Αντίληψη ερεθισμάτων Εξειδικευμένη μορφή συνδετικού ιστού που χαρακτηρίζεται από σκληρή εξωκυττάρια ουσία. Δομή μακρού οστού • Επίφυση • Μετάφυση • Διάφυση
- 3. Φυσιολογία οστίτη ιστού Τύποι οστίτη ιστού • Σπογγώδες οστό: ελαφρύ με μορφή σπόγγου. Στις κοιλότητες μεταξύ των οστικών δοκίδων υπάρχει ο ερυθρός μυελός των οστών. • Συμπαγές οστό: ιδιαίτερα πυκνό και ομοιογενές. Διατρέχεται από τους πόρους των συστημάτων του Havers. Παρουσιάζει τρείς επιφάνειες: i) Περιοστική, ii)Ενδοστική, iii) Επιφάνειες των πόρων του Havers Σύνθεση οστίτη ιστού Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Κύτταρα οστίτη ιστού Οργανική Ανόργανη Κολλαγόνο Μη κολλαγόνες πρωτεΐνες Υδροξυαπατίτης Άλλα ιόντα • Ερυθρός μυελός: στις επιφύσεις των μακρών οστών και στα επίπεδα οστά. Αποτελείται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. • Ωχρός μυελός: στη μυελική κοιλότητα της διάφυσης των μακρών οστών. Αποτελείται κυρίως από λιποκύτταρα. • Στρώμα του ΜΟ: Αποτελείται από πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα Μυελός των οστών (ΜΟ) (Uccelli et al., 2008; Bukett, 2006 )
- 4. Κύτταρα οστίτη ιστού Οστεοκύτταρα Επενδυτικά κύτταραΟστεοβλάστες • Βρίσκονται στις οστικές επιφάνειες • Μεγάλα κύτταρα με έκκεντρο πυρήνα • Κυβοειδές/ κυλινδρικό σχήμα • Συνθέτουν νέο οστό (οργανική & ανόργανη ουσία) Οστεοκλάστες … • Σε οστικές επιφάνειες • Εμπύρηνα με επίπεδο σχήμα • Χαμηλή μεταβολική δραστηριότητα • Προστατεύουν από οστεολυτική δράση των οστεοκλαστών • Εντός βοθρίων οστεοειδούς • Σφηνοειδές σχήμα με αποφυάδες • Δεν πολλαπλασιάζονται • Ελέγχουν ανάπτυξη οστών i) αξιολογόντας τη σύσταση του εξωκυττάριου υγρού ii)αξιολογόντας ηλεκτρικά & μηχανικά ερεθίσματα (Papachristou et al., 2014; Junqueira and Carneiro, 2004).
- 5. • Πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα • Κυτταρική μεμβράνη με πτυχωτή μορφή • Προέρχονται από σύντηξη μακροφάγων • Έντονη παραγωγική δραστηριότητα • Έκκριση υδρολυτικών ενζύμων και Η+ • Απορρόφηση οστού ( η λύση της θεμέλιας ουσίας των οστών και η απόδοση ασβεστίου στην κυκλοφορία του αίματος, συμβάλει στην επιδιόρθωση των δομικών ατελειών και μικροβλαβών του οστού). Οστική ανακατασκευή Διαδικασία διαδοχικής απορρόφησης και παραγωγής οστίτη ιστού με σκοπό τη συντήρηση και ανανέωση του οστού. (Garg AK 2010) Οστεοκλάστες Φάση ηρεμίας Φάση απορρόφησης Φάση κυτταρικής αναστροφής Φάση οστικής παραγωγής Οστεοποίηση
- 6. Καρκίνος Γενετική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολ/σμό κυττάρων εξαιτίας μεταλλάξεων σε γονίδια που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Μετάσταση πρωτο-ογκογονίδια ογκοκατασταλτικά γονίδια επιδιορθωτικά γονίδια cisncancer.org (Yokota, 2000) Seed & Soil theory Η εξάπλωση ενός καρκινικού όγκου και σε άλλους ιστούς πέρα από τον αρχικό. 1.Αγγειογένεση 2.Αποκόλληση 3.Διήθηση 4.Κυκλοφορία 5.Προσκόλληση 6.Εξαγγείωση 7.Πολλαπλασιασμός (Paget, 1989) (Bendas and Borsig, 2012)
- 7. Οστικές μεταστάσεις • σπονδυλική στήλη • κρανίο • πλευρές • οστά του ισχίου • βραχιόνιο οστό • μηριαίο οστό Οστικές μεταστάσεις Οστεολυτική μορφή Ενδιάμεση μορφή Οστεοβλαστική μορφή cancer hotspot (Rubens & Mundy, 2000) Περιοχή του οστού με καρκίνο, ο οποίος έχει προέλθει από άλλο ιστό. (Papachristou et al., 2010) Οστεοβλαστική μετάσταση Οστεολυτική μετάσταση
- 8. CXCR4 – (CXCL12, MIF, Ubiquitin) Μονοπάτια οστικών μεταστάσεων CXCL12 – (CXCR4, CXCR7) CXCL12 MIF CXCR4 CXCR4/CXCR7 dimer β-arrestin G-protein MAPK ↑ Επιβίωση ↑ Πολ/σμος ↑ Χημειοταξία Ανακύκλωση της CXCL12 PI3K Akt GRK G-protein έκφραση σε καρκινικά κύτταρα. (Dubrovska et al., 2013; Muller et al., 2001; Hopman & DiPersio, 2014 ; Chatterjee et al., 2014; Jung et al., 2014; Sun et al., 2010) Διάδοση και ρύθμιση των μεταστάσεων συμπαγών όγκων (Lai et al., 2014) σε ποσοστό μεγαλύτερο του 75% όλων των καρκίνων. Ανάπτυξη- Διήθηση- Αγγειογένεση Στον ΜΟ εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες. Υπεύθυνη για στρατολόγηση HSCs έκφραση σε περιοχές μετάστασης. Άξονας CXCL12/CXCR4 υπεύθυνος για την εγκατάσταση των HSCs στον ΜΟ. Προσκόλληση- Επιβίωση- Πολ/σμος
- 9. ANXA2 (CXCL12) CXCR6–(CXCL16 διαμεμβρανική/ διαλυτή) Μονοπάτια οστικών μεταστάσεων (συνέχεια…) Στον ΜΟ εντοπίζεται στην επιφάνεια των οστεοβλαστών. Παράγοντας προσκόλλησης κυττάρων σε ΜΟ. Άγκυρα για HSCs και CXCL12. έκφραση σε πολλούς τύπους καρκίνου Προσκόλληση- Διήθηση- Πολαπλασιασμος- Αγγειογενεση. (Bao et al., 2009; Havens et al., 2009 ). έκφραση σε μεταστάσεις ενώ έκφραση πρωτοπαθείς όγκους. CXCR6/CXCL16 (διαλυτή): πολ/σμος και μετανάστευση καρκινικών κυττάρων. Συνδέεται με βαθμό κακοήθειας & επιθετικότητα καρκίνου. Διήθηση- Πολαπλασιασμος- Αγγειογενεση (Meijer et al., 2008, Lu et al., 2008, Wang et al., 2008).
- 10. Λιπίδια Λιποπρωτεΐνες Υδρόφοβα μόρια με υψηλή βιολογική αξία. Λιπίδια (φωσφολιπίδια, χοληστερόλη, τριγλυκερίδια κ.α.) Απολιποπρωτεΐνες (apoA, apoB, apoC, apoD, apoE) Κατηγορίες λιποπρωτεϊνών • Χυλομικρά (chylomicrons, CM) • Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (VLDL) • Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (IDL) • Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (LDL) • Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL) (Karlson, Doenecke & Koolman, 1998)(Ridker,2014) (Ridker, 2014)
- 11. HDL Μικρό μέγεθος Υψηλή περιεκτικότητα σε απολιποπρωτεΐνες (κυρίως apoA) Ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης (περιφερειακοί ιστοί ήπαρ) (Murray et al., 2011). Βιοσύνθεση HDL 1. Έκκριση apoA1 από λεπτό έντερο & ήπαρ 2. Λιπιδίωση HDL Αρτιγενής HDL 3. Εστεροποίηση της FC από την LCAT 4. Μετανάστευση CE στο εσωτερικό της HDL ώριμη HDL http://www.shrinkinguy.com/ Σημασία απολιποπρωτεΐνης apoA . 1. Αντιοξειδωτική δράση (α) απομακρύνει την χοληστερόλη (β) εμποδίζει την οξείδωση της LDL 2. Αντιθρομβωτική δράση 3. Αντιφλεγμονώδης δράση 4. Προάγει την παραγωγή ενδοθηλιακού νιτρικού οξέος (Rader, 2006) (Rader, 2006)
- 12. Υλικά και μέθοδοι RNA extraction cDNA synthesis RT-PCR ANXA2 CXCL12 CXCR4 CXCR6 Ολικά κύτταρα μυελού των οστών http://curesearch.org/ http://www.criver.com/http://www.taconic.com/
- 13. Υλικά • Ισοφλουράνη • 70% αιθανόλη • PBS pH 7.4 • φορμόλη 10% • Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml 1. Χειρισμός ζωικών προτύπων… 2. Λήψη & λύση ολικών κυττάρων ΜΟ… Υλικά • Καλλιεργητικό υλικό (MEM-A + 10% FBS) • Lysing Buffer (555899, BD Biosciences) • σύριγγα με βελόνα μεγέθους 26G Kyung et al., 2008 Cell lysis Αναισθησία με ισοφλουράνη Μέτρηση σωματικού βάρους Θυσίες & λήψη μηριαίων οστών
- 14. Υλικά • NucleoSpin RNA kit (740955.50,Macherey-Nagel) • αιθανόλη 70% & 96-100% • Ολικά κύτταρα μυελού των οστών 3. Απομόνωση RNA & ποσοτικοποίηση… 4. Σύνθεση cDNA… Υλικά • Ολικό RNA (απομονώθηκε) • Oligo dT Primer (50 μM) • dNTP Mixture (10 mM each) • RNase free H2O • PrimeScript RTase (200 U/μl) • PrimeScript Buffer • RNase Inhibitor (40 U/μl) 1. Επώαση Primer Mix στους 65 oC για 5min. 2. Eπώαση Master Mix : i) 30 oC για 10 min ii) 42 oC για 30-60 min iii) 96 oC για 5 min Primer Mix Master Mix Ποσοτικοποίηση: Υπολογισμός της συγκέντρωσης RNA με νόμο Lambert-Beer (C=A*ε*df ), ύστερα από φωτομέτρηση με Nanodrop.
- 15. Υλικά KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit (KK4601, Kapa Bioststems): • SyBrGr (10 μl) • ROX Low (0,4 μl) Εκκινητές: • Primer F (0,4 μl) • Primer R (0,4 μl) Γενετικό υλικό: cDNA* (1μl) Γονίδιο αναφοράς: GAPDH (1μl) RNase-free H2O 7,8 μl Taq πολυμεράση 5. RT- PCR… 6. Ποσοτικοποίηση & Στατιστική ανάλυση Στατιστική ανάλυση με χρήση λογισμικού GraphPad Prism® : Student test ( , SD) Μέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης με τη χρήση του γονιδίου αναφοράς GAPDH. ― Σύγκριση τιμών CT.
- 16. Αποτελέσματα_1 ANXA2 mRNA quantity in whole BM cells Ο μέσος όρος έκφρασης του mRNA για το γονίδιο ANXA2 παρουσιάζει μια σημαντική μείωση (p=0.01) στην ομάδα των ApoA-I deficient μυών συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα σχετικής έκφρασης στην ομάδα ελέγχου. Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες.
- 17. Αποτελέσματα_2 Ο μέσος όρος έκφρασης του mRNA για το γονίδιο CXCL12 παρουσιάζει μια σημαντική μείωση (p=0.0001) στην ομάδα των ApoA-I deficient μυών συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα σχετικής έκφρασης στην ομάδα ελέγχου. Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες. CXCL12 mRNA quantity in whole BM cells
- 18. Αποτελέσματα_3 Ο μέσος όρος έκφρασης του mRNA για το γονίδιο CXCR4 παρουσιάζει αύξηση (p=0.216) στην ομάδα των ApoA-I deficient μυών συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα σχετικής έκφρασης στην ομάδα ελέγχου. Παρόλα αυτά, η αύξηση αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική. Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες. CXCR4 mRNA quantity in whole BM cells
- 19. Αποτελέσματα_4 Ο μέσος όρος έκφρασης του mRNA για το γονίδιο CXCR6 παρουσιάζει σημαντική αύξηση (p=0.03) στην ομάδα των ApoA-I deficient μυών συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα σχετικής έκφρασης στην ομάδα ελέγχου. Η ποσοτικοποίηση έγινε με βάση τα αντίστοιχα επίπεδα του γονιδίου αναφοράς GAPDH και για τις δυο ομάδες. CXCR6 mRNA quantity in whole BM cells
- 20. Ερμηνεία αποτελεσμάτων (Blair et al, 2016) (Jung et al., 2015; Havens et al., 2009 ) (Ren et al., 2015 ; Dubrovska et al., 2013 ; Kholodenko, 2006;) (Wang et al., 2008 ; Hu et al, 2008; Nakayama et al., 2003)
- 21. Συμπεράσματα Λιποκύτταρα σε ΜΟ (Blair et al., 2016) ΑΝΧΑ2 CXCL12 Μεταβολές στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών apoA1 Τα οστά αποτελούν έναν από τους πλέον κοινούς τόπους μετάστασης. Το μικροπεριβάλλον των οστών ευνοεί την εγκατάσταση καρκινικών κυττάρων. Η HDL επηρεάζει τη φυσιολογία του ΜΟ. CXCR6 CXCR6 CXCR4 αδυναμία εγκατάστασης των καρκινικών κυττάρων στο μυελό των οστών ευνοεί την διαφοροποίηση και κινητοποίηση των HSCs προς την περιφέρεια Τροποποίηση των καρκινικών κυττάρων στον ΜΟ με αποτέλεσμα την αύξηση της ικανότητάς τους να δώσουν μεταστάσεις σε άλλους ιστούς. (Ren et al., 2015) (θετική ανατροφοδότηση) Η apoA1 εμπλέκεται στην ρύθμιση του μικροπεριβάλλοντος του ΜΟ και η έλλειψή της ευνοεί την κινητοποίηση των HSCs και πιθανόν των καρκινικών κυττάρων από τον ΜΟ προς τη περιφέρεια.
- 22. Μελλοντικοί στόχοι Έλεγχος έκφρασης της χημειοκίνης CXCL16 σε κύτταρα ολικού ΜΟ apoA1 deficient ποντικών Έλεγχος έκφρασης των μορίων CXCL12, CXCR4, ANXA2 και CXCR6 σε ποντίκια που πάσχουν από καρκίνο. Έλεγχος έκφρασης της apoA1 σε ποντίκια που παρουσιάζουν οστικές μεταστάσεις.
- 23. Ευχαριστώ!
Notas del editor
- Ο οστίτης ιστός αποτελεί μία εξειδικευμένη μορφή συνδετικού ιστού με ιδιαίτερα σκληρή εξωκυττάρια ουσία που . Χαρακτηρίζεται από έντονη ακαμψία γεγονός που του επιτρέπει να στηρίζει το σώμα προσδίδοντάς του συγκεκριμένη μορφή, και να προστατεύει τα εσωτερικά ζωτικά όργανα. Με τη βοήθεια των μυών και των τενόντων που προσφύονται σε αυτόν γίνεται δυνατή η κίνηση ενώ,
- Περιοστική: χωρίζει την εξωτερική επιφάνεια του οστού από τα όργανα που το περιβάλλουν και καλύπτεται από το περιόστεο. Ενδοστική: χωρίζει τον οστίτη ιστό από το περιεχόμενο του αυλού του μακρού οστού. Επιφάνειες των πόρων του Havers: βρίσκονται μέσα στο φλοιό του οστού.
- Τα κύτταρα του οστίτη ιστού είναι οι οστεοβλάστες, τα επενδυτικά κύτταρα, τα οστεοκύτταρα και οι οστεοκλάστες. Τα τρία πρώτα είδη κυττάρων προέρχονται από διαφοροποίηση των MSCs. Πρώτο στάδιο της διαφοροποίησης είναι οι οστεοβλάστες. Οι οστεοβλάστες είναι μεγάλα κύτταρα που φέρουν έκκεντρο πυρήνα. Αρχικά έχουν κυβοειδές ή κυλινδρικό σχήμα και έντονη μεταβολική δραστηρίοτητα. Κύρια λειτουργία τους έιναι η σύνθεση νέου οστού παράγοντας οργανική και ανόργανη ουσία. Σταδιακά η παραγωγική τους ικανότητα εξασθενεί και τότε μετατρέπονται είτε σε επενδυτικά κύτταρα είτε σε οστεοκύτταρα.
- Η οστική ανακατασκευή είναι μία διαδικασία που ανανέωσης και συντήρησης των οστών. Επιτυγχάνεται χάρη στην διαδοχική και ισορροπημένη δράση των οστεοκλαστών και των οστεοβλαστών, με τους πρώτους να απορροφούν το οστό και τους δεύτερους να συνθέτουν οστίτη ιστό. Χωρίζεται σε 6 φάσεις: 1. την κατάσταση ηρεμίας, 2. τη φάση ενεργοποίησης των οστεοκλαστών, 3. Τη φάση οστικής απορρόφησης, 4. Τη φάση κυτταρικής αναστροφής, 5. τη φάση οστικής παραγωγής και τέλος πραγματοποιείται η οστεοποίηση
- Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 2 ομάδες ποντικών, τα apoA1 deficient και ποντίκια άγριου τύπου. Ύστερα από εκτροφή 8 μηνών έλαβαν χώρα θυσίες σύμφωνα με τις οδηγίες τις Ε.Ε. Στη συνέχεια λήφθηκαν τα μηριαία οστά από τα οποία απομονώθηκαν τα ολικά κύτταρα του ΜΟ. Από τα κύτταρα αυτά αρχικά απομονώθηκε το ολικό RNA και ακολούθησε σύνθεση cDNA. Στη συνέχεια έγινε πολλαπλασιασμός του cDNA με τη μέθοδο της RT-PCR για τα γονίδια ANXA2, CXCL12, CXCR4 και CXCR6. Ακολούθησε η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων.
- Πιο αναλυτικά… Αρχικά χρησιμοποιήσαμε θήκες mouse restrainer για να μετρήσουμε το σωματικό βάρος των ποντικών. Εφόσον το βάρος τους ήταν παραπλήσιο και φυσιολογικό, προχωρήσαμε στην αναισθησία τους με τη χρήση ισοφλουράνης. Ακολούθησαν ευθανασίες των ζωικών προτύπων με την εγκεκριμένη μέθοδο της σπονδυλικής μετατόπισης σε αναίσθητο ζώο. Στη συνέχεια λάβαμε τα μηριαία οστά από τα οποία αφαιρέσαμε τις επιφύσεις με νυστέρι. Για την απομόνωση των ολικών κυττάρων του ΜΟ χρησιμοποιήσαμε σύριγγα με λεπτή βελόνα και καλλιεργητικό υλικό. Με το καλλιεργητικό υλικό και εξωθήσαμε τα κύτταρα του ΜΟ τα οποίο συλλέχθηκαν σε σωληνάκι eppendorf. Στο σωληνάκι προσθέσαμε Lysis Buffer και με τη χρήση της λεπτής βελόνας (0.9mm) ασκήσαμε μηχανική πίεση στα κύτταρα για να επιταχύνουμε τη λύση τους. .
- Για να απομονώσουμε το ολικό RNA από τα κύτταρα του ΜΟ χρησιμοποιήσαμε το NucleoSpin RNA kit. Αρχικά προσθέσαμε διάλυμα λύσης των κυττάρων ενώ επιταχύναμε τη διαδικασία χρησιμοποιώντας βελόνα 0.9mm με την οποία ασκήσαμε μηχανική πίεση. Στη συνέχεια απομακρύναμε τις μεμβράνες φυγοκεντρώντας σε ειδικό σωληνάκι με φίλτρο. Ακολούθησε νέα φυγοκέντρηση σε σωληνάκι με RNA στήλη η οποία συγκρατεί το RNA. Έγινε ξέπλυμα της στήλης φυγοκέντρησης αρκετές φορές και τέλος με φυγοκέντρηση συλλέξαμε το RNA σε νέο σωληνάκι. Η ποσοτικοποίηση του RNA έγινε με τη χρήση του νόμου Lambert-Beer ύστερα από φωτομέτρηση στα 260 και 280nm. Για τη σύνθεση του cDNA αρχικά επωάσαμε το ολικό RNA που απομονώσαμε μέσα σε Primer Mix στους 65 βαθ για 5 λεπτα. Στη συνέχεια ακολούθησαν διαδοχικές επωάσεις σε διαφορετικές θερμοκρασίες ενώ είχαμε προσθέσει τo Master Mix που περιέχει και το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση.
- Η RT-PCR είναι μία μοριακή μέθοδος που επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό μίας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA ή cDNA σε πολλά αντίγραφα. Σε αντίθεση με τη συμβατική PCR επιτρέπει την παρακολούθηση της αντίδρασης σε κάθε κύκλο καθώς χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές. Για τον πολλαπλασιασμό των cDNAs που λάβαμε, χρησιμοποιήσαμε το KAPA SYBR FAST kit. Η χρωστική που χρησιμοποιεί το συγκεκριμένο kit έιναι η SYBR Green η οποία παραμβάλεται μεταξύ των ελίκων του cDNA και δίνουν έντονο φθορισμό. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήσαμε το GAPDH . Η μέθοδος που ακολουθήσαμε περιελάμβανε την σχεδιαση της μικροπλάκας, τη δημιουργία ΜΜ και στη συνέχεια τη πλήρωση της μικροπλακας συμφωνα με τον πινακα. Οι συνθήκες της PCR ήταν αυτές που φαίνονται εδώ. Μεχρι την εναρξη της PCR παγος και σκοτάδι. Τιμη CT Τα δείγματα προς ανάλυση παρακολουθούνται με την βοήθεια αυτοματοποιημένου μηχανήματος ειδικού για την Real time PCR που είναι συνδεδεμένο με υπολογιστή. Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα της αρχικής αλληλουχίας DNA στο κάθε δείγμα τόσο νωρίτερα θα εμφανιστεί η τιμή Ct (threshold cycle). για κάθε δείγμα, (Wong et al, 2005). Η τιμή Ct είναι μία παράμετρος, απαραίτητη για την ποσοτικοποίηση. Πρόκειται για τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης ενίσχυσης που απαιτούνται ώστε η τιμή του παρατηρούμενου φθορισμού να προσεγγίζει ένα συγκεκριμένο όριο (threshold). Η τιμή του ορίου αυτού ορίζεται πάνω από την αντίστοιχη του μη-ειδικού σήματος (background). Η τιμή Ct είναι αντιστρόφως ανάλογη της αρχικής ποσότητας του υποστρώματος (Bustin et al., 2005; Kubista et al., 2006).
- Η μειωμένη έκφραση της ANXA2 στα apoA1 def ποντίκια ήταν ένα αναμενόμενο αποτέλεσμα. Προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας έδειξαν πως τα apoA1 def ποντίκια εμφανίζουν σημαντική αύξηση των λιποκυττάρων στον ΜΟ σε βάρος των οστεοβλαστών. Η ΑΝΧΑ2 εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες γεγονός που δικαιολογεί την μειωμένη της έκφραση. Η ΑΝΧΑ2 αποτελεί άγκυρα για τη χημειοκίνη CXCL12. Αυτό σημαίνει ότι τα μειωμένα επίπεδα της ΑΝΧΑ2 είναι λογικό να οδηγούν σε μειωμένη έκφραση της χημειοκίνης CXCL12. Σύμφωνα με μελέτες και άλλων ερευνητικών ομάδων, η έκφραση της CXCL12 ήταν μειωμένη σε κύτταρα του ΜΟ που δεν έφεραν τον γονίδιο της ΑΝΧΑ2. Αυτό δείχνει μία στενή αλληλεπίδραση μεταξύ της ΑΝΧΑ2 και της CXCl12. Η υψηλή έκφραση του υποδοχέα CXCR4 πιθανον να οφείλεται σε θετική ανατροφοδότηση. Λόγω της μειωμένης έκφραση του προσδέτη, οι υποδοχείς του κυττάρου για αυτόν αυξάνονται προκειμένου να αυξήσουν την επιτυχία πρόσδεσης. Ακόμα, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα που εισέρχονται στον ΜΟ τροποποιούνται με αποτέλεσμα να αυξάνεται η ικανότητά τους να πραγματοποιούν μεταστάσεις όχι στα ίδια τα οστά, αλλά σε άλλους ιστούς. Μελέτες που αφορούσαν τους άξονες CXCL12/CXCR4 και CXCL16/CXCR6 έδειξαν ότι οι έκφραση των δύο υποδοχέων είναι αρμονική σε περιπτώσεις καρκίνουν, δηλαδή παρουσιάζουν και οι δύο άυξηση.
- Είναι γνωστό ότι τα οστά αποτελούν έναν από τους πλεον κοινούς τόπους μετάστασης, με το μικροπεριβάλλον τους να ευνοεί την εγκατάσταση καρκινικών κυττάρων. Επίσης η HDL φαίνεται να επηρεάζει τη φυσιολογία του ΜΟ καθώς η έλλειψη της βασικής της απολιποπρωτεινης αποΑ1 προκαλέι μεταβολές στο μικροπεριβάλλον του.